BRPI0804652A2 - soro eqÜino antiveneno de abelha, mÉtodo de reconhecimento e processo de obtenÇço do mesmo - Google Patents

Abstract

SORO EQÜINO ANTIVENENO DE ABELHA, MÉTODO DE RECONHECIMENTO E PROCESSO DE OBTENÇçO DO MESMO. A presente invençâo refere-se a um novo soro eqúino antiveneno de abelha (Apis melilfera ssp.), o método de reconhecimento e seu respectivo processo de obtenção, utilizando, como antígeno, o veneno de Apís Meilifera ssp. integral.

Description

SORO EQÜINO ANTIVENENO DE ABELHA, MÉTODO DE RECONHECIMENTOE PROCESSO DE OBTENÇÃO DO MESMO

A presente invenção refere-se a um novo soroeqüino antiveneno de abelha {Apis mellifera ssp.), o método de reconhecimento e seu respectivo processo de obtenção,utilizando, como antígeno, o veneno de Apis Mellifera ssp.integral.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

No Brasil o gênero Apis, família Apidae,compreende as subespécies Apis mellifera mellifera, Apismellifera adansonni, Apis mellifera scutellata e Apismellifera ligustica (Sort; Gonçalves, 1994) e seushíbridos, sendo popularmente conhecidas como abelhasafricanizadas. Essas abelhas pertencem à fauna brasileiraprodutora de mel e foram trazidas de diversas localidades,tais como: Suíça, Itália, Rússia e África. As abelhashíbridas, cruzamento das abelhas de origem européia comafricanas, são encontradas em todo território brasileiro, ea sua presença se estende até à Argentina como também noArizona, Novo México, Califórnia e Nevada (Schumacher;Egen, 1995) .

Em seu conjunto, - os acidentes por ataque maciçode abelhas ainda são um sério problema de saúde pública noBrasil, contudo a falta de um estudo epidemiológico precisofaz com que existam poucas referências ao tratamentopreciso aos sintomas sistêmicos. Em 1985 a estimativa erade que as abelhas africanizadas teriam causado entre 700 a1.000 mortes (Taylor, 1986). Aproximadamente 2.462 casos deacidentes por ataque de abelha foram notificados no estado de São Paulo nos anos de 1993 a 1998 com um total de seteóbitos (Divisão de Zoonoses/CVE Secretaria da Saúde doEstado de São Paulo).

Apesar de apresentar apenas 0,38% de óbitos dosacidentes por ferroada de abelhas, devido aos hábitos destaespécie os ataques maciços são extremamente severos. Oveneno de Apis mellifera ssp. apresenta elevada toxicidadequando comparado a outros venenos da ordem Himenóptera;entretanto, sua toxicidade sistêmica está relacionada àcapacidade da abelha em inocular elevada quantidade deveneno devido a um ataque de 50 ou mais ferroadas. Asprincipais atividades biológicas do veneno de abelha sãoproteolítica, hemorrágica, mionecrótica, coagulante,edemaciante e hemolitica direta e indireta.

Há muito, o tratamento empregado nos acidentespor envenenamento de abelha são de suporte, principalmentea administração de antihistamínico, corticosteróides,broncodilatadores, vasodilatadores, bicarbonato, manitol,adrenalina e ventilação mecânica.

De acordo com os documentos US6649166B1 eUS6780416B1, foram requeridas composições farmacêuticascompostas a partir de proteínas e peptídeos de veneno deabelha previamente isolados ou sintetizados quimicamente. APatente US 6,649,166 descreve a produção de um peptídeonatural ou sintético que levará a dessensibilização dopaciente que tem alergia ao veneno de abelha. Na patente sedescreve todo o mecanismo de hipersensibilidade tipo I(alergia e choque anafilático) causado pelo veneno deabelha e modo de interação do peptídeo elaborado sobre ascélulas e receptores do sistema imunológico o qual leva adiminuição de IgE no soros do paciente. A Patente 6,649,166não reivindica a produção de nenhum fator neutralizante daatividade tóxica do veneno, apenas a dessensibilização doindivíduo alérgico ao veneno.

No estado da técnica não tem se apresentadosoros que tenham a capacidade de reconhecerem as toxinasque compõem o veneno total com alta eficiência desoroneutralização.

A eficiência no tratamento dos acidentes porenvenenamento por ferroada de abelha é determinada pelaespecificidade dos anticorpos presentes no soro antivenenoempregado, ou seja, pela capacidade desses reconhecerem astoxinas que compõem o veneno total. Apesar da eficácia dasoroterapia, a administração do soro pode determinardiferentes reações adversas como a hipersensibilidadeimediata observada em alguns casos, devida à presença deproteínas heterólogas no soro.

A produção de antiveneno de abelha em eqüinoscom altos títulos neutralizantes para a atividade tóxica,por muito tempo, foi ura desafio para o setor de produção desoros terapêuticos humanos.DESCRIÇÃO SUMÁRIA DA INVENÇÃO

O primeiro objeto da presente invenção consisteem um soro eqüino antiveneno de abelha (apis melliferassp.).

O soro da presente invenção é usado em todos oscasos que forem detectados intoxicação por veneno deabelha, independente de risco de morte ou não. Na prática,todas as vezes em que ocorrem acidentes com múltiplasferroadas de abelhas, as vítimas se tornam sujeitas aefeitos danosos (lesões a tecidos vitais) de curto oulonga prazo. Existem relatos de literatura de danos tardiosaos rins, fígado ou coração, em pessoas que foram vítimasdeste tipo de acidente (e não receberam soro antiveneno deabelhas), e que sobreviveram, porém apresentaram problemasde saúde relacionados a tais acidentes.

Um segundo objeto da presente invenção édeterminar um método de reconhecimento de elementos.

Um estudo original sobre a resposta deanticorpos neutralizantes contra o veneno de abelha dogênero Apis permitiu a identificação de diversas fraçõesque possuem atividade biológica e conseqüentemente algumasfrações podem apresentar atividade patogênica. Até oestudo das frações protéicas do veneno total de Apismellifera. ssp., e caracterização de suas propriedades, nãoera possível obterem-se soros heterólogos capazes deneutralizar suas toxinas de forma eficiente. O estudo dasfrações do veneno total, e subseqüente imunização decavalos, possibilitou a obtenção efetiva de sorosneutralizantes eficazes na proporção de 1:58, ou seja, 1parte de veneno para 58 partes de antiveneno, emmicrogramas, para estudo de soro neutralização em culturade células e inibição da atividade hemolítica, para usoterapêutico em humanos.

Um terceiro objeto da presente invenção é obterum processo de obtenção de soro eqüino antiveneno de abelha(apis mellifera ssp.).

O processo de obtenção de soro eqüinoantiveneno de abelha da presente invenção prevê, pelomenos, as seguintes etapas:

a) extração do veneno total de Apis melliferassp. manualmente ou por método automatizado;

b) imunização de cavalos utilizando o venenototal de Apis mellifera ssp. com as diversas fraçõesprotéicas; e

c) purificação de IgG total dos antissoros,através da mistura e processamento com ácido caprílico ououtro método por diferença de solubilidade e tratamentoenzimático por pepsina.

O processo de obtenção de soro eqüinoantiveneno de abelha (apis mellifera ssp.) da presenteinvenção, conforme o fluxograma da Figura 1 consiste-inicialmente na extração do veneno de abelha (Apismellifera ssp.) com suas frações protéicas (1).

Estas frações são caracterizadas utilizandocomo fase fixa (gel) esférica composta de dextran e agaroseligadas ao brometo de cianogênio para conjugação aoantiveneno de abelha e caracterização das frações a seremreconhecidas por cromatografia de afinidade. Como fasemóvel (eluente) utiliza-se solução tampão pH 2,8 ou soluçãotampão pH 10.0, sendo assim obtidas 3 frações distintasvisíveis no cromatograma após análise em UV a 280nm.

O veneno de abelha possui duas frações, uma comMr entre 14.000 - 97.000 e outra inferior a 5.000. O venenototal de Apis mellifera ssp. foi testado em cultura decélulas quanto a sua ação tóxica e também quanto a suaatividade hemolítica direta.

A imunização de cavalos é realizada utilizandose o veneno de Apis mellifera ssp. com diversas fraçõesprotéicas (2) , preferencialmente fosfolipase A2 (diversasisoformas), fosfatase ácida, hialuronidase, ProteínasAbundantes de Geléia Real (MRPJ)-9, Fatores de CrescimentoDerivados de Plaqueta (PDGF) e Fatores de CrescimentoEndotelial vascular (VEGF), melitina, MRJP-1, precursor demelitina, transferrina, alfa-glicosidase, MRJP-2 e MRJP-8.

A etapa de imunização (3) é realizada atravésde doses por via intramuscular em concentração preferencialde 2,5 mg/ml, particularmente em emulsão duplaágua/õleo/água acrescido do Bacilo de Calmet-Guerin (BCG)morto pelo calor, e a última dose na mesma concentração emsolução fisiológica tamponada pH 7,2.

As doses são administradas em intervalos de 15ou 5 dias e após 7 dias da última dose é realizada asangria de prova (4) para determinação do título deanticorpos neutralizantes do efeito citotóxico e inibidorde hemólise direta do veneno de Apis mellifera ssp. Somenteos cavalos com título superior a 1:10 (1 parte de venenopara 10 partes de antiveneno) são sangrados.

A purificação de IgG total dos antissoros (5) érealizada preferencialmente através da mistura eprocessamento çom ácido caprílico ou outro método pordiferença de solubilidade e tratamento enzimático dapepsina.

O antiveneno em questão deverá reconhecer pormétodo imunológico ("immunobloting 2D", ensaio

imunoenzimático, imunoeletroforese ou imunodifusão duplaradial) obrigatoriamente as seguintes frações:transferrinas, MRJP-2, MRJP-9, alfa-glicosidase, serino-quinase, cisteíno-protease, proteína similar à Kruppel,proteínas com domínio de dedo de zinco e proteínasrelacionadas ao PDGF e VEGF.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta um fluxograma com asetapas do processo de obtenção de soro eqüino antiveneno deabelha da presente invenção.

A Figura 2 apresenta um esquema dacromatografia de imunoafinidade em Sepharose 4B ativada comCNBr.

A Figura 3 apresenta um perfil protéico, emeletroforese 2-D, do veneno bruto dialisado na presença dosinibidores de protease EDTA, PMSF e Leupeptina.

A figura 4 apresenta um gel da fração nãoimunoreativa (eluída em pH 8,0) na faixa de pi 3 a 10,corado com CBB G-250 (3 00/zg de proteínas) .

A figura 5 apresenta um Gel da fraçãoimunoreativa eluída em pH ácido (2,8) - na faixa de pi 3 acorado com CBB G-250 (300/ig de proteínas).

A figura 6 apresenta um Gel da fraçãoimunoreativa eluída em pH básico (10,7) - na faixa de pi 3a 10, corado com CBB G-250 (3 00/ig de proteínas) .

A figura 7 apresenta um imagem do WB feito comsoro antiveneno de abelhas (11,6 mg de proteínas) , a partirde 200ug de proteínas de veneno total de abelhas dialisadoem gel SDS PAGE 12,5%(m/v) 7cm e pi 3 a 10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. PREPARO DE ANTÍGENO E IMUNIZAÇÃO DOS CAVALOS

1.1. De acordo com o boletim de imunização executado peloServiço de Imunologia do Butantan.

1.1.1. Verificar o número de cavalos a serem imunizados.

Exemplo: 11 cavalos

- acrescentar 2 0% sobre do número de cavalos, resultando em13 cavalos. Portanto o antígeno deverá ser preparado para13 cavalos

1.1.2. Verificar a quantidade individual de veneno a serinoculada para todas as doses, Exemplo: AS CONCENTRAÇÕES EO NÚMERO DE DOSES DESCRITOS PODEM VARIAR DEPENDENDO DATOXICIDADE DO VENENO.

Io dose-----7,5 mg em emulsão múltipla completa (EMC)

2o dose-----2,5 mg em emulsão múltipla incompleta (EMI)

3o dose-----2,5 mg em solução salina

4o dose-----2,5 mg em solução salina

Total de veneno = 15 mg

1.1.3. Multiplicar a quantidade total de veneno pelo númerode cavalos

Exemplo: 15 mg veneno x 34 cavalos = 510 mg

Portanto para todo o esquema de imunização com 34 cavalos,

utiliza-se 510 mg de veneno

1.2. Pesagem do veneno

1.2.1. Ligar a câmara de exaustão.

1.2.2. Pesar na balança analítica com o auxílio da espátulae do frasco de fundo chato, o quantitativo de veneno deacordo com a dosagem preparada.

1.2.3 Após a pesagem, transferir o veneno para umerlenmeyer; colocar a barra imantada e acrescentar asolução salina 0,85%, a fim de atingir uma concentraçãofinal delO mg/mL.

1.2.4. Dissolver o veneno na de salina 0,85%

Obs: O veneno de abelha deverá ser filtrado emmembrana de 0,22u de porosidade.

1.3. Preparo do antígeno

De acordo com o boletim de imunização preparar asolução:

1.3.1 Emulsão Múltipla Completa (EMC)O antígeno EMC é composto de:

- 25 % de solução salina 0,85% + solução de veneno

- 25 % de mistura oleosa marcol montanide (adjuvante ISA 50da Seppic®)

- 50 % de solução salina 0,85% + solução tween 80 a 2%

BCG (Bacilo de Calmett Guerin) é adicionado na concentração

de lmg/mL da mistura marcol montanide.

1.3.1.1. Cálculo: Imunização EMC para 34 cavalos

Exemplo: 10 mL de solução EMC contendo 7,5 mg de veneno

Multiplicar a quantidade de veneno a ser inoculado pelo

número de cavalos

7,5 mg x 34 = 255 mg

10 mg -► 1 mL

255 mg -► X

X = 25, 5 mL

Portanto, obter 25,5 mL de solução salina 0,85% de umasolução de veneno a lOmg/mL

Multiplicar o volume de solução EMC a ser inoculado pelo número de cavalos

10 mL x 34 = 340 mL antígeno EMC

Portanto em 340 mL de EMC teremos:85 mL de solução salina 0,85% + veneno = ( 59,5 mL desolução salina 0,85 % + 25,5 mL de solução de veneno)85 mL de solução Marcol Montanide170 mL de solução Yween 2%85 mg de BCG

1.3.2 Emulsão Múltipla Incompleta (EMI)

O antígeno EMI é composto de:- 25 % de solução salina 0,85% + solução de veneno

- 25 % de mistura oleosa marcol montanide (adjuvante ISA 50da Seppic®)

- 50 % de solução salina 0,85% + solução Tween 80 a 2%1.3.2.1. Cálculo: Imunização EMI para 34 cavalosExemplo: 10 mL de solução EMI contendo 2,5 mg de venenomultiplicar a quantidade de veneno a ser inoculado pelonúmero de cavalos

2,5 mg x 34 = 85 mg

10 mg -► 1 mL

85 mg -► X

X = 8, 5 mL

Portanto, obter 8,5 mL de solução salina 0,85% de umasolução de veneno a lOmg/mL

Multiplicar o volume de solução EMI a ser inoculada pelonúmero de cavalos

10 mL x 34 = 340 mL de antígeno EMIPortanto em 340 mL de EMI temos:

85 mL de solução salina 0,85% + veneno = (76,5 mL desolução salina 0,85 % + 8,5 mL de solução de veneno)85 mL de solução marcol montanide170 mL de solução entre 2%

1.3.3. Antígeno PBS (tampão fosfato salina)O antígeno PBS é composto de:solução PBS + solução de veneno

1.3.3.1.Cálculo: Imunização PBS para 34 cavalosExemplo: 10 mL de solução PBS contendo 2,5 mg de venenoMultiplicar a quantidade de veneno a ser inoculada pelonúmero de cavalos2,5 mg x 34 = 85 mg10 mg -► 1 mL

85 mg -► X

X = 8,5 mL

Portanto, obter 8,5 mL de solução salina 0,85% de umasolução de veneno a lOmg/mL

Multiplicar o volume de solução PBS a ser inoculada pelonúmero de cavalos

10 mL x 34 = 34 0 mL de antígeno PBS

Portanto em 34 0 mL de PBS teremos:

331,5 mL de solução PBS + 8,5 mL solução veneno

2. Preparo de Antígeno EMC

2.1 Medir na proveta 25,5 mL da solução de veneno ecompletar para (85mL) com solução salina 0,85%

2.2 Medir na proveta 85 mL de marcol montanide (ISA 50Seppic®) e transferir a solução para o becker. Em seguida,acrescentar o BCG.

2.3 Adicionar a solução de veneno (85mL) lentamente nobecker, homogeneizando com o emulsificador até a formaçãode uma emulsão branca, firme e estável, que pode serverificado depositando uma gota de emulsão com auxílio dobastão de vidro na superfície da água na placa de petri. Sea emulsão estiver satisfatória, a gota de emulsãopermanecerá integra na forma de um botão.

2.4 Uma vez formada a emulsão, acrescentar com o auxílio deuma proveta 170 mL de solução salina 0,85% + solução entre80 a 2% e homogeneizar o antígeno, utilizando oemulsificador.

2.5 Distribuir o antígeno nos frascos de vidro, devidamenteidentificados com o serviço, tipo de antígeno, turma, n° decavalos, o volume e a data.2.6 Acondicionar os frascos na caixa de isopor com geloreciclável, a temperatura de 2°C a 8°C, para ser usado naimunização.

3. Preparo de Antígeno EMI

3.1 Medir na proveta 25,5 mL da solução de veneno ecompletar para (85mL) com solução salina 0,85% .

3.2 Medir na proveta 85 mL de marcol montanide (ISA 50Seppic®) e transferir a solução para o becker.

3.3 Adicionar a solução de veneno (85mL) lentamente nobecker, homogeneizando com o emulsificador até a formaçãode uma emulsão branca, firme e estável, que pode serverificado depositando uma gota de emulsão com auxílio dobastão de vidro na superfície da água na placa de petri. Sea emulsão estiver satisfatória, a gota de emulsãopermanecerá integra na forma de um botão.

3.4 Uma vez formada a emulsão, acrescentar com o auxílio deuma proveta 170 mL de solução salina 0,85% + solução entre80 a 2% e homogeneizar o antígeno, utilizando oemulsificador.

3.5 Distribuir o antígeno nos frascos de vidro, devidamenteidentificados com o serviço, tipo de antígeno, turma, n° decavalos, o volume e a data.

3.6 Acondicionar os frascos na caixa de isopor com geloreciclável, a temperatura de 2°C a 8°C, para ser utilizadona imunização.

4. Preparo de Antígeno PBS

4.1. Medir na proveta 2 5,5 mL da solução de veneno ecompletar para 340mL com solução PBS 7.2, adicionar a barraimantada e colocar na chapa do agitador magnético.

4.2. Distribuir o antígeno nos frascos de vidro,devidamente identificados com o serviço, tipo de antigeno,turma, n° de cavalos, o volume e a data.

4.3. Acondicionar os frascos na caixa de isopor com geloreciclável, a temperatura de 2°C a 8°C, para ser utilizadona imunização.

5. Processo de Imunização de Eqüinos

São utilizados animais sadios pesando ao redor de 3 70a 4 00 quilos e negativos aos testes de anemia infecciosa.5.1. Esquemas de Imunização:

IMUNIZAÇÃO DE BASE

Io DIA 1,0 ml de E.M.C. contendo 0,lmg deveneno - Aplicar em 2 pontos (0,5ml/ponto), na tábua dopescoço lado esquerdo.4 o DIA 1,0 ml de E.M.C. contendo 0, lmg deveneno - Aplicar em 2 pontos (0,5ml/ponto), na tábua dopescoço lado direito.

19° DIA 2,0 ml de PBS contendo 0,2 mg de veneno -Aplicar em 4 pontos (0,5 ml/ponto), 2 pontos de cadalado da tábua do pescoço ao redor dos granulomas

23° DIA 4,0 ml de E.M.I. contendo 0,5 mg de veneno -Aplicar em 8 pontos (0,5ml/ponto) , 4 pontos de cadalado do dorso27° DIA 4,0 ml de PBS contendo 1,0 mg de veneno -Aplicar em 4 pontos (1,Oml/ponto) , 2 pontos de cadalado do dorso próximos dos granulomas.

30° DIA 4,0 ml de PBS contendo 2,5 mg de veneno -Aplicar em 4 pontos (1,Oml/ponto) , 2 pontos de cada

lado do dorso próximos dos granulomas + Sangria Exploradora34° DIA 4,0 ml de PBS contendo 5,0 mg de veneno -Aplicar em 4 pontos (1,Oml/ponto) , 2 pontos de cadalado do dorso próximo dos granuloma

38° DIA Sangria Exploradora39° DIA Ia Sangria41° DIA 2 a Sangria + Plasmaferese43° DIA 3a Sangria + Plasmaferese

REIMUNIZAÇÃO

1° DIA 10,0 ml de E.M.I. contendo 7,5 mg deveneno - Aplicar em 5 pontos (2, Oml/ponto) no dorso.

12° DIA 10,0 ml de Salina contendo 2,5 mg de veneno - Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso.

14° DIA 10,0 ml de Salina contendo 2,5 mg de veneno

- Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso.

16° DIA 10,0 ml de Salina contendo 2,5 mg de veneno

- Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso.22° DIA Sangria Exploradora

23° DIA Ia Sangria

26° DIA 2a Sangria + Plasmaferese

28° DIA 3a Sangria + Plasmaferese

6. Sangria:

São feitas 3 sangrias, cada uma equivalente a 2% dopeso do animal, em sangue total, com um período de 24 horasentre as sangrias. O sangue é recolhido por punção jugular,em bolsas (PVC atóxica) duplas, esterilizadas por radiaçãogama. A primeira bolsa que recebe o sangue é equipada com25 agulha, e contém solução anticoagulante (dextrose, citratode sódio e ácido cítrico).

7. Separação do plasma:

Imediatamente após a sangria, as bolsas são colocadasem câmara-fria, a 5°C (±1°C) e após 24 horas, o plasma é transferido para a segunda bolsa, que será enviada à Seçãode Processamento de Plasmas Hiperimunes.

8. Plasmaferese:

As hemácias que restam na bolsa de coleta de sanguesão ressuspensas com, aproximadamente, 1 (um) litro desolução salina apirogênica 0,85%, e reinfundidas no mesmocavalo doador (grupo sangüíneo homólogo) no processochamado plasmaferese.

9. Rendimento em plasma:

Em média, é obtido um rendimento de 65%, em relação aovolume de sangue extraído.

Nota: As sangrias e plasmaferese são feitasassepticamente, através de sistema fechado, impedindocontaminações bacterianas ou fúngicas no sangue e noplasma.

10. Plasma Individual

É o plasma obtido da sangria de um único animal.

11. Plasma a granel

É o plasma obtido através de mistura de dois ou maisplasmas individuais.

12. Soro Concentrado a Granel

Volume de soro obtido a partir do plasma a granel apóspurificação, digestão, tratamento por cromatografia,dessalinização, concentração e filtração esterilizante.

13 . Soro Concentrado Acabado a Granel

Soro concentrado a granel aprovado nos testes doServiço de Controle de Qualidade.

14 . Soro Produto Acabado a Granel

Preparação estéril de imunoglobulinas purificadas ediluídas, contidas em um ou mais recipientes, provenientesde um ou mais soros concentrados acabados a granel, decomposição uniforme e com características de qualidadeestabelecidas pelas normas técnicas de produção e controlede qualidade.

15. Preparo do Plasma a Granel

A partir de plasmas de bolsas estéreis é processado umúnico lote de plasma a granel, no mínimo de 100 litros e nomáximo de 3 00 litros. O número do lote é designado:inicialmente pela sigla "IB" e a seguir pela abreviação doserviço ao qual o cavalo foi imunizado, ex. : B - serviçoantibotrópico; C - serviço anticrotálico, Ab - Abelha e por3 dezenas separadas por hífen que correspondem:Ia dezena - corresponde ao número seqüencial de lotes domesmo serviço

2 a dezena - corresponde ao ano de fabricação

3a dezena - corresponde ao número seqüencial de lotestotais produzidos

16. Fracionamento do Plasma a Granel

O fracionamento do plasma a granel se dá por diferençade solubilidade ao adicionar sais neutros, especificamenteo sulfato de amônio, também por termocoagulação etratamento enzimático com pepsina.

16.1. Por diferença de solubilidade, tratamento enzimáticoe termocoagulação.

16.1.1. Primeiro Procedimento de Precipitação

Após a mistura, o plasma a granel é mantido sobagitação no tanque de reação 01 e adicionado solução desulfato de amônio 50% até uma saturação final ao redor de29%, que ê determinada por condutividade após 3 0 minutos deagitação. Após este período, o pH é ajustado para 6.8 - 6.9com solução de ácido cítricô 4 0% ou solução de hidróxido desódio 4 0%, dependendo do pH inicial da mistura de plasma.Em seguida a solução é mantida sob agitação por mais 3 0minutos e ao fim deste período, permanecerá em repouso nomínimo por 4 horas. Após o repouso da solução, as duasfases formadas (sólida e líquida) são separadas porcentrifugação. Denomina-se sobrenadante à fase líquida eprecipitado à fase sólida. No primeiro procedimentorecupera-se o precipitado e descarta-se o sobrenadante.16.1.2. Segundo Procedimento de Precipitação

O precipitado obtido do primeiro procedimento édiluído com água para injetáveis no tanque de reação 02 sobagitação, de modo que se obtenha uma concentração deproteínas igual ou menor que 4g% e uma saturação de sulfatode amônio inferior a 8g % determinado por condutividade.Realizadas as determinações de proteína e sulfato deamônio, manter a solução sob agitação ajustando o pH para3.1 - 3.2 com solução de ácido cítrico através da bomba detransferência de produto. Imediatamente após o ajuste do pHé adicionado pepsina na concentração de 1/80, ou seja, paracada 80 gramas de proteína é adicionado lg de pepsina.

Após a adição da pepsina, o produto permanece sobagitação durante 10 minutos e em seguida é corrigido o pHpara 3.1 - 3.2, permanecendo a solução em agitação por mais35 minutos.

Após o período de tratamento com a pepsina, o pH éajustado para 4.5 - 4.6 com solução de hidróxido de sódio40%. Em seguida adiciona-se solução de sulfato de amônio50% que é transferida do tanque de preparo de solução desulfato de amônio até que se obtenha uma saturação final aoredor de 11,3 g% determinada por condutividade, levando-seem conta a determinação inicial deste sal após a diluição.

No segundo procedimento de precipitação, manter oproduto em agitação por 3 0 minutos e em seguida, corrigirse necessário o pH para 4.5 - 4.6. Adicionar ácidocaprílico para uma concentração final de 0,01M, mantendo-seo produto sob agitação constante por 3 0 minutos. (senecessário corrigir novamente o pH para 4.5 - 4.6). Aseguir sob agitação constante, iniciar a termocoagulação,que consiste no aquecimento do produto a 55°C por_ 60minutos. Após a termocoagulação, ajustar o pH para 6.8 -6.9 com solução de hidróxido de sódio 40%, resfriando oproduto em seguida para 25°C - 29°C. Para finalizar osegundo procedimento de precipitação, adicionar solução desulfato de amônio 50%, transferindo o produto do tanque depreparo de solução de sulfato de amônio para que se obtenhauma saturação final ao redor de 17,6 g% determinada porcondutividade. Manter o produto em agitação por 30 minutose verificar novamente a concentração de sulfato de amôniopor condutividade e ser for necessário, adicionar soluçãode sulfato de amônio 50%. Corrigir o pH para 6.8 - 6.9 emanter em agitação por mais 3 0 minutos.

Para separar as duas fases formadas, líquida e sólida,centrifugar o produto recuperando a fase líquida(sobrenadante) e desprezando a fase sólida (precipitado).16.1.3. Dessalinização

A dessalinização é feita do sobrenadante do segundoprocedimento de precipitação para a retirada do sulfato deamônio remanescente. O processo é realizado em sistema deultrafiltração molecular com membrana de corte de 3 0kDa,utilizando-se como solução dialisadora solução fosfato comcloreto de sódio 0,42%.

A concentração final de sulfato de amônio deve serinferior a 0,2 g% e é determinada por análise colorimétricaem ensaio com o reativo de Nessler.

Durante o processo de dessalinização é realizado omonitoramento da integridade dos filtros, através da reaçãodo material filtrado descartado com o ácido tricloroacético20%.

O produto dessalinizado é retirado com tampão fosfato25 mM com 90 mM de NaCl com pH 6,80 + 0,05 do sistema deultrafiltração molecular para um volume final aproximado de80 litros.

16.1.4. Cromatografia

Após a dessalinização do sobrenadante do segundoprocedimento de precipitação, o produto deverá sersubmetido a purificação por cromatograf ia em coluna detroca iônica Q Sepharose Fast Flow. Os tampões utilizadosneste processo são: tampão fosfato 50 mM pH 6,80 paraequilíbrio da coluna; tampão fosfato 25 mM com 90 mM deNaCl pH 6,80 + 0,05 para diluição da amostra aplicada;tampão fosfato 25 mM com 1 M de NaCl para limpeza dacoluna. O volume final retirado do sistema é igual oupróximo de 160 litros de produto cromatografado.

16.1.5. Concentração

O produto cromatografado é concentrado aaproximadamente 10 a 12% do volume inicial do plasma àgranel. Para uma concentração de 12% com o volume do plasmaa granel em 3 00 litros, o volume total a ser obtido deveráser de 36 litros, (soro concentrado + solução conservante =36 litros).A concentração se faz em sistema de filtraçãotangencial (Sistema Pellicon® - Millipore®) com membranasde corte de 3 0kDa.

Durante o processo de concentração é realizado omonitoramento da integridade das membranas através dareação do material filtrado descartado com o ácidotricloroacético 20%.

O produto concentrado é chamado de soro concentrado àgranel.

16.1.6. Adição de Solução Conservante

A solução conservante utilizada no soro concentrado àgranel é a solução fenol 10%, visando atingir umaconcentração final de 0,25g%. A solução de fenol é diluídacom solução fosfato com cloreto de sódio 0,42%, visandoatingir o volume desejado na fase de concentração.

17. Preparo do Soro Concentrado a Granel

17.1. Filtração Clarificante

Se necessário o produto poderá ser clarificado na salade filtração de soro concentrado, utilizando filtrosnominais de polipropileno com porosidade nominal variandoentre 1,2 e 0,3 micrômetros.

17.2. Filtração Esterilizante

A esterilização do soro concentrado a granel érealizada em filtros absolutos de 0,22 micrômetros deporosidade e é realizada na sala de filtração de soroconcentrado.

18. Distribuição em Frascos ou Bolsas

0 soro concentrado a granel estéril é armazenado emfrasco de vidro temperado, apirogênico e estéril de 2 0litros ou 4 5 litros de capacidade ou ainda em bolsas de PVCatóxicas, estéreis e apirogênicas de 10 litros, 20 litrosou 50 litros de capacidade aprovadas pelo Controle deQualidade.

19. Controle da Filtração Esterilizante

O controle da filtração esterilizante é realizadoantes e após a filtração através do teste de integridade doelemento filtrante pela utilização do equipamentoautomático Integritest®.

20. Rotulagem de Frascos ou Bolsas

Os dados referentes ao produto acabado a granelfiltrado são preenchidos após a verificação do volumeobtido. No caso do armazenamento em frascos, a rotulagem éfeita através da leitura do volume na parte frontal e embolsas, através da pesagem do seu conteúdo.

Caso ocorra a distribuição do soro em mais de umfrasco ou bolsa, estes serão denominados de sublotes edeverão conter além do número inicial de processo, a adiçãode uma letra em ordem alfabética (A, B, C, etc.).

A identificação é realizada em etiquetas plásticasauto-adesivas colocadas em local visível nos frascos oubolsas contendo os seguintes dados:

nome da seção produtora +especificação do serviçonúmero do lote do soro filtradofrasco único ou a letra designando o sub-lote.volume do produto em litrosdata de fabricaçãoresponsáveis pela operação

21. Amostragem do Soro Concentrado a Granel

A amostragem é realizada na sala de controle deprocesso pelo Serviço de Controle de Qualidade, na qual sãoretiradas dos frascos ou bolsas amostras do soroconcentrado a granel para os Controles Microbiológico,Biológico e Físico-Químico.

22. Provas de Controle de Qualidade

Para liberar o soro concentrado a granel, sãorealizadas as seguintes provas pelo Serviço de Controle deQualidade:

Potência (citotoxicidade e inibição da hemólise);pirogênio "In Vivo"; teste de esterilidade; determinação decloreto de sódio; determinação de proteínas; determinaçãode fenol; determinação da concentração de sulfato deamônio; determinação de pH. Com exceção da prova decitotoxicidade e inibição da hemólise os outros testesestão descritos na Farmacopéia Brasileira.

Como controle de processo é realizada a seguinteprova: Eletroforese em gel de agarose.

23. Data de Fabricação

A data de fabricação do soro concentrado a granel éaquela correspondente ao dia da abertura das bolsas deplasmas.

24. Estocagem dos Lotes de Soro Concentrado a Granel

Após a retirada das amostras, os frascos ou bolsasplásticas do soro concentrado a granel são armazenados emcâmara fria à temperatura de 2°C a 8°C até a liberação dosresultados pelo Serviço de Controle de Qualidade.

25. Arquivo de Amostras

De cada lote de soro concentrado a granel é retiradauma amostra que é conservada em temperatura de 2°C a 8°C,devidamente identificada por 60 meses a partir da data daúltima prova de potência.

26. Autorização para Formulação

Após a liberação dos resultados do soro concentrado agranel pelo Serviço de Controle de Qualidade, este recebe adenominação de soro concentrado acabado a granel. De acordocom o cronograma de disponibilidade de soros hiperimunes, oproduto aprovado e a respectiva documentação são colocadosa disposição da Diretoria de Divisão de DesenvolvimentoTecnológico e Produção, em forma de ofício com asinformações referentes ao produto concentrado. A Diretoriade Divisão solicita então a formulação do produto acabado agranel através do documento FormSoros.

27. Registros

Os dados do processo de fabricação de cada lote deSoro Concentrado Acabado a Granel e os resultados dasprovas de controle são registrados e arquivados. As cópiasdestas documentações são arquivadas na Seção deProcessamento de Plasmas Hiperimunes.

28. Reprocessamento

O soro concentrado a granel poderá ser reprocessadopor ordem da Diretoria de Divisão de DesenvolvimentoTecnológico e Produção após os resultados emitidos peloServiço de Controle de Qualidade nas seguintes situações:

a) Reprovado no teste fisico-químico tais como:concentração de fenol, concentração de cloreto de sódio,concentração de sulfato de amônio e pH. Em caso de excessodestes elementos, o soro concentrado a granel deverá sersubmetido ao processo de dessalinização e concentração ereceber novo número de lote de fabricação.

b) Reprovado nos testes biológicos de potência epirogênio "In Vivo", no teste microbiológico deesterilidade e no teste fisico-químico de proteínas. Nestescasos o soro concentrado a granel deverá ser submetido acromatograf ia de troca iônica e concentração e receber novonúmero de lote de fabricação.

29. Descarte

O soro concentrado a granel poderá ser descartado porordem da Diretoria de Divisão de DesenvolvimentoTecnológico e Produção se após o reprocessamento forreprovado nos testes de controle de qualidade. Poderá, noentanto ser aproveitado para ensaios "In Vitro" de pesquisae desenvolvimento. O soro concentrado a granel e outrosmateriais a serem descartados são colocados a disposição daDivisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção medianteofício emitido pela Seção de Processamento de PlasmasHiperimunes.

30. Formulação

3 0.1 Formulação do Soro Produto Acabado a Granel3 0.1.1 Adição de Solução Conservante

A solução conservante utilizada no soro produtoacabado a granel é a solução fenol 10%, porém aconcentração final de fenol no soro não deve ser superior à0,35g%.

3 0.1.2 Isotonização

O sal utilizado para isotonização do soro produtoacabado a granel é o cloreto de sódio p.a., e deve estar emuma concentração final entre 0,75 a 0,90 g%.30.1.3 Esterilização do Soro Produto Acabado a Granel

A esterilização do soro acabado a granel é realizadaem filtros absolutos de 0,22 micra de porosidade.3 0.1.4 Distribuição em Frascos ou Bolsas

O soro acabado a granel estéril é armazenado emfrascos de vidro temperado, apirogênico e estéril de 2 0litros ou 4 5 litros de capacidade ou ainda em bolsas dePVC atóxicas, estéreis e apirogênicas de 10 litros, 20litros ou 50 litros de capacidade aprovadas pelo Controlede Qualidade.

30.1.5 Controle da Filtração Esterilizante

O controle da filtração esterilizante é realizadoantes e após a filtração através do teste de integridade doelemento filtrante pela utilização do equipamentoautomático Integritest®.

3 0.1.6 Rotulagem dos Frascos e ou Bolsas.

Os dados referentes ao produto acabado a granelfiltrado são preenchidos após a verificação do volumeobtido. No caso do armazenamento em frascos, a rotulagem éfeita através da leitura do volume na parte frontal e embolsas, através da pesagem do seu conteúdo.

Caso ocorra a distribuição do soro em mais de umfrasco ou bolsa, estes serão denominados de sub-lotes edeverão conter além do número inicial de processo a adiçãode uma letra em ordem alfabética (A, B, C, etc.).

A identificação é realizada em etiquetas plásticasauto-adesivas colocadas em local visível nos frascos oubolsas contendo os seguintes dados:

nome da seção produtoraespecificação do serviçonúmero do lote do soro produto acabado a granelfrasco único ou a letra designando o sub-lotevolume do produtodata da fabricaçãoresponsáveis pela operação

31. Amostragem do Soro Produto Acabado a Granel

A amostragem é realizada na área de formulação peloServiço de Controle de Qualidade, na qual são retiradas dosfrascos ou bolsas amostras do soro acabado a granel para osControles Microbiológico, Biológico e Fisico-Químico.

32. Provas de Controle de Qualidade

Para a liberação do produto acabado a granel para oenvase são realizadas as seguintes provas pelo Serviço deControle de Qualidade:

Soro-neutralização de proteínas específicas (porcromatografia de afinidade, eletroforese bidimensional eanálise proteômica);

- Potência (inibição da citotoxicidade do veneno, inibiçãoda atividade de liberação de creatino quinase e inibição dahemólise);

- teste de pirogênio "In Vivo";- teste de esterilidade;- teste de identidade;- teste de inocuidade;- determinação de fenol;- determinação de sólidos totais;- determinação de sulfato de amônio;- determinação do teor de cloreto de sódio;- determinação de nitrogênio e proteínas;

Com exceção das provas de soro-neutralização epotencial inibição da citotoxicidade do veneno, inibição daatividade de liberação de creatino quinase e inibição dahemólise, os outros testes estão descritos na FarmacopéiaBrasileira. Os resultados das analises mencionadas acimadeverão estar dentro dos parâmetros mencionados nosprotocolos descritos abaixo, enquanto que os resultados dasanalises já descritas pela Farmacopéia Brasileira deverãoestar dentro dos limites estabelecidos pelas NormasNacionais.

33. Ensaio de soro-neutralização específica

A avaliação da capacidade de neutralizar determinadasproteínas (toxinas) presentes no veneno de abelhas, deveser realizada por duas estratégias diferentes: i)combinação de um conjunto de técnicas analíticas, como acromatografia de afinidade do veneno de abelhas utilizandose da imobilização do soro anti-veneno de abelhas emsuporte sólido e analise proteômica; e ii) pela combinaçãodas técnicas de eletroforese bidimensional ,eletrotransferência e imunoblotting (utilizando-se do soroanti-veneno de abelhas e de IgG de coelho anti-IgG de cavalos)

33.1. Cromatografia de Imunoafinidade

A Figura 2 apresenta um esquema da cromatografia deimunoafinidade em matriz inerte de carboidrato, constituídade Sepharose 4B ativada com brometo de cianogênio (1) .Nesta figura estão representadas as proteínas do soro anti-veneno de abelhas imobilizadas na superfície da matrizcromatografica inerte (2). O veneno é potencialmenteconstituído de proteínas imunoreativas (com afinidade) aosoro anti-veneno de abelhas (3) , e de proteínas nãoimunoreativas (4) ao soro. O esquema representa o processode eluição inicial das proteínas não imunoreativas ao soroanti-veneno, que ocorre em pH 8,0 (5), seguido da retençãodas proteínas do veneno de abelhas que apresentamimunoreatividade ao soro anti-veneno, que por sua vez sãoeluídas posteriormente, lavando-se a coluna com solução depH 2,8 e depois com outra solução de pH 11,0 (6) .

A realização da cromatografia de afinidade exige aimobilização do soro anti-veneno de abelhas em coluna deSepharose, seguido da cromatografia propriamente dita. Aseguir estão descritas cada uma destas etapas.33.1.1 Imobilização do soro antiveneno de abelhas em resinade Sepharose.

A quantificação de proteínas foi feita pelo método deBradford segundo descrito por Sedmak & Groosberg (1977). Aresina utilizada foi a Sepharose 4B ativada por CNBr (GEHealthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). A quantidadede ligante (soro antiveneno de abelhas) imobilizado foiestabelecida experimentalmente em 3 0mg de proteínas (IgG)para lg de resina. O empacotamento da resina foi feitosegundo as instruções do fabricante. A ligação dasproteínas do soro antiveneno de abelhas à resina deSepharose 4B foi feita à temperatura ambiente sob agitaçãoconstante, sem a utilização de agitador magnético. Oligante foi dissolvido em tampão de ligação (solução deNaHC03 0,1M em pH 8,3, contendo 0,5 M NaCl) . 0 excesso deligante foi lavado com 15 volumes do tampão de ligação.Para bloquear quaisquer grupos reativos, a resina comligante foi transferida para uma solução tampão Tris-HCl0,1M pH 8,0. Após 2 horas, o excesso de proteínas do soroantiveneno, que não se ligou à resina, foi lavado com pelomenos três ciclos alternados de pH ácido e básico,utilizando-se as soluções: tampão acetato de sódio 0,1M pH4,0 (contendo 0,5M NaCl), seguido de lavagem com soluçãotampão Tris-HCl 0, 1M pH 8,0 (contendo 0,5M NaCl) , paragarantir que nenhuma molécula livre do ligante permanecesseacoplada ao ligante imobilizado. A coluna foi equilibradacom este mesmo tampão.

33.1.2 Cromatografia de imunoafinidade do veneno de abelhasPara remoção das elevadas concentrações de saisinorgânicos que ocorrem naturalmente no veneno de abelhas(incompatível com etapas posteriores de eletroforese 2-D),o veneno a ser utilizado na cromatografia foi dialisadocontra uma solução contendo: PMSF lmM (inibidor deserinoproteases), leupeptina 2x10-3 mM (inibidor deserinoplasmina, porcina e cisteína proteases) e EDTA lOOmM(inibidor de metaloproteases); sendo posteriormenteliofilizado.

A quantidade de veneno a ser utilizada na cromatografia foideterminada empiricamente. Após várias tentativas foiutilizada a razão de 1:24 vezes (proteínas do veneno:proteínas do soro), e com base nos resultados obtidos nosensaios biológicos foi posteriormente estabelecida umarazão de 1:58. Foi utilizada uma coluna de 20mL de resinaSepharose 4B, tratada conforme descrito. 0 veneno foisolubilizado em 3mL de solução (NH4)HC03 lOmM pH 6.8 eaplicado na coluna. Primeiramente foi realizada uma lavagemda coluna, para eluição de todas as frações nãoimunoreativas ao soro antiveneno de abelhas imobilizado emSepharose 4B. Para isso utilizou-se tampão Tris-HCl 0,1M pH8 contendo NaCl 0,15M. A eluição foi monitorada por medidasde absorbância em 280 nm, até que a leitura atingisse ovalor zero, sendo coletadas frações de 15mL. Para eluiçãoda fração ácida ligada à resina, utilizou-se tampão Tris-Glicina 0,05M pH 2,8, contendo NaCl 0,15M. Para a posterioreluição das proteínas básicas ligadas à resina foiutilizado tampão Tris-HCl 0,1M pH 11,0. O esquema dacromatografia encontra-se na figura 2. A quantidade deproteínas de cada fração coletada foi quantificada pelométodo Bradford (Sedmak & Groosberg, 1977). As fraçõescorrespondentes a cada pico eluído foram reunidas, e entãodialisadas para remoção do excesso de sal, incompatível comos protocolos experimentais subseqüentes (eletroforesebidimensional).

Em etapa posterior foi adicionado inibidor de proteasea todos os tampões da cromatografia. (lOmM de EDTA foramutilizadas em todas as etapas).

33.2. Análise proteômica

A realização de análise proteômica requer a separaçãodos componentes do veneno de abelhas, que neste protocolofoi realizada por eletroforese bidimensional. As etapasdesta análise estão descritas a seguir.

33.2.1. Eletroforese 2-D

Preparação da amostra: Para os ensaios de eletroforese2D foram utilizadas amostras do veneno bruto totaldialisado na presença de inibidores de protease (EDTA, PMSFe leupeptina), das frações do veneno bruto coletadas nacromatografia de exclusão molecular, da fração que não seligou à resina da coluna de imunoafinidade (nãoimunoreativas) e das frações ácida e básica que se ligaramà coluna de imunoafinidade (imunoreativas).

Primeira dimensão - Focalização isoelétrica (IEF):Para realização da IEF as proteínas foramsolubilizadas em uma solução de re-hidratação (DeStreakacrescido de 0,5% de tampão IPG (GE Healthcare BiosciencesAB, Uppsala, Suécia) e azul de bromofenol. Fitas paraimobilização de proteínas (Immobiline Dry Strips - IPG), pH3-10, foram re-hidratadas nesta solução de proteínas por15H e submetidas ao IEF em um sistema IPGphor (GEHealthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia) a 500Vh, lOOOVhe 8000Vh.

Segunda dimensão - SDS-PAGE: Após a primeira dimensãoas fitas de IPG foram incubadas em tampão de equilíbrio 1(75mM Tris-HCl, pH 8.8; uréia 6M; 30% de glicerol; lOmg/mLDTT; 2% SDS; iodoacetamida e azul de bromofenol) , durante15 minutos para a redução das pontes dissulfeto e por mais15 minutos em tampão de equilíbrio 2 (mesmo solução,entretanto substituindo-se DTT por 25mg/mL deiodoacetamida) para alquilação destas pontes. As fitasforam então transferidas para os géis de 12,5% depoliacrilamida contendo SDS. A corrida dos géis teveduração de aproximadamente 5 horas; os géis foram entãocorados com Commassie Blue Coloidal, segundo descrito porCandiano et al. (2004) (compatível com a espectrometria demassas), ou com nitrato de prata, dependendo da quantidadede proteínas; neste último caso apenas para evidenciarproteínas pouco abundantes e que não foram submetidas àespectrometria de massas. As imagens dos géis foramcapturadas utilizando-se o ImageScanner (GE HealthcareBiosciences AB, Uppsala, Suécia) e analisadas utilizando-seo ImageMaster 2-D Platinum software v. 5.0 (GE HealthcareBiosciences AB, Uppsala, Suécia). Os ""spots"" selecionadosforam então recortados manualmente e submetidos à digestãoe extração dos fragmentos trípticos gerados.

33.2.2. Identificação de Proteínas

A identificação de proteínas exige que se removam os""spots"" de proteínas do gel de eletroforesebidimensional, seguido da digestão destas proteínas comtripsina, do seqüenciamento peptídico do fragmentos geradosna digestão tríptica, por análises de espectrometria demassas e da identificação funcional propriamente dita, como uso de ferramentas de bioinf ormática—Cada uma destasetapas estão descritas a seguir.

33.2.2.1. Excisão e Digestão "in gel" dos ""spots""excisados do gel de eletroforese 2-D

A enzima utilizada foi a Tripsina modificada daPromega (Madison, WI, EUA). Todos os demais reagentes,incluindo bicarbonato de amônio e acetronitrila sãoAldrich (Milkaukee, WI, EUA).

Após a visualização dos géis 2-D os ""spots"" foramexcisados manualmente em capela de fluxo laminar vertical ecolocados em microtubos siliconizados de l,5mL parasubseqüente digestão in gel e extração dos fragmentostrípticos. A digestão in gel e a extração dos fragmentostrípticos foram realizados segundo protocolo modificado deSchevchenko et al. (1996). Os pedaços excisados de gelforam descoloridos com 100 uL de bicarbonato de amônio 100niM pH 7.8, contendo acetonitrila 50% (v/v), repetindo-se oprocesso até a descoloração total dos géis. Não foramfeitos os passos de redução e alquilação, uma vez que asamostras eram provenientes de géis bidimensionais e,portanto, estas etapas já haviam sido realizadas durante apreparação das mesmas para os procedimentos de eletroforesebidimensional, antes da realização da segunda dimensão (gelSDS-PAGE) . Os pedaços de gel recortados e excisados foramentão liofilizados e rehidratados com 15 uL de uma soluçãode tripsina lOng/uL em bicarbonato de amônio 40 mM pH 7.8.As amostras foram então incubadas a 37°C, durante 16 horas,sempre em tubos siliconizados.

O sobrenadante contendo os fragmentos trípticosgerados foi removido após centrifugação por 2 minutos a4000 x g, e os peptídeos remanescentes foram entãoextraídos do gel seguindo-se uma série de etapas deextração. Primeiramente adicionou-se 20 uL de uma soluçãoacetonitrila 50% (v/v), contendo ácido fórmico 5% (v/v) eincubou-se por 4 5 minutos a temperatura ambiente, seguidode sonicação por 10 minutos e breve centrifugação. Estaetapa foi repetida mais uma vez a partir do sedimentoremanescente da primeira centrifugação e coletado novamenteo sobrenandante. Ao sedimento da segunda centrifugaçãoadicionou-se 20 uL de uma solução acetonitrila 90% (v/v) ,contendo ácido fórmico 5% (v/v) , coletando-se osobrenadante após 5 minutos e breve centrifugação. Ossobrenadantes das 3 etapas foram coletados em um único tubosiliconizado de 1,5 mL e as amostras foram liofilizadas atéo volume ser reduzido a aproximadamente 0,5 uL em SpeedvacSC110 (Thermo Savant, Milford, MA, EUA) .

33.2.2.2. Seqüenciamento dos peptídeos trípticos porespectrometria de massas do tipo MALDI TOF-TOF

Todas as análises de espectrometria de massas foramrealizadas na Facility de Espectrometria de . Massas daUniversidade de Cornell (Ithaca, NY).

Cada amostra foi reconstituída em 10 uL de soluçãoacetonitrila 50% (v/v), contendo TFA 0,1% (v/v),anteriormente à análise por espectrometria de massas (MS) ,-0,5 fiL de cada amostra foi aplicado em uma placa doamostrador do espectrômetro MALDI-TOF/MS. Após a secagem daamostra na placa, adicionou-se 0,5 uL de uma soluçãosaturada de matriz de cc-Ciano-4-hidroxi ácido cinâmico(CHCA) (lOmg/mL em acetonitrila 50% (v/v) , contendo TFA0,1% (v/v) e fosfato de amôniolmM) sobre cada amostra, quepor sua vez foram deixadas à temperatura ambiente atésecagem completa. As amostras foram então submetidas àanálise por MALDI MS/MS utilizando um instrumento 4700Proteomics Analyzer (Applied Biosystem, Framingham, MA) ,equipado com um analisador de massas TOF-TOF óptico e como software Explorer 4700 versão 3.0. 0 instrumento foioperado em lkV no modo reflectron positivo e calibrado comum kit de calibrantes contendo uma mistura de 6 peptídeospadrão (Applied Biosystems, Framingham, MA) . A calibraçãointerna foi feita utilizando-se dois íons da autólise datripsina (m/z 842.508 e m/z 1045.564) para todas asaquisições de espectros. A potência do laser foi ajustadapara 2000 V para as análises de MS e 3000 V para asanálises de MS/MS, com o sistema CID (Dissociação Induzidapor Colisão) desligado. Os espectros de MS foram adquiridospara íons com massas entre 700 e 4 000 Da, com uma relaçãosinal-ruído ajustada para um valor mínimo de mínimo de 20,para seleção de íons precursores. Os espectros de MS/MSforam adquiridos para os 8 íons precursores mais abundantesem um total de 2000 disparos acumulados de laser .33.2.2.3. Identificação de proteínas.

Os dados combinados das análises MS e MS/MS realizadaspor MALDI TOF-TOF foram utilizados para análise utilizando-se o software GPS Explorer (versão 3.5), fazendo-se umabusca contra o banco de dados do NCBInr (taxonomia:Metazoa). Os parâmetros de busca foram ajustados parapermitir uma clivagem perdida; modificações variáveis deoxidação da metionina e carboxiamidometilação da cisteína etolerância de massa de 50ppm. Os dados de MS/MS gerados apartir das análises de IDA, baseados nos experimentos deLC/ESI foram submetidos ao Mascot 2.1 para busca nos bancode dados, utilizando-se uma versão com servidor local(Cornell University) e a busca foi realizada contra o bancode dados NCBInr (taxonomia: Metazoa), com a admissão de umaclivagem perdida; a tolerância de massa do peptídeo foi 1,2Da e a tolerância admitida de nos ensaios de MS/MS foi de0,6Da. As modificações variáveis foram carboxamidometilaçãoda cisteína e oxidação da metionina. Apenas escoressignificativos para os peptídeos definidos pela análise deprobabilidade do Mascot (www. matrixscience. com/help/scoring_help. html#PBM) maiorque a identidade foram considerados para a identificação deproteínas.

33.3. Eletrotransferência e imunodetecção (WesternBlotting)

Foram realizados experimentos de Western Blottingpara detecção de IgG específicas do antiveneno que estavamreconhecendo as proteínas do veneno de abelhas.

As proteínas separadas em SDS-PAGE forameletrotransferidas do gel para membranas de nitrocelulosede 8x8cm na cuba de eletrotransferência Semi-Dry TE 70 (GEHealthcare Biosciences AB, üppsala, Suécia). Foramutilizadas membranas de nitrocelulose ao invés de PVDF porapresentarem menor intensidade de ruídos de fundo.

Em um reservatório contendo tampão de transferência[Tris 20 mM pH 8,3, contendo Glicina 192 mM, SDS 0,1%(m/v) e metanol a 10% (v/v) ] montou-se um "sanduíche" naseguinte ordem: três folhas de papel de filtro comum e umamembrana,gel, três folhas de papel de filtro comum; esteconjunto permaneceu em repouso por 10 minutos para oequilíbrio de todo sistema no tampão de transferência. Asmembranas foram pré-hidratadas por 15 segundos em águaantes de serem inseridas no tampão de transferência. 0conjunto foi colocado rapidamente na cuba de transferênciana seguinte ordem: a partir do cátodo da cuba,primeiramente os três papéis filtro, o gel equilibrado, amembrana e os mais três papéis filtro. Os parâmetrosutilizados foram: 250 V, 100 mA por 1 hora para géis de 8 x8 cm. Após a eletrotransferência a membrana foi corada comPonceau a fim de testemunhar a eficiência da transferência.A membrana foi então descorada com água para remover ocorante.

33.3.1 Imunodetecção

Nos ensaios de Western Blotting para detecção de IgGespecíficas do antiveneno ao veneno de abelhas foiutilizado o antiveneno de abelhas produzido pela FundaçãoButantan. O anticorpo utilizado foi Anti-IgG de cavalo(molécula intacta) produzido em coelhos, conjugado àperoxidase (Sigma, Saint Louis, MO).

A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com TBS-entre 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) por 2 horas,em temperatura ambiente. No caso dos ensaios para detecçãode IgG a membrana foi incubada com o antiveneno (anticorpoprimário) em um volume correspondente a ll,6mg de proteínas(aproximadamente 560/zL) , já que a eletrotransferência foifeita com 200jxg de proteínas de veneno (a fim de sealcançar a proporção 1:58 proteínas de veneno paraproteínas de antiveneno, determinada a partir dosresultados dos ensaios biológicos), acrescido de volumesuficiente de TBS-entre 20 a 0,1% (v/v) para completar 10mL. Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20mL de TBS-entre 20 0,1% (v/v) por 5 vezes, durante 10 minutos cadalavagem à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foiincubada com o anticorpo secundário (anti IgG de cavalo)diluído em TBS-entre 20 a 0,1% (v/v) na proporção 1:250[(100 uL do anticorpo e 24,9 mL de TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v)] por 2 hs, à temperatura ambiente.

As membranas para detecção de IgG específicas foramsubmetidas à detecção colorimétrica. Para isso, foi feitocom uma solução contendo o substrato cromogenico 4-cloro-1-naftol (Sigma, Saint Louis, MO) em metanol contendo 0,003%(v/v) de H202 e a reação foi interrompida por adição deágua deionizada.

33.3.2. Ensaio de inibição da atividade citotóxica doveneno3 3.

3.2.1. Preparo de meio de cultura:

Foi utilizado meio Eagle suplementado com 10% (v/v) de

soro fetal bovino (SFB) para o crescimento das células aserem cultivadas. Após dissolução do meio, retirou-seamostra para verificar o pH, que deveria estar entre 4,3 e5,9. Adicionou-se Bicarbonato de Sódio, de grama em grama,retirando-se amostras para medição do pH, após cada adição.O meio deve atingir pH entre 7,1 e 7,3. Acrescentou-se SFBem 10% (v/v) e retirou-se nova amostra e mediu-se novamenteo pH que deveria estar entre 7,2 e 7,5. Realizou-se afiltração do meio em membrana esterilizante e, em seguida,foram retiradas amostras para o Teste de Verificação deAusência de Bactérias e Fungos.

33.3.2.2. Banco de células:

Para manter sempre uma quantidade de célula para usoimediato é necessário que se prepare um banco de células,ou seja, após o descongelamento de um criotubo, as célulasque se reproduziram e não foram utilizadas, devem sercongeladas em nitrogênio líquido em concentração de 6 a 8 x106 células/mL.

Para o congelamento, foi realizada uma subcultura,para que em 24 horas, a monocamada atingisse de 70 a 80% deformação (quando as células estariam na fase log decrescimento). Procedeu-se à tripsinização dessas célulascom Associação Tripsina-Versene (ATV) e diluição com meioEagle contendo 10% (v/v) de SFB e contagem em câmara deNewbauer (diluição do corante para contagem - ImL decélulas e 2 mL de corante) . O resultado é o número decélulas/mL da garrafa. Para congelamento, são necessáriasde 6 a 8 x 106 células/mL. Após diluição ou concentração(por centrifugação) para se obter a quantidade desejada,acrescentou-se DMSO (dimetilsulfoxido) , 5% (v/v) e realizaros testes de esterilidade. Distribui-se 1 mL decélulas em cada criotubo e o congelamento deve ser lentopara que a formação dos cristais seja o mínimo possível,sem rompimento da membrana celular. Após esta etapaembrulham-se os criotubos em papel jornal e depois em papelalumínio e colocam-nos no freezer -80°C por 24 horas.Transcorrido esse período, colocam-se os criotubos nonitrogênio líquido.

Após 3 dias deve-se retirar 1 criotubo para Teste de Micoplasma e 1 criotubo para verificar a viabilidadecelular e sua concentração.3 3.3.2.3. Descongelamento celular

Para a realização dos testes de citotoxicidade, ascélulas a serem utilizadas foram descongeladas a partir do Banco de Células.

Retira-se 1 criotubo da célula escolhida do tambor denitrogênio líquido (-196°C) e o coloca diretamente em umrecipiente com tampa contendo água a 36,5°C para que ocorraum descongelamento rápido da célula, de modo que ela não serompa devido aos cristais formados em seu citoplasmadurante o processo de congelamento.

Em capela de fluxo laminar, despeja-se o conteúdo docriotubo em uma garrafa de 25cm3 para cultura de células eadiciona-se meio Eagle fresco, contendo 10% (v/v) SFB. Após24 horas o meio foi substituído para remoção do DMSO usadono congelamento das células (para evitar a formação doscristais no citoplasma).

33.4. Subcultivo celular

Após formação da monocamada de células na garrafa, emcapela de fluxo laminar, retira-se todo o meio de culturada garrafa e tratam-se as células com ATV para que estasdescolem da garrafa e também umas das outras. Após sedescolarem, adicionou-se meio Eagle fresco, contendo 10% deSFB 10% e transferiu-se para outras garrafas, na diluição30 1:6.33.5. Citotoxicidade

Nos ensaios de citotoxicidade foram testadosdiferentes tipos celulares (L-929 - células de inseto, CRFK- células de rim de gato, MDBK - células de rim de boi eCHO - células de ovário de Hamster Chinês).

Em placas de cultura de 96 cavidades, foram realizadasdiluições seriadas do veneno em meio Eagle com 10% de SFB.

Em seguida, acrescentou-se 5 x 105 células/cavidade,exceto na primeira coluna para leitura do branco. As placasforam incubadas em estufa 36,5°C com 5% de C02 pelo períodode 1, 2, 3, 4 ou 24 horas. Após o período de incubação, ascélulas foram fixadas com acetona 80% a -20°C por 10minutos. Secou-se a placa e adicionou-se lOOuL por cavidadede Azul de Evans 1:10.000. As células foram então incubadasem estufa a 36,5°C por 1 hora para que as células vivasfossem coradas. Lavou-se com PBS para retirar o excesso decorante e acrescentou-se lOOuL de PBS com 10% de SDS (SódioDodecil Sulfato) foram adicionados, a fim de romper amembrana das células fixadas, liberando o corante,seguindo-se a leitura no leitor de Elisa.

33.5.1. Soroneutralização da atividade citotóxica

Para os ensaios de soroneutralização foram utilizadosdiferentes lotes de antivenenos produzidos pela FundaçãoButantan.

Em placas de cultura de 96 cavidades, foram realizadasdiluições seriadas do veneno em meio Eagle contendo 10%(v/v) de SFB, acrescentando, em seguida, o mesmo volume deantiveneno. A mistura veneno + antiveneno foi inclubada emestufa a 36,5°C com atmosfera de 5% (v/v) de C02 durante 1hora. Metade do volume foi descartado e acrescentou-se 5 x105 células/cavidade, com mesmo volume existente nacavidade, exceto na primeira coluna para leitura do branco.Incubou-se novamente a placa pelo período determinado. Apóso período de incubação, as células foram fixadas comacetona 80% (v/v) a -20°C por 10 minutos. Secou-se a placae adicionou-se lOOuL de Azul de Evans 1:10.000, porcavidade. As células foram então incubadas em estufa a36,5°C por 1 hora para corar as células vivas. Lavou-se comPBS para retirar o excesso de corante e lOOuL de PBS com10% de SDS foram adicionados, a fim de romper a membranadas células fixadas, liberando o corante, seguindo-se aleitura no leitor de Elisa a 540nm.

Foram repetidos os mesmos testes, só que ao invés dediluir o veneno, foi diluído o antiveneno, mantendo-se fixaa concentração do veneno.

33.6. Ensaio da atividade de neutralização da hemólisecausada pelo veneno

Os experimentos de atividade hemolítica foramrealizados com base na metodologia utilizada por de Souza ecol. (2005) e descritos a seguir.33.6.1. Obtenção dos eritrócitos

Foram adicionados cerca de 500 uL de sangue extraídoda cauda de ratos Wistar fêmeas em 50 mL de solução salina(NaCl 0,85%, CaC12 10 mM) sob leve agitação, em agitadormagnético (MA-089 MARCONI). Esta suspensão de eritrócitosfoi mantida por 15 minutos sob agitação leve para evitarcoagulação.

A suspensão de eritrócitos foi centrifugada emcentrífuga clínica (Z-200A HERMLE) a 3000 rpm durante 15minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se ascélulas em 10 mL de solução salina, para lavagem doseritrócitos. Repetiu-se esta operação por mais duas vezes.

O sobrenadante da última centrifugação foi descartadoe o concentrado de hemácias obtido ao final dascentrifugações foi considerado como sendo 100% de células.

Foi preparada uma suspensão de eritrócitos a 1%,diluindo-se a suspensão concentrada descrita acima, comsolução salina isotônica. Essa suspensão a 1% foi utilizadanos ensaios de atividade hemolítica.

33.6.2. Ensaio de inibição da atividade hemolítica doveneno

Foi montada uma bateria de ensaios em microplaca(Costar, Acton, MA, EUA), onde cada orifício continhadiferente concentração do veneno de abelhas, dissolvido em10 jj.L de solução salina. A cada poço foram adicionados 90uIj da suspensão de eritrócitos perfazendo um volume finalde 100 uL. Diferentes concentrações do veneno foramtestadas, em triplicata, a fim de estabelecer-se a dosemínima capaz de lisar 100% das hemácias. Para o controle de0% de hemólise foram adicionados 10 uL de solução salina e90 (iL da suspensão de eritrócitos e, para o controle de100% de hemólise, foram adicionados apenas 10 uL de soluçãosalina acrescida de 1% (v/v) de Triton X-100 (t-Octilfenoxipoli-etoxietanol, Sigma, Saint Louis, MO), em 90uL de suspensão de eritrócitos.

A placa foi incubada à temperatura ambiente por 2horas sob leve agitação. Após este período de incubação, oconteúdo de cada orifício foi centrifugado por 5 minutos a3000 rpm, em uma centrífuga Compacta Avanti 3 0 (Beckman,Fullerton, CA, EUA) . Com o sobrenadante, montou-se uma novaplaca para realização das leituras de absorbância, que foirealizada era uma leitora de placas (Biotrak II - GEHealthcare Biosciences, Uppsala, Suécia), com filtro de 540nm.

Para se testar a soroneutralização da atividadehemolítica o veneno foi incubado com o antiveneno, (apartir da concentração mínima de veneno obtida nos ensaiosde hemólise necessária para hemolisar 100% dos eritrócitosvariando-se a quantidade antiveneno a fim de se estabelecera concentração mínima de antiveneno capaz de neutralizar aatividade hemolítica) a 37°C por 30 minutos antes deacrescentadas as hemácias.

3 3.7. Ensaio de inibição da atividade miotóxica (medida daatividade de Creatino Quinase)33.7.1. Obtenção do sangue

Os ensaios de liberação de creatino quinase (CK) parase testar a tividade miotóxica do veneno de abelhas foramrealizados segundo Rocha e col. (2007). Foram injetados50ug de veneno de abelhas total ou de fração nãoimunoreativa, ou ainda o antiveneno isolado no músculotibial anterior de camundongos machos Balb/c. Paracertificar a ação neutralizadora do antiveneno na atividademiotóxica, o veneno foi incubado juntamente com oantiveneno na proporção 1:58 a 37°C por meia hora antes deser injetado.

Solução salina foi utilizada como controle. Após 3horas os camundongos foram anestesiados, o sangue total,coletado em tubo heparinizado, foi retirado pelo plexoocular ou por punção cardíaca e os animais foramsacrificados por deslocamento da coluna vertebral. O sanguecoletado foi imediatamente centrifugado por 10 minutos a3 000 rpm, em uma centrífuga Compacta Avanti 3 0 (Beckman,Fullerton, CA, EUA) . Os sobrenadantes foram utilizados paraa leitura da atividade de creatino-quinase (CK) .33.7.2. Leitura da atividade de CK

Para a leitura da atividade enzimática foi utilizado okit método cinéticò-UV, líquido estável, (Laborlab,Guarulhos, SP, Brasil) seguindo as instruções dofabricante. Para a preparação do reagente de trabalhomisturou-se uma parte do Reativo Tampão 1+4 partes doReativo enzimático 2. A reação foi realizada a 25°C. 20L dosobrenadante do sangue coletado foi misturado com lmL doreagente de trabalho. Esta solução foi mantida por 3minutos, disparou-se o cronômetro e foram realizadasleituras a 340nm a cada um minuto durante 4 minutos.Calculou-se o decréscimo médio de absorbância por minuto(ÁA/min) e aplicou-se a seguinte fórmula para obtenção daatividade enzimática: ÁA/min x 8095 = U/L34. RESULTADOS

A figura 3 mostra o perfil protéico, em eletroforese2-D, do veneno bruto dialisado na presença dos inibidoresde protease EDTA, PMSF e Leupeptina.34.1. Eletroforese bidimensional

A coluna de afinidade foi então montada na proporção1:58 (proteínas do veneno: proteína do soro) e a totalidadede proteínas de veneno aplicada foi recuperada quandosomadas as proteínas eluídas nos diferentes pHs. Os géisreferentes a estas frações estão mostrados nas figuras 4 e5. A figura 4 mostra o perfil da eletroforese 2-D da fraçãonão imunoreativa (eluída em pH 8,0), enquanto que a figura5 mostra o perfil da eletroforese 2-D da fraçãoimunoreativa eluída em pH ácido (2,8). Os " spots11 destestrês géis e os "spots" do gel de veneno total dialisadoforam então recortados para identificação. Ainda foi eluídadesta cromatografia, uma fração imunoreativa eluída em pH10,7, cujo perfil de proteínas em eletrof orese 2-D estámostrado na figura 6. Os "spots" de proteínas foramnumerados individualmente para posterior identificação.34.2. Analise proteômica

Todos os spots dos quatro géis (veneno total, fraçãonão imunoreativa, fração imunoreativa eluída em pH ácido efração imunoreativa eluída em pH básico) provenientes dacromatograf ia de af inidade reali zada na proporção deproteínas veneno:soro igual a 1:58 (veneno extraído napresença de inibidores de protease), foram submetidos àanalises proteômicas, realizando-se inicialmente osequenciamento por espectrometria de massas, perfazendo umtotal de 122 "spots" submetidos. Destes, 113 foramidentificados.

As tabelas 1 a 4 mostram as identificações dasproteínas presentes no veneno de abelhas.

Tabela 1 - Identificação das proteínas do veneno total dialisado na presença dc inibidores de protease (gel mostrado na figura 3).As proteínas em negrito estão sendo descritas pela primeira vez no veneno de abelhas.

<table>table see original document page 46</column></row><table>Tabela 2 - Identificação das proteínas imunoreativas ao soro anti-veneno de abelhas, provenientes da fração eluída em pH ácidodo gel mostrado na figura 5. As proteínas em negrito eslâo sendo descritas pela primeira vez no veneno de abelhas.

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Tabela 3 - Identificação das proteínas provenientes da fração não imunorealivns - eluídas em pl 1 8.0. do gel mostrado na figura 4. As proteínas em negrito estilo sendo descritas pela primeira vez no veneno de abelhas. <table>table see original document page 47</column></row><table>A partir destes resultados foi possível listar as proteínasque estão presentes no veneno de abelhas total, conforme mostraa tabela 5.

Tabela 5 - Composição de proteínas do veneno de abelhas (Apis mellifera), identificadas noveneno por analise proteômica, com o respectivo número de isoformas *.

<table>table see original document page 48</column></row><table>

** As proteínas destacadas estão sendo descritas pela primeira vez no veneno34.3. Imunodetecção (Western Blotting)

O Western Blotting realizado na proporção 1:58(proteínas de veneno:antiveneno) (figura 7) detectou umtotal de 33 spots de proteínas imunoreativas ao soro anti-veneno de abelhas.

Foram correlacionadas as identificações dos spots deproteínas imunoreativas no ensaio de Western Blotting (WB)mostrado na figura 7, com os "spots" equivalentes,observados nos géis de eletroforese 2-D das Figuras 3 a 6(já identificadas nas tabelas de 1 a 4) , e as proteínasimunoreativas identificadas neste ensaio estão descritas natabela 6.

Tabela 6 - Identificação das proteínas detectadas por WB com anti-lgG e cavalo. A coluna "Fração"indica de qual fração o spot havia sido identificado após a cromatografia de afinidade: N - fraçãoNão imunoreativa a IgG de cavalo (na coluna de afinidade) : I - Fração Imunoreativa a IgG de cavalo(na coluna de afinidade) eluída em pH ácido: VT - Veneno Total).

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Estes resultados mostram que algumas proteínas eluídasna fração não reconhecida pelo antiveneno imobilizado nacromatografia de afinidade (fração não-imunoreativa),foram reconhecidas pelos anticorpos presentes no soroantiveneno (na forma solúvel) quando submetidos a ensaiosde reconhecimento em solução (no ensaio de WB), no qual asmoléculas ficam mais livres para melhor interagir. Estasituação ê mais próxima da realidade (quando o veneno éinjetado no organismo), diferentemente do estado em queficam as moléculas de anticorpo quando imobilizados nacoluna (na cromatografia de afinidade). A etapacromatográfica entretanto foi necessária para identificaçãoda totalidade de proteínas presentes no veneno de abelhas,muitas não visualizadas no perfil do veneno totaldialisado. A detecção de spots não identificados éexplicada pelo fato da sensibilidade de detecção peloanticorpo ser muito maior do que a sensibilidade de

0 detecção por métodos colorimétricos utilizados na coloraçãodo gel. Por isso alguns spots evidenciados na membrana deWestern Blotting não são visíveis no gel 2D.Portanto, todas as proteínas imunoreativas ao soroantiveneno de abelhas, detectadas pel combinação das duasestratégias (cromatografia de afinidade + eletroforese 2D eWestern Blotting) estão listadas na tabela 7:

Tabela 7 - Proteínas imunoreativas ao soro antiveneno detectadas por cromatograíia +eletroforese 2D e Western Blotting

34.4. Ensaios de potência34.4.1 Ensaios biológicos

Todos os ensaios biológicos foram realizados com0 veneno total de abelhas, sem diálise.Ensaios de citotoxicidade e soroneutralização foramrealizados no Instituto Butantan a fim de se estabelecer amelhor proporção veneno:antiveneno para neutralização daatividade citotóxica. Foram testados diferentes tiposcelulares e decidiu-se utilizar as células de ovário dehamster chinês (CHO), por questões de susceptibilidade aoveneno e melhor crescimento celular. O melhor período deincubação das células com o veneno foi de 6 0 minutos.

Realizando-se diluições de veneno para se estabelecera menor concentração de veneno com atividade citotóxica,chegou-se a uma concentração mínima de 108,24 /xg deproteínas de veneno (tabela 8), necessária para matar 100%das células.

Tabela 8 - Atividade citotóxica do veneno total de abelhas, variando a quantidade de venenoutilizada. Controle positivo (meio Egale com 10% SDS - 100% morte) - abs. 0,159; controlenegativo (células em meio Eagle - 100% células vivas) - Abs = 0,020. A concentraçãodestacada em negrito corresponde à quantidade mínima de veneno, suficiente para matar100% das células.

Foram realizados ensaios de soroneutralização,fixando-se esta concentração de veneno e variando-se aquantidade de antiveneno necessária para neutralizar aatividade citotóxica. Chegou-se a uma quantidade de 6277,92ug de proteínas de antiveneno necessárias para neutralizar108,24 ug de proteínas de veneno (tabela 9), ou seja, umaproporção de 1:58 (proteínas de veneno:proteínas de anti-

Abs a550nm

0,0200,0180,0190,0180,0200,1200,1600,160,16

Proteínasveneno(ug)

11.0220.9531.0848,5273,8892,69108,24155,49250,32veneno).

Tabela 9 - Neutralização da atividade citotóxica do veneno de abelhas pelo antiveneno. Foiutilizada uma quantidade fixa de 10824 ug de proteínas de veneno para cada concentraçãodiferente de antiveneno testada. Controle positivo (veneno sem anti-veneno (AV) - 100%morte) - Abs - 0,140): controle negativo (células em meio Eagle - 100% células vivas) -Abs= 0,020. A concentração destacada em negrito corresponde à quantidade de antivenenocapa/, de neutralizar totalmente a atividade citotóxica.

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Foram também realizados testes de atividade hemolíticae soro-neutralização desta atividade pelo antiveneno,semelhantemente ao que foi feito para a determinação daatividade citotóxica do veneno. Considerando-se o perfil daatividade hemolítica do veneno bruto de A. mellifera(tabela 10), foi escolhida a concentração mínima capaz delisar 100% das hemãcias, no caso 0,3125 /xg//xL para osensaios de neutralização com o anti-veneno.

Tabela 10 - Atividade hemolítica do veneno total de abelhas. A concentração evidenciadaem negrito é a mínima capaz de hemolisar 100% das hemácias.

<table>table see original document page 52</column></row><table>Desta maneira, foram realizados ensaios para determinar aquantidade de antiveneno necessária para neutralizar aatividade hemolítica do veneno na concentração de 0,3125fxg/fjLh. Os resultados obtidos (tabela 11) mostram que aproporção de 1:50 ( proteína do veneno: proteína do anti-veneno) foi suficiente para neutralizar a hemólise causadapelo veneno na concentração de 0,3125 /zg//zL.

Tabela'11. Neutralização da atividade hemolítica do veneno pelo antiveneno. Foi utilizadauma concentração fixa de 0.3125ug'üL de proteínas de veneno para cada concentraçãodiferente de antiveneno testada, mostrada como proporção em relação à quantidade deproteínas de veneno. A proporção evidenciada em negrito corresponde à menor quantidade deantiveneno capaz de neutralizar a atividade hemolítica- A V - anti-veneno: hem.- hemólise

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Com base nos resultados obtidos nos ensaios desoroneutralização das atividades hemolítica ecitotóxica (1:50 e 1:58, respectivamente), foiadotada a maior proporção necessária, ou seja, 1:58para realização dos ensiaos de soroneutrali zação daatividade miotóxica do veneno. Esta proporçãoproteínas de veneno:antiveneno mostrou-se eficiente na neutralização da atividade miotóxica testada in vivo,conforme mostra abaixo a tabela 12.Tabela 12 - Atividade miotóxica das amostras de veneno de abelhas e do veneno pré-incubado com o soro antiveneno produzido na proporção 1:58. Os valores mostram que oantiveneno neutralizou a ação miotóxica do veneno de abelhas, reduzindo-a a um valorpróximo à atividade detectada na amostra controle, com solução salina.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

(*) Atividade calculada conforme item 33.7.2.

35. Conclusões a partir dos testes de potência

Os ensaios biológicos para certificação da potência dosoro, ou seja, sua ação neutralizadora, mostraram que osoro antiveneno produzido da forma descrita acima foieficiente na neutralização das atividades citotóxicas,miotóxicas e liberação de creatino-quinase. Além disso, oensaio de Immunoblotting, juntamente com a cromatografia deafinidade, mostrou que 8 diferentes proteínas, totalizando31 quando contabilizadas as isoformas, são reconhecidas(neutralizadas) pelos anticorpos presentes no soroantiveneno.

A dose estimada de veneno inoculado numa vítima adultade peso 70 Kg, que tenha sofrido de 1000 ferroadas (considerada fatal) é 1,3 mg/kg, ouseja, 91 mg total deveneno (Schumacher e Egen, 1995). Considerando-se queaproximadamente 22,5% do peso seco do veneno de abelhas éconstituído de proteínas, e que 1000 ferroadas de abelhascontém aproximadamente 91 mg que a concentração deanticorpos no anti-veneno foi de 20,85 mg/mL, , tem-se:- lmg de veneno bruto de abelhas contem aproximadamente0,22 5mg de proteínas, logo, 9lmg de veneno contem 2 0,4 7 5mgde proteínas;- para neutralizar esta quantidade de proteínas (20,475mg),na proporção testada nos testes de potência (1:58) sãonecessárias 1187,55mg de proteínas do anti-veneno;

- na concentração 20,85mg de proteínas por mL de soro, sãonecessários 56,95 mL DE SORO PARA NEUTRALIZAR A AÇÃO DE1000 FERROADAS DE ABELHAS;

O valor calculado acima está na mesma faixa deeficiência dos melhores anti-venenos (ofídicos, aracnídicose escorpionídicos) produzidos no mundo.36. Procedimentos e Considerações Finais3 6.1. Data de Fabricação

A data de fabricação do soro produto acabado a granelé aquela correspondente ao dia da formulação do produtoacabado a granel.

3 6.2. Estocagem dos Lotes do Soro Produto Acabado a Granel

Após a retirada das amostras, os frascos ou bolsas dosoro produto acabado a granel são armazenados em câmarafria à temperatura de 2°C a 8°C até a liberação dosresultados pelo Serviço de Controle de Qualidade.

36.3. Arquivo de Amostras

De cada lote de soro produto acabado a granel éretirada uma amostra e conservada à temperatura de 2°C a8°C, devidamente identificada, por 60 meses a partir dadata da ultima prova de potência.

36.4. Registros

Os dados do processo de fabricação de cada lote desoro produto acabado a granel e os resultados das provas decontrole, são registrados e arquivados. As cópias destasdocumentações são arquivadas na Seção de Processamento dePlasmas Hiperimunes.36.5. Liberação do Soro Produto Acabado a Granel peloServiço de Controle de Qualidade Interno.

Após a liberação dos resultados pelo Serviço deControle de Qualidade, o produto recebe a etiqueta de"APROVADO" e aguarda a ordem de envase emitida pela Divisãode Desenvolvimento Tecnológico e Produção.

36.6. Reprocessamento

O soro acabado a granel poderá ser reprocessado porordem da Diretoria de Divisão de DesenvolvimentoTecnológico e Produção após liberação dos resultadosemitidos pelo Serviço de Controle de Qualidade na seguintesituações:

a) Reprovado no teste f isico-químico tais como:concentração de fenol, concentração de cloreto de sódio epH. Em caso de excesso destes elementos, o produto acabadoa granel deverá ser submetido ao processo de dessanilizaçao(IB/POP/PS/P-004) e concentração e receber novo número delote de soro concentrado a granel.

b) Reprovado no teste biológico de potência. Neste caso osoro acabado a granel deverá ser concentrado e receber novonúmero de lote de soro concentrado a granel.

c) Reprovado no teste biológico de pirogênio "In Vivo" emicrobiológico de esterilidade. Nestes casos os sorosacabados a granel deverão ser submetidos a cromatografia emgel de troca iônica e concentração e receber novo número delote de soro concentrado a granel.

36.7. Descarte

O soro acabado a granel poderá ser descartado porordem da Diretoria de Divisão de DesenvolvimentoTecnológico e Produção se após o reprocessamento, forreprovado nos testes de controle de qualidade. Além disso, poderá ser aproveitado para ensaios "In Vitro" de pesquisa e desenvolvimento. O soro produto acabado a granel e outros materiais a serem descartados são colocados a disposição da Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção mediante ofício emitido pela Seção de Processamento de Plasmas Hiperimunes.

3 6.8. Expedição do Soro Produto Acabado a Granel

Com ordem de envase expedida pela Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção, o produto é encaminhado para o envase com a respectiva documentação de produção.

36.9. Prazo de Validade

O prazo de validade do lote final de soro heterólogo é de 36 meses contados a partir da data de fabricação do produto acabado a granel.

A presente invenção apresenta o processo de obtenção de soro eqüino antiveneno de abelha. Embora a invenção tenha sido ilustrada com exemplo no qual as etapas são específicas, o mesmo se destina a ser típico do processo em geral, não limitando de maneira alguma o escopo da invenção. 37. REFERÊNCIAS:

Candiano, G., Bruschi, M. , Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M. , Carnemolla, B. , Orecchia, P., Zardi, L. , and Righetti, P. G. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 25: 1327-1333, 2004.de Souza, B. M. ; Mendes, M. A.; Santos, L. D.; Marques, M. R.; César, L. M.; Almeida, R. N. A.; Pagnocca,F. C; Konno, K. ; Palma, M. S. Structural and functional characterization of two novel peptide toxins isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista. New York, Peptides, v.26, p.2157-64, 2005 5 Schumacher, M.J.; Egen, N.B. Significance of

Africanized bees for public health. Arch Intern Med., v.155, p.2038-2043, 1995.

Sedmak, J.J.; Groosberg, S. E. A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue 10 G-250. Analytical Biochemistry, v.79, p. 544-552, 1977.

Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. Anal. Chem. 68, pp.850-858, 1996.

Rocha T.; Barros L.L.S.; Santos L.D.; De Souza, B.M.; Palma M.S; Cruz-Hõfling M.A. Phospholipase A2 and mastoparan from 15 Polybia paulista wasp venom on mice skeletal muscle. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis. v.13(1), 2007.

Claims (18)

1. Processo de obtenção de soro eqüino antiveneno de abelha caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:a) extração do veneno total de Apis mellifera ssp. manualmente ou método automatizado;b) imunização de cavalos utilizando o veneno total de Apis mellifera ssp. com as diversas frações protéicas; ec) purificação de IgG total dos antissoros, através da mistura e processamento com ácido caprilico ou outro método por diferença de solubilidade e tratamento enzimático por pepsina.

2. Processo de obtenção de soro eqüino antiveneno de abelha, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa de purificação foi introduzido um conjunto de novos ensaios, que permitiu a visualização de proteínas danosas para a saúde das vitimas de ferroas de abelhas e acertando as variáveis experimentais das colunas de purificação do soro, para incluir os anti-corpos contra tais proteínas.

3. Processo de obtenção de soro eqüino antiveneno de abelha, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa de purificação foram realizados pequenos ajustes em valores pH (medida de acidez), temperatura, fluxo e escolha das resinas, de forma a neutralizar as proteínas desconhecidas do veneno.

4 . Processo de obtenção de soro eqüino antiveneno de abelha, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as proteínas são: transferina, alfa-glicosidase, Protease homóloga à proteinase 26,29kDa deSarcophaga, Proteína Kruppel-like, MRJP1, MRJP2,Similar a CG15011-PA, proteína com domínio de dedo de zinco, proteína similar a Stretchin-Mlck (quinase de cadeia leve da miosina) CG18255-PA, isoform A e similar aos fatores PDGF- e VEGF- (CG7103-PA).

5. Método de reconhecimento de elementos caracterizado pelo fato de utilizar os seguintes ensaios imunológicos:a) cromatografia de afinidade;b) análise proteômica;c) immunoblotting do gel 2D; ed) citotoxicidade.onde, estes ensaios são realizados de forma independente um do outro e produzem resultados que podem ser analisados também de forma independente.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracter i zado pelo fato de que a realização da cromatografia de afinidade exige a imobilização do soro anti-veneno de abelhas em coluna de Sepharose, seguido da cromatografia propriamente dita.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, carac ter i zado pelo fato de que na imobilização do soro antiveneno de abelhas em resina de Sepharose, foi utilizada, a Sepharose 4B ativada por CNBr (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia), a quantidade de ligante (soro antiveneno de abelhas) imobilizado foi estabelecida experimentalmente em 30mg de proteínas (IgG) para lg de resina, a ligação das proteínas do soro antiveneno de abelhas à resina de Sepharose 4B foi feita à temperatura ambiente sob agitação constante, sem a utilização de agitador magnético, o ligante foi dissolvido em tampão deligação (solução de NaHC03 0,1M em pH 8,3, contendo 0,5 M NaCl), o excesso de ligante foi lavado com 15 volumes do tampão de ligação, para bloquear quaisquer grupos reativos, a resina com ligante foi transferida para uma solução tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0, após 2 horas, o excesso de proteínas do soro antiveneno, que não se ligou à resina, foi lavado com pelo menos três ciclos alternados de pH ácido e básico, utilizando-se as soluções: tampão acetato de sódio 0,1M pH 4,0 (contendo 0,5M NaCl), seguido de lavagem com solução tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 (contendo 0,5M NaCl), para garantir que nenhuma molécula livre do ligante permanecesse acoplada ao ligante imobilizado e a coluna foi equilibrada com este mesmo tampão.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que na cromatograf ia propriamente dita o veneno utilizado foi dialisado contra uma solução contendo: PMSF lmM (inibidor de serinoproteases), leupeptina 2x10-3 mM (inibidor de serinoplasmina, porcina e cisteina proteáses) e EDTA lOOmM (inibidor de metaloproteases); sendo posteriormente liofilizado, foi utilizada a razão de 1:24 vezes (proteínas do veneno: proteínas do soro), foi utilizada uma coluna de 20mL de resina Sepharose 4B, o veneno foi solubilizado em 3mL de solução (NH4)HC03 lOmM pH 6,8 e aplicado na coluna, primeiramente foi realizada uma lavagem da coluna, para eluição de todas as frações não imunoreativas ao soro antiveneno de abelhas imobilizado em Sepharose 4Bm, para isso utilizou-se tampão Tris-HCl 0,1M pH 8 contendo NaCl 0,15M, a eluição foi monitorada por. medidas de absorbância em 280 nm, até que a leitura atingisse o valor zero, sendocoletadas frações de 15mL, para eluição da fração ácida ligada à resina, utilizou-se tampão Tris-Glicina 0,05M pH 2,8, contendo NaCl 0,15M, para a posterior eluição das proteínas básicas ligadas à resina foi utilizado tampão Tris-HCl 0,1M pH 11,0, as frações correspondentes a cada pico eluido foram reunidas, e então dialisadas para remoção do excesso de sal, incompatível com os protocolos experimentais subseqüentes (eletroforese bidimensional).

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os resultados obtidos nos ensaios biológicos foram estabelecidos também em uma razão de 1:58.

10. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a realização de análise proteômica requer a separação dos componentes do veneno de abelhas onde foram utilizadas para preparação da amostra, para os ensaios de eletroforese 2D, veneno bruto total dialisado na presença de inibidores de protease (EDTA, PMSF e leupeptiha), das frações do veneno bruto coletadas na cromatografia de exclusão molecular, da fração que não se ligou a resina da coluna de imunoafinidade (não imunoreativas) e das frações ácida e básica que se ligaram à coluna de imunoafinidade (imunoreativas).

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a realização de análise proteômica compreende as etapas de:primeira dimensão (Focalização isoelétrica) IEF, para realização da IEF as proteínas foram solubilizadas em uma solução de re-hidratação (DeStreak acrescido de 0,5% de tampão IPG (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia)e azul de bromofenol, ' as fitas para imobilização de proteínas (Immobiline Dry Strips - IPG), pH 3-10, foram re-hidratadas nesta solução de proteínas por 15H e submetidas ao IEF em um sistema IPGphor (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia) a 500Vh, lOOOVh e 8000Vh; esegunda dimensão - SDS-PAGE, após a primeira dimensão as fitas de IPG foram incubadas em tampão de equilíbrio 1 (75mM Tris-HCl, pH 8,8; uréia 6M; 30% de glicerol; lOmg/mL DTT; 2% SDS; iodoacetamida e azul de bromofenol), durante 15 minutos para a redução das pontes dissulfeto e por mais 15 minutos em tampão de equilíbrio 2 (mesmo solução, entretanto substituindo-se DTT por 25mg/mL de iodoacetamida) para alquilação destas pontes, as fitas foram então transferidas para os géis de 12,5% de poliacrilamida contendo SDS; a corrida dos géis teve duração de aproximadamente 5 horas; os géis foram então corados com Commassie Blue Coloidal, segundo descrito por Candiano et al, ou com nitrato de prata, dependendo da quantidade de proteínas, os "spots" selecionados foram então recortados manualmente e submetidos à digestão e extração dos fragmentos trípticos gerados.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteri zado pelo fato de que a identificação de proteínas exige que os "spots" sejam removidos de proteínas do gel de eletroforese bidimensional, seguido da digestão destas proteínas com tripsina, do seqüenciamento peptidico dos fragmentos gerados na digestão triptica, por análises de espectrometria de massas e da identificação funcional propriamente dita, com o uso de ferramentas de bioinformática.

13. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ensaio de Immunoblotting identifica as proteínas diferentes reconhecidas pelos anticorpos do soro antiveneno, onde os ensaios biológicos para certificação da potência do soro, ou seja, sua ação neutralizadora, demonstram que o soro antiveneno produzido da forma descrita acima foi eficiente na neutralização das atividades citotóxicas, miotóxicas e liberação de creatino-quinase.

14. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que nos ensaios de citotoxicidade foram testados diferentes tipos celulares (L-929 - células de inseto, CRFK - células de rim de gato, MDBK - células de rim de boi e CHO - células de ovário de Hamster Chinês), em placas de cultura de 96 cavidades.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os ensaios de citotoxicidade compreendem as etapas de: diluições seriadas do veneno em meio Eagle com 10% de S FB ;acréscimo de 5 x 105 células/cavidade, exceto na primeira coluna para leitura do branco,incubação das placas em estufa 36,5°C com 5% de C02;fixação das células com acetona 80% a -20°C por 10 minutos;secagem da placa e adição de lOOuL por cavidade de Azul de Evans 1:10.000;incubação das células em estufa a 36,5°C por 1 hora para que as células vivas fossem coradas;lavagem das células com PBS para retirar o excesso decorante;acréscimo de lOOuL de PBS com 10% de SDS (Sódio Dodecil Sulfato), a fim de romper a membrana das células fixadas, liberando o corante; erealização da leitura no leitor de Elisa.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a incubação das placas em estufa 36,5°C com 5% de C02 ocorre em periodos de 1, 2, 3, 4 ou 24 horas.

17. Soro eqüino antiveneno de abelha caracteri zado pelo fato de compreender a composição básica:- 0,70% a 0,90% de cloreto de sódio, baseado no peso total do produto acabado;- até 0,3 de nitrogênio não proteico, baseado no peso total do produto acabado;até 15% de proteínas (fragmentos de Imunoglobulinas G), baseado no peso total do produto acabado;até 20% de sólidos totais, baseado no peso total do produto acabado.

18. Soro eqüino antiveneno de abelha, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de apresentar uma faixa de pH entre 6,0 e 7,0.