BRPI0804652B1 - Processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha - Google Patents

Abstract

SORO EQÜINO ANTIVENENO DE ABELHA, MÉTODO DE RECONHECIMENTO E PROCESSO DE OBTENÇÃO DO MESMO A presente invenção refere-se a um novo soro eqüino antiveneno de abelha (Apis mellifera ssp.), o método de reconhecimento e seu respectivo processo de obtenção, utilizando, como antígeno, o veneno de Apis Mellifera ssp. integral.

Description

A presente invenção refere-se a um novo soro equino antiveneno de abelha (Apis mellifera ssp.), o método de reconhecimento e seu respectivo processo de obtenção, utilizando, como antígeno, o veneno de Apis Mellifera ssp. integral.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

No Brasil o gênero Apis, família Apidae, compreende as subespécies Apis mellifera mellifera, Apis mellifera adansonni, Apis mellifera scutellata e Apis mellifera ligustica (Sort; Gonçalves, 1994) e seus híbridos, sendo popularmente conhecidas como abelhas africanizadas. Essas abelhas pertencem à fauna brasileira produtora de mel e foram trazidas de diversas localidades, tais como: Suíça, Itália, Rússia e África. As abelhas híbridas, cruzamento das abelhas de, origem europeia com africanas, são encontradas em todo território brasileiro, e a sua presença se estende até à Argentina como também no Arizona, Novo México, Califórnia e Nevada (Schumacher; Egen, 1995).

Em seu conjunto, os acidentes por ataque maciço de abelhas ainda são um sério problema de saúde pública no” Brasil, contudo a falta de um estudo epidemiológico preciso faz com que existam poucas referências ao tratamento preciso aos sintomas sistêmicos. Em 1985 a estimativa era de que as abelhas africanizadas teriam causado entre 700 a 1.000 mortes (Taylor, 1986). Aproximadamente 2.462 casos de acidentes por ataque de abelha foram notificados no estado de São Paulo nos anos de 1993 a 1998 com um total de sete óbitos (Divisão de Zoonoses/CVE Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo).

Apesar de apresentar apenas 0,38% de óbitos dos acidentes por ferroada de abelhas, devido aos hábitos desta espécie os ataques maciços são extremamente severos, O veneno de Apis mellifera ssp. apresenta elevada toxicidade quando comparado a outros venenos da ordem Himenóptera; entretanto, sua toxicidade sistêmica está relacionada à capacidade da abelha em inocular elevada quantidade de veneno devido a um ataque de 50 ou mais ferroadas. As principais atividades biológicas do veneno de abelha são proteolítica, hemorrágica, mionecrótica, coagulante, edemaciante e hemolítica direta e indireta.

Há muito, o tratamento empregado nos acidentes por envenenamento de abelha são de suporte, principalmente a administração de antihistamínico, corticosteróides, broncodilatadores, vasodilatadores, bicarbonato, manitol, adrenalina e ventilação mecânica.

De acordo com os documentos US6649166B1 e US6780416B1, foram requeridas composições farmacêuticas compostas a partir de proteínas e peptídeos de veneno de abelha previamente isolados ou sintetizados quimicamente. A Patente US 6,649,166 descreve a produção de um peptídeo natural ou sintético que levara a dessensibilização do paciente que tem alergia ao veneno de abelha. Na patente se descreve todo o mecanismo de hipersensibilidade tipo I (alergia e choque anafilático) causado pelo veneno de abelha e modo de interação do peptídeo elaborado sobre as células e receptores do sistema imunológico o qual leva a diminuição de IgE no soros do paciente. A Patente 6,649,166 não reivindica a produção de nenhum fator neutralizante da atividade tóxica do veneno, apenas a dessensibilização do indivíduo alérgico ao veneno.

No estado da técnica não tem se apresentado soros que tenham a capacidade de reconhecerem as toxinas que compõem o veneno total com alta eficiência de soroneutralização.

A eficiência no tratamento dos acidentes por envenenamento por ferroada de abelha é determinada pela especificidade dos anticorpos presentes no soro antiveneno empregado, ou seja, pela capacidade desses reconhecerem as toxinas que compõem o veneno total. Apesar da eficácia da soroterapia, a administração do soro pode determinar diferentes reações adversas como a hipersensibilidade imediata observada em alguns casos, devida à presença de proteínas heterólogas no soro.

A produção de antiveneno de abelha em equinos com altos títulos neutralizantes para a atividade tóxica, por muito tempo, foi um desafio para o setor de produção de soros terapêuticos humanos.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DA INVENÇÃO

O primeiro objeto da presente invenção consiste em um soro equino antiveneno de abelha (apis mellifera ssp.).

O soro da presente invenção é usado em todos os casos que forem detectados intoxicação por veneno de abelha, independente de risco de morte ou não. Na prática, todas as vezes em que ocorrem acidentes com múltiplas ferroadas de abelhas, as vítimas se tornam sujeitas a efeitos danosos (lesões a tecidos vitais) de curto ou , longa prazo. Existem relatos de literatura de danos tardios aos rins, fígado ou coração, em pessoas que foram vítimas deste tipo de acidente (e não receberam soro antiveneno de abelhas), e que sobreviveram, porém apresentaram problemas de saúde relacionados a tais acidentes.

Um segundo objeto da presente invenção é determinar um método de reconhecimento de elementos.

Um estudo original sobre a resposta de anticorpos neutralizantes contra o veneno de abelha do gênero Apis permitiu a identificação de diversas frações que possuem atividade biológica e conseqüentemente algumas frações podem apresentar atividade patogênica. Até o estudo das frações protéicas do veneno total de Apis mellifera ssp., e caracterização de suas propriedades, não era possível obterem-se soros heterólogos capazes de neutralizar suas toxinas de forma eficiente. O estudo das frações do veneno total, e subseqüente imunização de cavalos, possibilitou a obtenção efetiva de soros neutralizantes eficazes na proporção de 1:58, ou seja, 1 parte de veneno para 58 partes de antiveneno, em microgramas, para estudo de soro neutralização em cultura de células e inibição da atividade hemolítica, para uso terapêutico em humanos.

Um terceiro objeto da presente invenção é obter um processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha (apis mellifera ssp.). O processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha da presente invenção prevê, pelo menos, as seguintes etapas: a) extração do veneno total de Apis mellifera .ssp. manualmente ou por método automatizado; b) imunização de cavalos utilizando o veneno total de Apis mellifera ssp. com as diversas frações proteicas; e c) purificação de IgG total dos antissoros, através da mistura e processamento com ácido caprílico ou outro método por diferença de solubilidade e tratamento enzimático por pepsina.

O processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha (apis mellifera ssp.) da presente invenção, conforme o fluxograma da Figura 1 consiste- inicialmente na extração do veneno de abelha {Apis mellifera ssp.) com suas frações protéicas (1).

Estas frações são caracterizadas utilizando 15 como fase fixa (gel) esférica composta de dextran e agarose ligadas ao brometo de cianogênio para conjugação ao antiveneno de abelha e caracterização das frações a serem reconhecidas por cromatografia de afinidade. Como fase móvel (eluente) utiliza-se solução tampão pH 2,8 ou solução 20 tampão pH 10.0, sendo assim obtidas 3 frações distintas visíveis no cromatograma após análise em UV a 280nm.

O veneno de abelha possui duas frações, uma com Mr entre 14.000 - 97.000 e outra inferior a 5.000. O veneno total de Apis mellifera ssp. foi testado em cultura de 2 5 células quanto a sua ação tóxica e também quanto a sua atividade hemolítica direta.

A imunização de cavalos é realizada utilizando- se o veneno de Apis mellifera ssp. com diversas frações protéicas (2), preferencialmente fosfolipase A2 (diversas 30 isoformas), fosfatase ácida, hialuronidase, Proteínas

Abundantes de Geléia Real (MRPJ)-9, Fatores de Crescimento Derivados de Plaqueta (PDGF) e Fatores de Crescimento Endotelial vascular (VEGF), melitina, MRJP-1, precursor de melitina, transferrina, alfa-glicosidase, MRJP-2 e MRJP-8.

A etapa de imunização (3) é realizada através de doses por via intramuscular em concentração preferencial de 2,5 mg/ml, particularmente em emulsão dupla ãgua/óleo/água acrescido do Bacilo de Calmet-Guerin (BCG) morto pelo calor, e a última dose na mesma concentração em solução fisiológica tamponada pH 7,2.

As doses são administradas em intervalos de 15 ou 5 dias e após 7 dias da última dose é realizada a sangria de prova (4) para determinação do título de anticorpos neutralizantes do efeito citotóxico e inibidor de hemólise direta do veneno de Apis mellifera ssp. Somente os cavalos com título superior a 1:10 (1 parte de veneno para 10 partes de antiveneno) são sangrados.

A purificação de IgG total dos antissoros (5) é realizada preferencialmente através da mistura e 20 processamento com ácido caprílico ou outro método por diferença de solubilidade e tratamento enzimático da pepsina.

O antiveneno em questão deverá reconhecer por método imunológico ("immunobloting 2D", ensaio 25 imunoenzimático, imunoeletroforese ou imunodifusão dupla radial) obrigatoriamente as seguintes frações: transferrinas, MRJP-2, MRJP-9, alfa-glicosidase, serino- quinase, cisteíno-protease, proteína similar à Kruppel, proteínas com domínio de dedo de zinco e proteínas 30 relacionadas ao PDGF e VEGF.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta um fluxograma com as etapas do processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha da presente invenção.

A Figura 2 apresenta um esquema da cromatografia de imunoafinidade em Sepharose 4B ativada com CNBr .

A Figura 3 apresenta um perfil proteico, em eletroforese 2-D, do veneno bruto dialisado na presença dos 10 inibidores de protease EDTA, PMSF e Leupeptina.

A figura 4 apresenta um gel da fração não imunoreativa (eluída em pH 8,0) na faixa de pi 3 a 10, corado com CBB G-250 (300μg de proteínas).

A figura 5 apresenta um Gel da fração imunoreativa eluída em pH ácido (2,8) - na faixa de pi 3 a corado com CBB G-250 (300μg de proteínas).

A figura 6 apresenta um Gel da fração imunoreativa eluída em pH básico (10,7) - na faixa de pi 3 a 10, corado com CBB G-250 (300μg de proteínas).

A figura 7 apresenta um imagem do WB feito com soro antiveneno de abelhas (11,6 mg de proteínas), a partir de 200ug de proteínas de veneno total de abelhas dialisado em gel SDS PAGE 12,5%(m/v) 7cm e pi 3 a 10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. PREPARO DE ANTÍGENO E IMUNIZAÇÃO DOS CAVALOS 1.1. De acordo com o boletim de imunização executado pelo Serviço de Imunologia do Butantan. 1.1.1. Verificar o número de cavalos a serem imunizados. Exemplo: 11 cavalos - acrescentar 20% sobre do número de cavalos, resultando em 13 cavalos. Portanto o antígeno deverá ser preparado para 13 cavalos 1.1.2. Verificar a quantidade inoculada para todas as doses, 5 O NUMERO DE DOSES DESCRITOS TOXICIDADE DO VENENO. Io dose 7,5 mg em emulsão múltipla completa (EMC) 2o dose 2,5 mg em emulsão múltipla incompleta (EMI) 3o dose 2,5 mg em solução salina 10 4o dose 2,5 mg em solução salina Total de veneno = 15 mg 1.1.3. Multiplicar a quantidade total de veneno pelo número de cavalos

Exemplo: 15 mg veneno x 34 cavalos = 510 mg 15 Portanto para todo o esquema de imunização com 34 cavalos, utiliza-se 510 mg de veneno 1.2. Pesagem do veneno 1.2.1. Ligar a câmara de exaustão. 1.2.2. Pesar na balança analítica com o auxílio da espátula 20 e do frasco de fundo chato, o quantitativo de veneno de acordo com a dosagem preparada. 1.2.3. Após a pesagem, transferir o veneno para um erlenmeyer; colocar a barra imantada e acrescentar a solução salina 0,85%, a fim de atingir uma concentração 25 final delO mg/mL. 1.2.4. Dissolver o veneno na de salina 0,85% Obs: O veneno de abelha deverá ser filtrado em membrana de 0,22μ de porosidade. 1.3. Preparo do antígeno 30 De acordo com o boletim de imunização preparar a solução: 1.3.1 Emulsão Múltipla Completa (EMC) O antígeno EMC é composto de: - 25 % de solução salina 0,85% + solução de veneno 5 - 25 % de mistura oleosa marcol montanide (adjuvante ISA 50 da Seppic®) - 50 % de solução salina 0,85% + solução tween 80 a 2% BCG (Bacilo de Calmett Guerin) é adicionado na concentração de Img/mL da mistura marcol montanide. 10 1.3.1.1. Cálculo: Imunização EMC para 34 cavalos

Exemplo: 10 mL de solução EMC contendo 7,5 mg de veneno Multiplicar a quantidade de veneno a ser inoculado pelo número de cavalos Portanto, obter 25,5 mL de solução salina 0,85% de uma solução de veneno a lOmg/mL 2 0 Multiplicar o volume de solução EMC a ser inoculado pelo número de cavalos 10 mL x 34 = 340 mL antígeno EMC Portanto em 340 mL de EMC teremos: 85 mL de solução salina 0,85% + veneno = ( 59,5 mL de 25 solução salina 0,85 % + 25,5 mL de solução de veneno) 85 mL de solução Marcol Montanide 170 mL de solução Yween 2% 85 mg de BCG 1.3.2 Emulsão Múltipla Incompleta (EMI) 30 O antígeno EMI é composto de: - 25 % de solução salina 0,85% + solução de veneno - 25 % de mistura oleosa marcol montanide (adjuvante ISA 50 da Seppic®) - 50 % de solução salina 0,85% + solução Tween 80 a 2% 5 1.3.2.1. Cálculo: Imunização EMI para 34 cavalos

Exemplo: 10 mL de solução EMI contendo 2,5 mg de veneno multiplicar a quantidade de veneno a ser inoculado pelo número de cavalos Portanto, obter 8,5 mL de solução salina 0,85% de uma solução de veneno a lOmg/mL 15 Multiplicar o volume de solução EMI a ser inoculada pelo número de cavalos 10 mL x 34 = 340 mL de antígeno EMI Portanto em 340 mL de EMI temos: 85 mL de solução salina 0,85% + veneno = (76,5 mL de 20 solução salina 0,85 % + 8,5 mL de solução de veneno) 85 mL de solução marcol montanide 170 mL de solução entre 2% 1.3.3. Antígeno PBS (tampão fosfato salina) O antígeno PBS é composto de: 25 solução PBS + solução de veneno 1.3.3.1.Cálculo: Imunização PBS para 34 cavalos

Exemplo: 10 mL de solução PBS contendo 2,5 mg de veneno Multiplicar a quantidade de veneno a ser inoculada pelo número de cavalos 30 2,5 mg x 34 = 85 mg Portanto, obter 8,5 mL de solução salina 0,85% de uma 5 solução de veneno a lOmg/mL Multiplicar o volume de solução PBS a ser inoculada pelo número de cavalos 10 mL x 34 = 340 mL de antígeno PBS Portanto em 340 mL de PBS teremos: 10 331,5 mL de solução PBS + 8,5 mL solução veneno 2. Preparo de Antígeno EMC 2.1 Medir na proveta 25,5 mL da solução de veneno e completar para (85mL) com solução salina 0,85% 2.2 Medir na proveta 85 mL de marcol montanide (ISA 50 15 Seppic®) e transferir a solução para o becker. Em seguida, acrescentar o BCG. 2.3 Adicionar a solução de veneno (85mL) lentamente no becker, homogeneizando com o emulsificador até a formação de uma emulsão branca, firme e estável, que pode ser 20 verificado depositando uma gota de emulsão com auxílio do bastão de vidro na superfície da água na placa de petri. Se a emulsão estiver satisfatória, a gota de emulsão permanecerá integra na forma de um botão. 2.4 Uma vez formada a emulsão, acrescentar com o auxílio de 25 uma proveta 170 mL de solução salina 0,85% + solução entre 2.5 a 2% e homogeneizar o antígeno, utilizando o emulsificador. 2.6 Distribuir o antígeno nos frascos de vidro, devidamente identificados com o serviço, tipo de antígeno, turma, n° de 30 cavalos, o volume e a data. 2.7 Acondicionar os frascos na caixa de isopor com gelo reciclável, a temperatura de 2°C a 8°C, para ser usado na imunização. 3. Preparo de Antígeno EMI 3.1 Medir na proveta 25,5 mL da solução de veneno e completar para (85mL) com solução salina 0,85% . 3.1 Medir na proveta 85 mL de marcol montanide (ISA 50 Seppic®) e transferir a solução para o becker. 3.2 Adicionar a solução de veneno (85mL) lentamente no 10 becker, homogeneizando com o emulsificador até a formação de uma emulsão branca, firme e estável, que pode ser verificado depositando uma gota de emulsão com auxílio do bastão de vidro na superfície da água na placa de petri. Se a emulsão estiver satisfatória, a gota de emulsão 15 permanecerá integra na forma de um botão. 3.3 Uma vez formada a emulsão, acrescentar com o auxílio de uma proveta 170 mL de solução salina 0,85% + solução entre 80 a 2% e homogeneizar o antígeno, utilizando o emulsificador. 3.5 Distribuir o antígeno nos frascos de vidro, devidamente identificados com o serviço, tipo de antígeno, turma, n° de cavalos, o volume e a data. 3.6 Acondicionar os frascos na caixa de isopor com gelo reciclável, a temperatura de 2°C a 8°C, para ser utilizado 25 na imunização. 4. Preparo de Antígeno PBS 4.1 Medir na proveta 25,5 mL da solução de veneno e completar para 340mL com solução PBS 7.2, adicionar a barra imantada e colocar na chapa do agitador magnético. 4.2. Distribuir o antígeno nos frascos de vidro, devidamente identificados com o serviço, tipo de antígeno, turma, n° de cavalos, o volume e a data. 4.3 Acondicionar os frascos na caixa de isopor com gelo reciclável, a temperatura de 2°C a 8°C, para ser utilizado na imunização.

5. Processo de Imunização de Equinos

São utilizados animais sadios pesando ao redor de 370 a 400 quilos e negativos aos testes de anemia infecciosa.

5.1 Esquemas de Imunização:

IMUNIZAÇÃO DE BASE 1° DIA 1x0 ml de E.M.C. contendo 0, Img de veneno - Aplicar em 2 pontos (0,5ml/ponto), na tábua do pescoço lado esquerdo. 4o DIA 1/0 ml de E.M.C. contendo 0, lmg de veneno - Aplicar em 2 pontos (0,5ml/ponto), na tábua do pescoço lado direito. 19° DIA 2,0 ml de PBS contendo 0,2 mg de veneno - Aplicar em 4 pontos (0,5 ml/ponto) , 2 pontos de cada lado da tábua do pescoço ao redor dos granulomas 23° DIA 4,0 ml de E.M.I. contendo 0,5 mg de veneno - Aplicar em 8 pontos (0,5ml/ponto), 4 pontos de cada lado do dorso 27° DIA 4,0 ml de PBS contendo 1,0 mg de veneno - Aplicar em 4 pontos (1,Oml/ponto) , 2 pontos de cada lado do dorso próximos dos granulomas. 30° DIA 4,0 ml de PBS contendo 2,5 mg de veneno - Aplicar em 4 pontos (1,Oml/ponto) , 2 pontos de cada lado do dorso próximos dos granulomas + Sangria Exploradora 34° DIA 4,0 ml de PBS contendo 5,0 mg de veneno - Aplicar em 4 pontos (1,Oml/ponto) , 2 pontos de cada lado do dorso proximo dos granuloma 38° DIA Sangria Exploradora 3 9 ° DIA 1 * Sangria 41° DIA 2* Sangria + Plasmaferese 43° DIA 3* Sangria + Plasmaferese REIMUNIZAÇÃO 10,0 ml de E. M. I. contendo 7,5 mg de veneno - Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso. 12° DIA 10,0 ml de Salina contendo 2,5 mg de veneno 10 - Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso. 14a DIA 10,0 ml de Salina contendo 2,5 mg de veneno - Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso. 16° DIA 10,0 ml de Salina contendo 2,5 mg de veneno - Aplicar em 5 pontos (2,Oml/ponto) no dorso. 22° DIA Sangria Exploradora 23 ° DIA Ia Sangria 26° DIA 2* Sangria + Plasmaferese 28° DIA 3* Sangria + Plasmaferese 6. Sangria: São feitas 3 sangrias, cada uma equivalente a 2% do peso do animal, em sangue total, com urn periodo de 24 horas entre as sangrias. O sangue é recolhido por punção jugular, em bolsas (PVC atóxica) duplas, esterilizadas por radiação gama. A primeira bolsa que recebe o sangue é equipada com 25 agulha, e contém solução anticoagulante (dextrose, citrato de sódio e ácido cítrico).7. Separação do plasma: Imediatamente após a sangria, as bolsas são colocadas em câmara-fria, a 5°C (±1°C) e após 24 horas, o plasma é 30 transferido para a segunda bolsa, que será enviada à Seção de Processamento de Plasmas Hiperimunes.8. Plasmaferese:

As hemácias que restam na bolsa de coleta de sangue são ressuspensas com, aproximadamente, 1 (um) litro de 5 solução salina apirogênica 0,85%, e reinfundidas no mesmo cavalo doador (grupo sanguíneo homólogo) no processo chamado plasmaferese.9. Rendimento em plasma: Em média, é obtido um rendimento de 65%, em relação ao 10 volume de sangue extraído. Nota: As sangrias e plasmaferese são feitas assepticamente, através de sistema fechado, impedindo contaminações bacterianas ou fúngicas no sangue e no plasma.10. Plasma Individual

É o plasma obtido da sangria de um único animal.11. Plasma a granel É o plasma obtido através de mistura de dois ou mais plasmas individuais.12. Soro Concentrado a Granel Volume de soro obtido a partir do plasma a granel após purificação, digestão, tratamento por cromatografia, dessalinização, concentração e filtração esterilizante. 13. Soro Concentrado Acabado a Granel Soro concentrado a granel aprovado nos testes do Serviço de Controle de Qualidade.14. Soro Produto Acabado a Granel

Preparação estéril de imunoglobulinas purificadas e diluídas, contidas em um ou mais recipientes, provenientes 3 0 de um ou mais soros concentrados acabados a granel, de composição uniforme e com características de qualidade estabelecidas pelas normas técnicas de produção e controle de qualidade.15. Preparo do Plasma a Granel

A partir de plasmas de bolsas estéreis é processado um único lote de plasma a granel, no mínimo de 100 litros e no máximo de 300 litros. O número do lote é designado: inicialmente pela sigla "IB" e a seguir pela abreviação do serviço ao qual o cavalo foi imunizado, ex. : B - serviço antibotrópico; C - serviço anticrotálico, Ab - Abelha e por 3 dezenas separadas por hífen que correspondem: Ia dezena - corresponde ao número seqúencial de lotes do mesmo serviço 2* dezena - corresponde ao ano de fabricação 3 * dezena - corresponde ao número seqúencial de lotes totais produzidos 16. Fracionamento do Plasma a Granel

O fracionamento do plasma a granel se dá por diferença de solubilidade ao adicionar sais neutros, especificamente o sulfato de amónio, também por termocoagulaçao e tratamento enzimático com pepsina. 16.1. Por diferença de solubilidade, tratamento enzimático e termocoagulação. 16.1.1. Primeiro Procedimento de Precipitação Após a mistura, o plasma a granel é mantido sob agitação no tanque de reação 01 e adicionado solução de sulfato de amónio 50% até uma saturação final ao redor de 29%, que é determinada por condutividade após 30 minutos de agitação. Após este período, o pH é ajustado para 6.8 - 6.9 com solução de ácido cítrico 40% ou solução de hidróxido de sódio 40%, dependendo do pH inicial da mistura de plasma. Em seguida a solução é mantida sob agitação por mais 3 0 minutos e ao fim deste período, permanecerá em repouso no mínimo por 4 horas. Após o repouso da solução, as duas 5 fases formadas (sólida e líquida) são separadas por centrifugação. Denomina-se sobrenadante à fase líquida e precipitado à fase sólida. No primeiro procedimento recupera-se o precipitado e descarta-se o sobrenadante.

16.1.2. Segundo Procedimento de Precipitação

O precipitado obtido do primeiro procedimento é diluído com água para injetáveis no tanque de reação 02 sob agitação, de modo que se obtenha uma concentração de proteínas igual ou menor que 4g% e uma saturação de sulfato de amónio inferior a 8g % determinado por condutividade.

Realizadas as determinações de proteína e sulfato de amónio, manter a solução sob agitação ajustando o pH para 3.1 - 3.2 com solução de ácido cítrico através da bomba de transferência de produto. Imediatamente após o ajuste do pH é adicionado pepsina na concentração de 1/80, ou seja, para cada 80 gramas de proteína é adicionado lg de pepsina.

Após a adição da pepsina, o produto permanece sob agitação durante 10 minutos e em seguida é corrigido o pH para 3.1 - 3.2, permanecendo a solução em agitação por mais 35 minutos.

Após o período de tratamento com a pepsina, o pH é ajustado para 4.5 - 4.6 com solução de hidróxido de sódio 40%. Em seguida adiciona-se solução de sulfato de amónio 50% que é transferida do tanque de preparo de solução de sulfato de amónio até que se obtenha uma saturação final ao redor de 11,3 g% determinada por condutividade, levando-se em conta a determinação inicial deste sal após a diluição.

No segundo procedimento de precipitação, manter o produto em agitação por 30 minutos e em seguida, corrigir se necessário o pH para 4.5 - 4.6. Adicionar ácido caprílico para uma concentração final de 0,01M, mantendo-se o produto sob agitação constante por 30 minutos. (se necessário corrigir novamente o pH para 4.5 - 4.6) . A seguir sob agitação constante, iniciar a termocoagulação, que consiste no aquecimento do produto a 55 °C por 60 minutos. Após a termocoagulação, ajustar o pH para 6.8 - 6.9 com solução de hidróxido de sódio 40%, resfriando o produto em seguida para 25 °C - 29 °C. Para finalizar o segundo procedimento de precipitação, adicionar solução de sulfato de amónio 50%, transferindo o produto do tanque de preparo de solução de sulfato de amónio para que se obtenha uma saturação final ao redor de 17,6 g% determinada por condutividade. Manter o produto em agitação por 30 minutos e verificar novamente a concentração de sulfato de amónio por condutividade e ser for necessário, adicionar solução de sulfato de amónio 50%. Corrigir o pH para 6.8 - 6.9 e manter em agitação por mais 30 minutos.

Para separar as duas fases formadas, líquida e sólida, centrifugar o produto recuperando a fase líquida (sobrenadante) e desprezando a fase sólida (precipitado). 16.1.3. Dessalinização

A dessalinização é feita do sobrenadante do segundo procedimento de precipitação para a retirada do sulfato de amónio remanescente. O processo é realizado em sistema de ultrafiltração molecular com membrana de corte de 30kDa, utilizando-se como solução dialisadora solução fosfato com cloreto de sódio 0,42%.

A concentração final de sulfato de amónio deve ser inferior a 0,2 g% e é determinada por análise colorimétrica em ensaio com o reativo de Nessler.

Durante o processo de dessalinização é realizado o monitoramento da integridade dos filtros, através da reação do material filtrado descartado com o ácido tricloroacético 20% .

O produto dessalinizado é retirado com tampão fosfato 25 mM com 90 mM de NaCl com pH 6,80 + 0,05 do sistema de ultrafiltração molecular para um volume final aproximado de 80 litros.

16.1.4. Cromatografia

Após a dessalinização do sobrenadante do segundo procedimento de precipitação, o produto deverá ser submetido a purificação por cromatografia em coluna de troca iônica Q Sepharose Fast Flow. Os tampões utilizados neste processo são: tampão fosfato 50 mM pH 6,80 para equilíbrio da coluna; tampão fosfato 25 mM com 90 mM de NaCl pH 6,80 + 0,05 para diluição da amostra aplicada ; tampão fosfato 25 mM com 1 M de NaCl para limpeza da coluna. O volume final retirado do sistema é igual ou próximo de 160 litros de produto cromatografado.

16.1.5. Concentração

O produto cromatografado é concentrado a aproximadamente 10 a 12% do volume inicial do plasma à granel. Para uma concentração de 12% com o volume do plasma a granel em 300 litros, o volume total a ser obtido deverá ser de 36 litros, (soro concentrado + solução conservante = 36 litros).

A concentração se faz em sistema de filtração tangencial (Sistema Pellicon® - Millipore®) com membranas de corte de 30kDa.

Durante o processo de concentração é realizado o 5 monitoramento da integridade das membranas através da reação do material filtrado descartado com o ácido tricloroacético 20%.

O produto concentrado é chamado de soro concentrado à granel.

16.1.6. Adição de Solução Conservante

A solução conservante utilizada no soro concentrado à granel é a solução fenol 10%, visando atingir uma concentração final de 0,25g%. A solução de fenol é diluída com solução fosfato com cloreto de sódio 0,42%, visando 15 atingir o volume desejado na fase de concentração.

17. Preparo do Soro Concentrado a Granel 17.1. Filtração Clarificante

Se necessário o produto poderá ser clarificado na sala de filtração de soro concentrado, utilizando filtros 20 nominais de polipropileno com porosidade nominal variando entre 1,2 e 0,3 micrometres.

17.2. Filtração Esterilizante

A esterilização do soro concentrado a granel é realizada em filtros absolutos de 0,22 micrômetros de 25 porosidade e é realizada na sala de filtração de soro concentrado.

18. Distribuição em Frascos ou Bolsas

O soro concentrado a granel estéril é armazenado em frasco de vidro temperado, apirogênico e estéril de 20 30 litros ou 45 litros de capacidade ou ainda em bolsas de PVC atóxicas, estéreis e apirogênicas de 10 litros, 20 litros ou 50 litros de capacidade aprovadas pelo Controle de Qualidade.

19. Controle da Filtração Esterilizante

O controle da filtração esterilizante é realizado antes e após a filtração através do teste de integridade do elemento filtrante pela utilização do equipamento automático Integritest®.

20. Rotulagem de Frascos ou Bolsas

Os dados referentes ao produto acabado a granel filtrado são preenchidos após a verificação do volume obtido. No caso do armazenamento em frascos, a rotulagem é feita através da leitura do volume na parte frontal e em bolsas, através da pesagem do seu conteúdo. Caso ocorra a distribuição do soro em mais de um frasco ou bolsa, estes serão denominados de sublotes e deverão conter além do número inicial de processo, a adição de uma letra em ordem alfabética (A, B, C, etc.).

A identificação é realizada em etiquetas plásticas auto-adesivas colocadas em local visível nos frascos ou bolsas contendo os seguintes dados: nome da seção produtora + especificação do serviço número do lote do soro filtrado frasco único ou a letra designando o sub-lote. volume do produto em litros data de fabricação responsáveis pela operação

21. Amostragem do Soro Concentrado a Granel

A amostragem é realizada na sala de controle de processo pelo Serviço de Controle de Qualidade, na qual são retiradas dos frascos ou bolsas amostras do soro concentrado a granel para os Controles Microbiológico, Biológico e Físico-Químico.

22. Provas de Controle de Qualidade

Para liberar o soro concentrado a granel, são realizadas as seguintes provas pelo Serviço de Controle de Qualidade: Potência (citotoxicidade e inibição da hemólise); pirogênio "In Vivo"; teste de esterilidade; determinação de cloreto de sódio; determinação de proteínas; determinação de fenol; determinação da concentração de sulfato de amónio; determinação de pH. Com exceção da prova de citotoxicidade e inibição da hemólise os outros testes estão descritos na Farmacopeia Brasileira.

Como controle de processo é realizada a seguinte prova: Eletroforese em gel de agarose.

23. Data de Fabricação

A data de fabricação do soro concentrado a granel é 20 aquela correspondente ao dia da abertura das bolsas de plasmas.

24. Estocagem dos Lotes de Soro Concentrado a Granel

Após a retirada das amostras, os frascos ou bolsas plásticas do soro concentrado a granel são armazenados em câmara fria à temperatura de 2 °C a 8 °C até a liberação dos resultados pelo Serviço de Controle de Qualidade.

25. Arquivo de Amostras

De cada lote de soro concentrado a granel é retirada uma amostra que é conservada em temperatura de 2 °C a 8°C, 3 0 devidamente identificada por 60 meses a partir da data da última prova de potência.

26. Autorização para Formulação

Após a liberação dos resultados do soro concentrado a granel pelo Serviço de Controle de Qualidade, este recebe a 5 denominação de soro concentrado acabado a granel. De acordo com o cronograma de disponibilidade de soros hiperimunes, o produto aprovado e a respectiva documentação são colocados a disposição da Diretoria de Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção, em forma de ofício com as 10 informações referentes ao produto concentrado. A Diretoria de Divisão solicita então a formulação do produto acabado a granel através do documento FormSoros.

27. Registros

Os dados do processo de fabricação de cada lote de 15 Soro Concentrado Acabado a Granel e os resultados das provas de controle são registrados e arquivados. As cópias destas documentações são arquivadas na Seção de Processamento de Plasmas Hiperimunes.

28. Reprocessamento

O soro concentrado a granel poderá ser reprocessado por ordem da Diretoria de Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção após os resultados emitidos pelo Serviço de Controle de Qualidade nas seguintes situações: a) Reprovado no teste fisico-químico tais como: 25 concentração de fenol, concentração de cloreto de sódio, concentração de sulfato de amónio e pH. Em caso de excesso destes elementos, o soro concentrado a granel deverá ser submetido ao processo de dessalinização e concentração e receber novo número de lote de fabricação. b) Reprovado nos testes biológicos de potência e pirogênio "In Vivo", no teste microbiológico de esterilidade e no teste fisico-quimico de proteínas. Nestes casos o soro concentrado a granel deverá ser submetido a cromatografia de troca iônica e concentração e receber novo 5 número de lote de fabricação.

29. Descarte

O soro concentrado a granel poderá ser descartado por ordem da Diretoria de Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção se após o reprocessamento for 10 reprovado nos testes de controle de qualidade. Poderá, no entanto ser aproveitado para ensaios "In Vitro" de pesquisa e desenvolvimento. 0 soro concentrado a granel e outros materiais a serem descartados são colocados a disposição da Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção mediante 15 ofício emitido pela Seção de Processamento de Plasmas Hiperimunes.

30. Formulação 30.1 Formulação do Soro Produto Acabado a Granel 30.1.1 Adição de Solução Conservante

A solução conservante utilizada no soro produto acabado a granel é a solução fenol 10%, porém a concentração final de fenol no soro não deve ser superior à 0,35g%.

30.1.2 Isotonização

O sal utilizado para isotonização do soro produto acabado a granel é o cloreto de sódio p.a., e deve estar em uma concentração final entre 0,75 a 0,90 g%.

30.1.3 Esterilização do Soro Produto Acabado a Granel

A esterilização do soro acabado a granel é realizada 30 em filtros absolutos de 0,22 micra de porosidade.

30.1.4 Distribuição em Frascos ou Bolsas

O soro acabado a granel estéril é armazenado em frascos de vidro temperado, apirogênico e estéril de 20 litros ou 45 litros de capacidade ou ainda em bolsas de PVC atóxicas, estéreis e apirogênicas de 10 litros, 20 litros ou 50 litros de capacidade aprovadas pelo Controle de Qualidade.

30.1.5 Controle da Filtração Esterilizante

O controle da filtração esterilizante é realizado antes e após a filtração através do teste de integridade do elemento filtrante pela utilização do equipamento automático Integritest®.

30.1.6 Rotulagem dos Frascos e ou Bolsas.

Os dados referentes ao produto acabado a granel filtrado são preenchidos após a verificação do volume obtido. No caso do armazenamento em frascos, a rotulagem é feita através da leitura do volume na parte frontal e em bolsas, através da pesagem do seu conteúdo. Caso ocorra a distribuição do soro em mais de um frasco ou bolsa, estes serão denominados de sub-lotes e deverão conter além do número inicial de processo a adição de uma letra em ordem alfabética (A, B, C, etc.).

A identificação é realizada em etiquetas plásticas auto-adesivas colocadas em local visível nos frascos ou 25 bolsas contendo os seguintes dados: nome da seção produtora especificação do serviço número do lote do soro produto acabado a granel frasco único ou a letra designando o sub-lote volume do produto data da fabricação responsáveis pela operação

31. Amostragem do Soro Produto Acabado a Granel

A amostragem é realizada na área de formulação pelo Serviço de Controle de Qualidade, na qual são retiradas dos frascos ou bolsas amostras do soro acabado a granel para os Controles Microbiológico, Biológico e Fisico-Químico.

32. Provas de Controle de Qualidade

Para a liberação do produto acabado a granel para o envase são realizadas as seguintes provas pelo Serviço de Controle de Qualidade: Soro-neutralização de proteínas específicas (por cromatografia de afinidade, eletroforese bidimensional e análise proteômica); - Potência (inibição da citotoxicidade do veneno, inibição da atividade de liberação de creatino quinase e inibição da hemólise); - teste de pirogênio "In Vivo"; - teste de esterilidade; - teste de identidade; - teste de inocuidade; - determinação de fenol; - determinação de sólidos totais; - determinação de sulfato de amónio; - determinação do teor de cloreto de sódio; - determinação de nitrogênio e proteínas;

Com exceção das provas de soro-neutralização e potencial inibição da citotoxicidade do veneno, inibição da atividade de liberação de creatino quinase e inibição da 30 hemólise, os outros testes estão descritos na Farmacopeia Brasileira. Os resultados das analises mencionadas acima deverão estar dentro dos parâmetros mencionados nos protocolos descritos abaixo, enquanto que os resultados das analises já descritas pela Farmacopéia Brasileira deverão 5 estar dentro dos limites estabelecidos pelas Normas Nacionais.

33. Ensaio de soro-neutralização específica

A avaliação da capacidade de neutralizar determinadas proteínas (toxinas) presentes no veneno de abelhas, deve ser realizada por duas estratégias diferentes: i) combinação de um conjunto de técnicas analíticas, como a cromatografia de afinidade do veneno de abelhas utilizando- se da imobilização do soro anti-veneno de abelhas em suporte sólido e analise proteômica; e ii) pela combinação das técnicas de eletroforese bidimensional , eletrotransferência e imunoblotting (utilizando-se do soro anti-veneno de abelhas e de IgG de coelho anti-IgG de cavalos)

33.1. Cromatografia de Imunoafinidade

A Figura 2 apresenta um esquema da cromatografia de imunoafinidade em matriz inerte de carboidrato, constituída de Sepharose 4B ativada com brometo de cianogênio (1) . Nesta figura estão representadas as proteínas do soro antiveneno de abelhas imobilizadas na superfície da matriz cromatografica inerte (2) . O veneno é potencialmente constituído de proteínas imunoreativas (com afinidade) ao soro anti-veneno de abelhas (3), e de proteínas não imunoreativas (4) ao soro. O esquema representa o processo de eluição inicial das proteínas não imunoreativas ao soro anti-veneno, que ocorre em pH 8,0 (5), seguido da retenção das proteínas do veneno de abelhas que apresentam imunoreatividade ao soro anti- veneno, que por sua vez são eluídas posteriormente, lavando-se a coluna com solução de pH 2,8 e depois com outra solução de pH 11,0 (6) . A realização da cromatografia de afinidade exige a imobilização do soro anti-veneno de abelhas em coluna de Sepharose, seguido da cromatografia propriamente dita. A seguir estão descritas cada uma destas etapas.

33.1.1 Imobilização do soro antiveneno de abelhas em resina 10 de Sepharose.

A quantificação de proteínas foi feita pelo método de Bradford segundo descrito por Sedmak & Groosberg (1977) . A resina utilizada foi a Sepharose 4B ativada por CNBr (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). A quantidade 15 de ligante (soro antiveneno de abelhas) imobilizado foi estabelecida experimentalmente em 30mg de proteínas (IgG) para lg de resina. O empacotamento da resina foi feito segundo as instruções do fabricante. A ligação das proteínas do soro antiveneno de abelhas à resina de 20 Sepharose 4B foi feita à temperatura ambiente sob agitação constante, sem a utilização de agitador magnético. O ligante foi dissolvido em tampão de ligação (solução de NaHC03 0, IM em pH 8,3, contendo 0,5 M NaCl) . O excesso de ligante foi lavado com 15 volumes do tampão de ligação. 25 Para bloquear quaisquer grupos reativos, a resina com ligante foi transferida para uma solução tampão Tris-HCl 0, IM pH 8,0. Após 2 horas, o excesso de proteínas do soro antiveneno, que não se ligou à resina, foi lavado com pelo menos três ciclos alternados de pH ácido e básico, 30 utilizando-se as soluções: tampão acetato de sódio 0,IM pH 4,0 (contendo 0,5M NaCl), seguido de lavagem com solução tampão Tris-HCl O,1M pH 8,0 (contendo 0,5M NaCl), para garantir que nenhuma molécula livre do ligante permanecesse acoplada ao ligante imobilizado. A coluna foi equilibrada 5 com este mesmo tampão.

33.1.2 Cromatografia de imunoafinidade do veneno de abelhas

Para remoção das elevadas concentrações de sais inorgânicos que ocorrem naturalmente no veneno de abelhas (incompatível com etapas posteriores de eletroforese 2-D), o veneno a ser utilizado na cromatografia foi dialisado contra uma solução contendo: PMSF ImM (inibidor de serinoproteases) , leupeptina 2x10-3 mM (inibidor de serinoplasmina, porcina e cisteína proteases) e EDTA lOOmM (inibidor de metaloproteases); sendo posteriormente liofilizado.

A quantidade de veneno a ser utilizada na cromatografia foi determinada empiricamente. Após várias tentativas foi utilizada a razão de 1:24 vezes (proteínas do veneno: proteínas do soro) , e com base nos resultados obtidos nos 20 ensaios biológicos foi posteriormente estabelecida uma razão de 1:58. Foi utilizada uma coluna de 20mL de resina Sepharose 4B, tratada conforme descrito. O veneno foi solubilizado em 3mL de solução (NH4)HCO3 lOmM pH 6.8 e aplicado na coluna. Primeiramente foi realizada uma lavagem 25 da coluna, para eluição de todas as frações não imunoreativas ao soro antiveneno de abelhas imobilizado em Sepharose 4B. Para isso utilizou-se tampão Tris-HCl 0,IM pH 8 contendo NaCl 0,15M. A eluição foi monitorada por medidas de absorbância em 280 nm, até que a leitura atingisse o 30 valor zero, sendo coletadas frações de 15mL. Para eluição da fração ácida ligada à resina, utilizou-se tampão Tris- Glicina 0,05M pH 2,8, contendo NaCl 0,15M. Para a posterior eluição das proteínas básicas ligadas à resina foi utilizado tampão Tris-HCl 0, IM pH 11,0. O esquema da cromatografia encontra-se na figura 2. A quantidade de proteínas de cada fração coletada foi quantificada pelo método Bradford (Sedmak & Groosberg, 1977). As frações correspondentes a cada pico eluído foram reunidas, e então dialisadas para remoção do excesso de sal, incompatível com os protocolos experimentais subsequentes (eletroforese bidimensional) .

Em etapa posterior foi adicionado inibidor de protease a todos os tampões da cromatografia. (lOmM de EDTA foram utilizadas em todas as etapas).

33.2. Análise proteômica

A realização de análise proteômica requer a separação dos componentes do veneno de abelhas, que neste protocolo foi realizada por eletroforese bidimensional. As etapas desta análise estão descritas a seguir.

33.2.1. Eletroforese 2-D

Preparação da amostra: Para os ensaios de eletroforese 2D foram utilizadas amostras do veneno bruto total dialisado na presença de inibidores de protease (EDTA, PMSF e leupeptina), das frações do veneno bruto coletadas na cromatografia de exclusão molecular, da fração que não se ligou à resina da coluna de imunoafinidade (não imunoreativas) e das frações ácida e básica que se ligaram à coluna de imunoafinidade (imunoreativas).

Primeira dimensão - Focalização isoelétrica (IEF): Para realização da IEF as proteínas foram solubili zadas em uma solução de re-hidratação (DeStreak acrescido de 0,5% de tampão IPG (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia) e azul de bromofenol. Fitas para imobilização de proteínas (Immobiline Dry Strips - IPG), pH 5 3-10, foram re-hidratadas nesta solução de proteínas por 15H e submetidas ao IEF em um sistema IPGphor (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia) a 500Vh, lOOOVh e 8000Vh. Segunda dimensão - SDS-PAGE: Após a primeira dimensão 10 as fitas de IPG foram incubadas em tampão de equilíbrio 1 (75mM Tris-HCl, pH 8.8; uréia 6M; 30% de glicerol; lOmg/mL DTT; 2% SDS; iodoacetamida e azul de bromofenol), durante 15 minutos para a redução das pontes dissulfeto e por mais 15 minutos em tampão de equilíbrio 2 (mesmo solução, 15 entretanto substituindo-se DTT por 25mg/mL de iodoacetamida) para alquilação destas pontes. As fitas foram então transferidas para os géis de 12,5% de poliacrilamida contendo SDS. A corrida dos géis teve duração de aproximadamente 5 horas; os géis foram então 20 corados com Commassie Blue Coloidal, segundo descrito por Candiano et al. (2004) (compatível com a espectrometria de massas), ou com nitrato de prata, dependendo da quantidade de proteínas; neste último caso apenas para evidenciar proteínas pouco abundantes e que não foram submetidas à 25 espectrometria de massas. As imagens dos géis foram capturadas utilizando-se o ImageScanner (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia) e analisadas utilizando-se o ImageMaster 2-D Platinum software v. 5.0 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Os '"’spots"” selecionados 30 foram então recortados manualmente e submetidos à digestão e extração dos fragmentos trípticos gerados.

33.2.2. Identificação de Proteínas

A identificação de proteínas exige que se removam os spots" " de proteínas do gel de eletroforese 5 bidimensional, seguido da digestão destas proteínas com tripsina, do seqüenciamento peptídico do fragmentos gerados na digestão tríptica, por análises de espectrometria de massas e da identificação funcional propriamente dita, com o uso de ferramentas de bioinformática. Cada uma destas 10 etapas estão descritas a seguir.

33.2.2.1. Excisão e Digestão "in gel" dos ""spots"" excisados do gel de eletroforese 2-D

A enzima utilizada foi a Tripsina modificada da Promega (Madison, WI, EUA) . Todos os demais reagentes, 15 incluindo bicarbonato de amónio e acetronitrila são Aldrich (Milkaukee, WI, EUA).

Após a visualização dos géis 2-D os ""spots"" foram excisados manualmente em capela de fluxo laminar vertical e colocados em microtubos siliconizados de 1,5mL para 20 subsequente digestão in gel e extração dos fragmentos trípticos. A digestão in gel e a extração dos fragmentos trípticos foram realizados segundo protocolo modificado de Schevchenko et al. (1996). Os pedaços excisados de gel foram descoloridos com 100 μL de bicarbonato de amónio 100 25 mM pH 7.8, contendo acetonitrila 50% (v/v), repetindo-se o processo até a descoloração total dos géis. Não foram feitos os passos de redução e alquilação, uma vez que as amostras eram provenientes de géis bidimensionais e, portanto, estas etapas já haviam sido realizadas durante a 30 preparação das mesmas para os procedimentos de eletroforese bidimensional, antes da realização da segunda dimensão (gel SDS-PAGE) . Os pedaços de gel recortados e excisados foram então liofilizados e rehidratados com 15 μL de uma solução de tripsina 10ng/μL em bicarbonato de amónio 40 mM pH 7.8. 5 As amostras foram então incubadas a 37°C, durante 16 horas, sempre em tubos siliconizados. O sobrenadante contendo os fragmentos trípticos gerados foi removido após centrifugação por 2 minutos a 4 0 00 x g, e os peptídeos remanescentes foram então 10 extraídos do gel seguindo-se uma série de etapas de extração. Primeiramente adicionou-se 20 μL de uma solução acetonitrila 50% (v/v), contendo ácido fórmico 5% (v/v) e incubou-se por 45 minutos a temperatura ambiente, seguido de sonicação por 10 minutos e breve centrifugação. Esta 15 etapa foi repetida mais uma vez a partir do sedimento remanescente da primeira centrifugação e coletado novamente o sobrenandante. Ao sedimento da segunda centrifugação adicionou-se 20 μL de uma solução acetonitrila 90% (v/v), contendo ácido fórmico 5% (v/v), coletando-se o sobrenadante após 5 minutos e breve centrifugação. Os sobrenadantes das 3 etapas foram coletados em um único tubo siliconizado de 1,5 mL e as amostras foram liofilizadas até o volume ser reduzido a aproximadamente 0,5 μL em Speedvac SC110 (Thermo Savant, Milford, MA, EUA).

33.2.2.2. Seqüenciamento dos peptídeos trípticos por espectrometria de massas do tipo MALDI TOF-TOF

Todas as análises de espectrometria de massas foram realizadas na Facility de Espectrometria de Massas da Universidade de Cornell (Ithaca, NY). 3 0 Cada amostra foi reconstituída em 10 μL de solução acetonitrila 50% (v/v), contendo TFA 0,1% (v/v), anteriormente à análise por espectrometria de massas (MS) ; 0,5 μL de cada amostra foi aplicado em uma placa do amostrador do espectrômetro MALDI-TOF/MS. Após a secagem da amostra na placa, adicionou-se 0,5 μL de uma solução saturada de matriz de a-Ciano-4-hidroxi ácido cinâmico (CHCA) (lOmg/mL em acetonitrila 50% (v/v), contendo TFA 0,1% (v/v) e fosfato de amôniolmM) sobre cada amostra, que por sua vez foram deixadas à temperatura ambiente até secagem completa. As amostras foram então submetidas à análise por MALDI MS/MS utilizando um instrumento 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystem, Framingham, MA) , equipado com um analisador de massas TOF-TOF óptico e com o software Explorer 4700 versão 3.0. O instrumento foi operado em IkV no modo reflectron positivo e calibrado com um kit de calibrantes contendo uma mistura de. 6 peptídeos padrão (Applied Biosystems, Framingham, MA) . A calibração interna foi feita utilizando-se dois ions da autólise da tripsina (m/z 842.508 e m/z 1045.564) para todas as aquisições de espectros. A potência do laser foi ajustada para 2 000 V para as análises de MS e 3000 V para as análises de MS/MS, com o sistema CID (Dissociação Induzida por Colisão) desligado. Os espectros de MS foram adquiridos para ions com massas entre 700 e 4 000 Da, com uma relação sinal-ruído ajustada para um valor mínimo de mínimo de 20, para seleção de íons precursores. Os espectros de MS/MS foram adquiridos para os 8 íons precursores mais abundantes em um total de 2000 disparos acumulados de laser .

33.2.2.3. Identificação de proteínas.

Os dados combinados das análises MS e MS/MS realizadas por MALDI TOF-TOF foram utilizados para análise utilizando- se o software GPS Explorer (versão 3.5), fazendo-se uma busca contra o banco de dados do NCBInr (taxonomia: Metazoa). Os parâmetros de busca foram ajustados para 5 permitir uma divagem perdida; modificações variáveis de oxidação da metionina e carboxiamidometilação da cisteína e tolerância de massa de 50ppm. Os dados de MS/MS gerados a partir das análises de IDA, baseados nos experimentos de LC/ESI foram submetidos ao Mascot 2.1 para busca nos banco 10 de dados, utilizando-se uma versão com servidor local (Cornell University) e a busca foi realizada contra o banco de dados NCBInr (taxonomia: Metazoa), com a admissão de uma divagem perdida; a tolerância de massa do peptídeo foi 1,2 Da e a tolerância admitida de nos ensaios de MS/MS foi de 15 0,6Da. As modificações variáveis foram carboxamidometilação da cisteína e oxidação da metionina. Apenas escores significativos para os peptídeos definidos pela análise de probabilidade do Mascot (www.matrixscience.com/help/scoring_help.html#PBM) maior 20 que a identidade foram considerados para a identificação de proteínas.

33.3. Eletrotransferência e imunodetecção (Western Blotting)

Foram realizados experimentos de Western Blotting para detecção de IgG específicas do antiveneno que estavam reconhecendo as proteínas do veneno de abelhas.

As proteínas separadas em SDS-PAGE foram eletrotransferidas do gel para membranas de nitrocelulose de 8x8cm na cuba de eletrotransferência Semi-Dry TE 70 (GE 30 Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Foram utilizadas membranas de nitrocelulose ao invés de PVDF por apresentarem menor intensidade de ruídos de fundo.

Em um reservatório contendo tampão de transferência [Tris 20 mM pH 8,3, contendo Glicina 192 mM, SDS 0,1% 5 (m/v) e metanol a 10% (v/v)] montou-se um "sanduíche" na seguinte ordem: três folhas de papel de filtro comum e uma membrana,gel, três folhas de papel de filtro comum; este conjunto permaneceu em repouso por 10 minutos para o equilíbrio de todo sistema no tampão de transferência. As 10 membranas foram pré-hidratadas por 15 segundos em água antes de serem inseridas no tampão de transferência. O conjunto foi colocado rapidamente na cuba de transferência na seguinte ordem: a partir do cátodo da cuba, primeiramente os três papéis filtro, o gel equilibrado, a 15 membrana e os mais três papéis filtro. Os parâmetros utilizados foram: 250 V, 100 mA por 1 hora para géis de 8 x 8 cm. Após a eletrotransferência a membrana foi corada com Ponceau a fim de testemunhar a eficiência da transferência.

A membrana foi então descorada com água para remover o 20 corante.

33.3.1 Imunodetecção

Nos ensaios de Western Blotting para detecção de IgG específicas do antiveneno ao veneno de abelhas foi utilizado o antiveneno de abelhas produzido pela Fundação Butantan. 0 anticorpo utilizado foi Anti-IgG de cavalo (molécula intacta) produzido em coelhos, conjugado à peroxidase (Sigma, Saint Louis, MO) .

A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com TBS- entre 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) por 2 horas, 30 em temperatura ambiente. No caso dos ensaios para detecção de IgG a membrana foi incubada com o antiveneno (anticorpo primário) em um volume correspondente a ll,6mg de proteínas (aproximadamente 560μL), já que a eletrotransferência foi feita com 200μg de proteínas de veneno (a fim de se 5 alcançar a proporção 1:58 proteínas de veneno para proteínas de antiveneno, determinada a partir dos resultados dos ensaios biológicos), acrescido de volume suficiente de TBS-entre 20 a 07l% (v/v) para completar 10 mL. Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20mL de TBS-entre 20 0,1% (v/v) por 5 vezes, durante 10 minutos cada lavagem à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário (anti IgG de cavalo) diluído em TBS-entre 20 a 0,1% (v/v) na proporção 1:250 [ (100 μL do anticorpo e 24,9 mL de TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v)] por 2 hs, à temperatura ambiente.

As membranas para detecção de IgG específicas foram submetidas à detecção colorimétrica. Para isso, foi feito com uma solução contendo o substrato cromogênico 4-cloro-l- naftol (Sigma, Saint Louis, MO) em metanol contendo 0,003% 2 0 (v/v) de H2O2 e a reação foi interrompida por adição de água deionizada.

33.3.2. Ensaio de inibição da atividade citotóxica do veneno33. 3.2.1. Preparo de meio de cultura:

Foi utilizado meio Eagle suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) para o crescimento das células a serem cultivadas. Após dissolução do meio, retirou-se amostra para verificar o pH, que deveria estar entre 4,3 e 5,9. Adicionou-se Bicarbonato de Sódio, de grama em grama, 30 retirando-se amostras para medição do pH, após cada adição.

O meio deve atingir pH entre 7,1 e 7,3. Acrescentou-se SFB em 10% (v/v) e retirou-se nova amostra e mediu-se novamente o pH que deveria estar entre 7,2 e 7,5. Realizou-se a filtração do meio em membrana esterilizante e, em seguida, foram retiradas amostras para o Teste de Verificação de Ausência de Bactérias e Fungos.

33.3.2.2. Banco de células:

Para manter sempre uma quantidade de célula para uso imediato é necessário que se prepare um banco de células, ou seja, após o descongelamento de um criotubo, as células que se reproduziram e não foram utilizadas, devem ser congeladas em nitrogênio líquido em concentração de 6 a 8 x 106 células/mL.

Para o congelamento, foi realizada uma subcultura, para que em 24 horas, a monocamada atingisse de 70 a 80% de formação (quando as células estariam na fase log de crescimento). Procedeu-se à tripsinização dessas células com Associação Tripsina-Versene (ATV) e diluição com meio Eagle contendo 10% (v/v) de SFB e contagem em câmara de Newbauer (diluição do corante para contagem - ImL de células e 2 mL de corante) . O resultado é o número de células/mL da garrafa. Para congelamento, são necessárias de 6 a 8 x 106 células/mL. Após diluição ou concentração (por centrifugação) para se obter a quantidade desejada, acrescentou-se DMSO (dimetilsulfóxido), 5% (v/v) e realizar os testes de esterilidade. Distribui-se 1 mL de células em cada criotubo e o congelamento deve ser lento para que a formação dos cristais seja o mínimo possível, sem rompimento da membrana celular. Após esta etapa embrulham-se os criotubos em papel jornal e depois em papel alumínio e colocam-nos no freezer -80 °C por 24 horas. Transcorrido esse período, colocam-se os criotubos no nitrogênio líquido.

Após 3 dias deve-se retirar 1 criotubo para Teste de 5 Micoplasma e 1 criotubo para verificar a viabilidade celular e sua concentração.

33.3.2.3. Descongelamento celular

Para a realização dos testes de citotoxicidade, as células a serem utilizadas foram descongeladas a partir do 10 Banco de Células.

Retira-se 1 criotubo da célula escolhida do tambor de nitrogênio líquido (-196°C) e o coloca diretamente em um recipiente com tampa contendo água a 36,5°C para que ocorra um descongelamento rápido da célula, de modo que ela não se 15 rompa devido aos cristais formados em seu citoplasma durante o processo de congelamento.

Em capela de fluxo laminar, despeja-se o conteúdo do criotubo em uma garrafa de 25cm3 para cultura de células e adiciona-se meio Eagle fresco, contendo 10% (v/v) SFB. Após 20 24 horas o meio foi substituído para remoção do DMSO usado no congelamento das células (para evitar a formação dos cristais no citoplasma).

33.4. Subcultivo celular

Após formação da monocamada de células na garrafa, em 25 capela de fluxo laminar, retira-se todo o meio de cultura da garrafa e tratam-se as células com ATV para que estas descolem da garrafa e também umas das outras. Após se descolarem, adicionou-se meio Eagle fresco, contendo 10% de SFB 10% e transferiu-se para outras garrafas, na diluição 30 1:6.

33.5. Citotoxicidade

Nos ensaios de citotoxicidade foram testados diferentes tipos celulares (L-929 - células de inseto, CRFK - células de rim de gato, MDBK - células de rim de boi e 5 CHO - células de ovário de Hamster Chinês).

Em placas de cultura de 96 cavidades, foram realizadas diluições seriadas do veneno em meio Eagle com 10% de SFB.

Em seguida, acrescentou-se 5 x 105 células/cavidade, exceto na primeira coluna para leitura do branco. As placas foram incubadas em estufa 36,5°C com 5% de C02 pelo período de 1, 2, 3, 4 ou 24 horas. Após o período de incubação, as células foram fixadas com acetona 80% a -20 °C por 10 minutos. Secou-se a placa e adicionou-se 100μL por cavidade de Azul de Evans 1:10.000. As células foram então incubadas em estufa a 36,5°C por 1 hora para que as células vivas fossem coradas. Lavou-se com PBS para retirar o excesso de corante e acrescentou-se 100μL de PBS com 10% de SDS (Sodio Dodecil Sulfato) foram adicionados, a fim de romper a membrana das células fixadas, liberando o corante, 20 seguindo-se a leitura no leitor de Elisa.

33.5.1. Soroneutralização da atividade citotóxica

Para os ensaios de soroneutralização foram utilizados diferentes lotes de antivenenos produzidos pela Fundação Butantan.

Em placas de cultura de 96 cavidades, foram realizadas diluições seriadas do veneno em meio Eagle contendo 10% (v/v) de SFB, acrescentando, em seguida, o mesmo volume de antiveneno. A mistura veneno + antiveneno foi inclubada em estufa a 36,5°C com atmosfera de 5% (v/v) de CO2 durante 1 30 hora. Metade do volume foi descartado e acrescentou-se 5 x 105 células/cavidade, com mesmo volume existente na cavidade, exceto na primeira coluna para leitura do branco. Incubou-se novamente a placa pelo período determinado. Após o período de incubação, as células foram fixadas com acetona 80% (v/v) a -20°C por 10 minutos. Secou-se a placa e adicionou-se lOOμL de Azul de Evans 1:10.000, por cavidade. As células foram então incubadas em estufa a 36,5°C por 1 hora para corar as células vivas. Lavou-se com PBS para retirar o excesso de corante e 100μL de PBS com 10% de SDS foram adicionados, a fim de romper a membrana das células fixadas, liberando o corante, seguindo-se a leitura no leitor de Elisa a 540nm.

Foram repetidos os mesmos testes, só que ao invés de diluir o veneno, foi diluído o antiveneno, mantendo-se fixa a concentração do veneno.

33.6. Ensaio da atividade de neutralização da hemólise causada pelo veneno

Os experimentos de atividade hemolítica foram realizados com base na metodologia utilizada por de Souza e col. (2005) e descritos a seguir.

33.6.1. Obtenção dos eritrócitos

Foram adicionados cerca de 500 μL de sangue extraído da cauda de ratos Wistar fêmeas em 50 mL de solução salina (NaCl 0,85%, CaC12 10 mM) sob leve agitação, em agitador magnético (MA-089 MARCONI). Esta suspensão de eritrócitos foi mantida por 15 minutos sob agitação leve para evitar coagulação.

A suspensão de eritrócitos foi centrifugada em centrífuga clínica (Z-200A HERMLE) a 3000 rpm durante 15 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se as células em 10 mL de solução salina, para lavagem dos eritrócitos. Repetiu-se esta operação por mais duas vezes.

O sobrenadante da última centrifugação foi descartado e o concentrado de hemácias obtido ao final das centrifugações foi considerado como sendo 100% de células.

Foi preparada uma suspensão de eritrócitos a 1%, diluindo-se a suspensão concentrada descrita acima, com solução salina isotônica. Essa suspensão a 1% foi utilizada nos ensaios de atividade hemolítica.

33.6.2. Ensaio de inibição da atividade hemolítica do veneno

Foi montada uma bateria de ensaios em microplaca (Costar, Acton, MA, EUA) , onde cada orifício continha diferente concentração do veneno de abelhas, dissolvido em 10 μL de solução salina. A cada poço foram adicionados 90 μL da suspensão de eritrócitos perfazendo um volume final de 100 μL. Diferentes concentrações do veneno foram testadas, em triplicata, a fim de estabelecer-se a dose mínima capaz de lisar 100% das hemácias. Para o controle de 0% de hemólise foram adicionados 10 μL de solução salina e 9 0 μL da suspensão de eritrócitos e, para o controle de 100% de hemólise, foram adicionados apenas 10 μL de solução salina acrescida de 1% (v/v) de Triton X-100 (t- Octilfenoxipoli-etoxietanol, Sigma, Saint Louis, MO), em 90 μL de suspensão de eritrócitos.

A placa foi incubada à temperatura ambiente por 2 horas sob leve agitação. Após este periodo de incubação, o conteúdo de cada orifício foi centrifugado por 5 minutos a 3000 rpm, em uma centrífuga Compacta Avanti 30 (Beckman, Fullerton, CA, EUA). Com o sobrenadante, montou-se uma nova placa para realização das leituras de absorbância, que foi realizada em uma leitora de placas (Biotrak II - GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suécia), com filtro de 540 nm.

Para se testar a soroneutralização da atividade hemolítica o veneno foi incubado com o antiveneno, (a partir da concentração mínima de veneno obtida nos ensaios de hemólise necessária para hemolisar 100% dos eritroeitos variando-se a quantidade antiveneno a fim de se estabelecer 10 a concentração mínima de antiveneno capaz de neutralizar a atividade hemolítica) a 37 °C por 30 minutos antes de acrescentadas as hemácias.

33.7. Ensaio de inibição da atividade miotóxica (medida da atividade de Creatino Quinase) 33.7.1. Obtenção do sangue

Os ensaios de liberação de creatino quinase (CK) para se testar a tividade miotóxica do veneno de abelhas foram realizados segundo Rocha e col. (2007). Foram injetados 0μg de veneno de abelhas total ou de fração não 2 0 imunoreativa, ou ainda o antiveneno isolado no músculo t ibial anterior de camundongos machos Balb/c. Para certificar a ação neutralizadora do antiveneno na atividade miotóxica,. o veneno foi incubado juntamente com o antiveneno na proporção 1:58 a 37°C por meia hora antes de 25 ser injetado.

Solução salina foi utilizada como controle. Após 3 horas os camundongos foram anestesiados, o sangue total, coletado em tubo heparinizado, foi retirado pelo plexo ocular ou por punção cardíaca e os animais foram 30 sacrificados por deslocamento da coluna vertebral. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado por 10 minutos a 3000 rpm, em uma centrífuga Compacta Avanti 30 (Beckman, Fullerton, CA, EUA). Os sobrenadantes foram utilizados para a leitura da atividade de creatino-quinase (CK).

33.7.2. Leitura da atividade de CK

Para a leitura da atividade enzimática foi utilizado o kit método cinético-UV, líquido estável, (Laborlab, Guarulhos, SP, Brasil) seguindo as instruções do fabricante. Para a preparação do reagente de trabalho 10 misturou-se uma parte do Reativo Tampão 1+4 partes do Reativo enzimático 2. A reação foi realizada a 25°C. 20L do sobrenadante do sangue coletado foi misturado com ImL do reagente de trabalho. Esta solução foi mantida por 3 minutos, disparou-se o cronômetro e foram realizadas 15 leituras a 340nm a cada um minuto durante 4 minutos.

Calculou-se o decréscimo médio de absorbância por minuto (ΔA/min) e aplicou-se a seguinte fórmula para obtenção da atividade enzimática: ΔA/min x 8095 = U/L

34. RESULTADOS

A figura 3 mostra o perfil protéico, em eletroforese 2-D, do veneno bruto dialisado na presença dos inibidores de protease EDTA, PMSF e Leupeptina.

34.1. Eletroforese bidimensional

A coluna de afinidade foi então montada na proporção 25 1:58 (proteínas do veneno: proteína do soro) e a totalidade de proteínas de veneno aplicada foi recuperada quando somadas as proteínas eluídas nos diferentes pHs. Os géis referentes a estas frações estão mostrados nas figuras 4 e 5. A figura 4 mostra o perfil da eletroforese 2-D da fração 30 não imunoreativa (eluída em pH 8,0), enquanto que a figura mostra o perfil da eletroforese 2-D da fração imunoreativa eluída em pH ácido (2,8). Os "spots" destes três géis e os "spots" do gel de veneno total dialisado foram então recortados para identificação. Ainda foi eluída 5 desta cromatografia, uma fração imunoreativa eluída em pH 10,7, cujo perfil de proteínas em eletroforese 2-D está mostrado na figura 6. Os "spots" de proteínas foram numerados individualmente para posterior identificação.

34.2. Analise proteômica

Todos os spots dos quatro géis (veneno total, fração não imunoreativa, fração imunoreativa eluída em pH ácido e fração imunoreativa eluída em pH básico) provenientes da cromatografia de afinidade realizada na proporção de proteínas veneno:soro igual a 1:58 (veneno extraído na 15 presença de inibidores de protease), foram submetidos à analises proteômicas, realizando-se inicialmente o sequenciamento por espectrometria de massas, perfazendo um total de 122 "spots" submetidos. Destes, 113 foram identificados.

As tabelas 1 a 4 mostram as identificações das proteínas presentes no veneno de abelhas.

A partir destes resultados foi possível listar as proteínas que estão presentes no veneno de abelhas total, conforme mostra a tabela 5.

34.3. Imunodetecção (Western Blotting)

O Western Blotting realizado na proporção 1:58 (proteínas de veneno:antiveneno) (figura 7) detectou um total de 33 spots de proteínas imunoreativas ao soro antiveneno de abelhas.

Foram correlacionadas as identificações dos spots de proteínas imunoreativas no ensaio de Western Blotting (WB) mostrado na figura 7, com os "spots" equivalentes, observados nos géis de eletroforese 2-D das Figuras 3 a 6 (já identificadas nas tabelas de 1 a 4) , e as proteínas imunoreativas identificadas neste ensaio estão descritas na tabela 6.

Estes resultados mostram que algumas proteínas eluídas na fração não reconhecida pelo antiveneno imobilizado na cromatografia de afinidade (fração não-imunoreativa), foram reconhecidas pelos anticorpos presentes no soro antíveneno (na forma solúvel) quando submetidos a ensaios de reconhecimento em solução (no ensaio de WB), no qual as moléculas ficam mais livres para melhor interagir. Esta situação é mais próxima da realidade (quando o veneno é injetado no organismo), diferentemente do estado em que ficam as moléculas de anticorpo quando imobilizados na coluna (na cromatografia de afinidade) . A etapa cromatográfica entretanto foi necessária para identificação 5 da totalidade de proteínas presentes no veneno de abelhas, muitas não visualizadas no perfil do veneno total dialisado. A detecção de spots não identificados é explicada pelo fato da sensibilidade de detecção pelo anticorpo ser muito maior do que a sensibilidade de 10 detecção por métodos colorimétricos utilizados na coloração do gel. Por isso alguns spots evidenciados na membrana de Western Blotting não são visíveis no gel 2D.

Portanto, todas as proteínas imunoreativas ao soro antiveneno de abelhas, detectadas pel combinação das duas 15 estratégias (cromatografia de afinidade + eletroforese 2D e Western Blotting) estão listadas na tabela 7:

34.4. Ensaios de potência 34.4.1 Ensaios biológicos

Todos os ensaios biológicos foram realizados com 20 veneno total de abelhas, sem diálise.

Ensaios de citotoxicidade e soroneutralização foram realizados no Instituto Butantan a fim de se estabelecer a melhor proporção veneno:antiveneno para neutralização da atividade citotóxica. Foram testados diferentes tipos 5 celulares e decidiu-se utilizar as células de ovário de hamster chinês (CHO), por questões de susceptibilidade ao veneno e melhor crescimento celular. O melhor período de incubação das células com o veneno foi de 60 minutos.

Realizando-se diluições de veneno para se estabelecer 10 a menor concentração de veneno com atividade citotóxica, chegou-se a uma concentração mínima de 108,24 μg de proteínas de veneno (tabela 8), necessária para matar 100% das células.

Foram realizados ensaios de soroneutralização, 15 fixando-se esta concentração de veneno e variando-se a quantidade de antiveneno necessária para neutralizar a atividade citotóxica. Chegou-se a uma quantidade de 6277,92 μg de proteínas de antiveneno necessárias para neutralizar 108,24 μg de proteínas de veneno (tabela 9) , ou seja, uma 20 proporção de 1:58 (proteínas de veneno:proteínas de anti- veneno).

Foram também realizados testes de atividade hemolítica e soro-neutralização desta atividade pelo antiveneno, semelhantemente ao que foi feito para a determinação da atividade citotóxica do veneno. Considerando-se o perfil da atividade hemolítica do veneno bruto de A. mellifera (tabela 10) , foi escolhida a concentração mínima capaz de lisar 100% das hemácias, no caso 0,3125 μg/μL para os ensaios de neutralização com o anti-veneno.

Desta maneira, foram realizados ensaios para determinar a quantidade de antiveneno necessária para neutralizar a atividade hemolítica do veneno na concentração de 0,3125 μg/μL. Os resultados obtidos (tabela 11) mostram que a 5 proporção de 1:50 ( proteína do veneno: proteína do anti veneno) foi suficiente para neutralizar a hemólise causada pelo veneno na concentração de 0,3125 μg/μL.

Com base nos resultados obtidos nos ensaios de soroneutralização das atividades hemolítica e citotóxica (1:50 e 1:58, respectivamente) , adotada a maior proporção necessária, ou seja, 1:58 para realização dos ensiaos de soroneutralização da atividade miotóxica do veneno. Esta proporção proteínas de veneno:antiveneno mostrou-se eficiente 15 . na neutralização da atividade miotóxica testada in vivo, conforme mostra abaixo a tabela 12.

35. Conclusões a partir dos testes de potência

Os ensaios biológicos para certificação da potência do soro, ou seja, sua ação neutral izadora, mostraram que o soro antiveneno produzido da forma descrita acima foi 5 eficiente na neutralização das atividades citotóxicas, miotóxicas e liberação de creatino-quinase. Além disso, o ensaio de Immunoblotting, juntamente com a cromatografia de afinidade, mostrou que 8 diferentes proteínas, totalizando 31 quando contabilizadas as isoformas, são reconhecidas 10 (neutralizadas) pelos anticorpos presentes no soro antiveneno.

A dose estimada de veneno inoculado numa vítima adulta de peso 70 Kg, que tenha sofrido de 1000 ferroadas ( considerada fatal) é 1,3 mg/kg, ouseja, 91 mg total de 15 veneno (Schumacher e Egen, 1995). Considerando-se que aproximadamente 22,5% do peso seco do veneno de abelhas é constituído de proteínas, e que 1000 ferroadas de abelhas contém aproximadamente 91 mg que a concentração de anticorpos no anti-veneno foi de 20,85 mg/mL, , tem-se:- lmg de veneno bruto de abelhas contem aproximadamente 0,225mg de proteínas, logo, 9lmg de veneno contem 20,4 75mg de proteínas; - para neutralizar esta quantidade de proteínas (20,475mg), na proporção testada nos testes de potência (1:58) são necessárias 1187,55mg de proteínas do anti-veneno; - na concentração 20,85mg de proteínas por mL de soro, são necessários 56,95 mL DE SORO PARA NEUTRALIZAR A AÇÃO DE 1000 FERROADAS DE ABELHAS;

O valor calculado acima está na mesma faixa de eficiência dos melhores anti-venenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no mundo.

36. Procedimentos e Considerações Finais 36.1. Data de Fabricação

A data de fabricação do soro produto acabado a granel é aquela correspondente ao dia da formulação do produto acabado a granel.

36.2. Estocagem dos Lotes do Soro Produto Acabado a Granel

Após a retirada das amostras, os frascos ou bolsas do soro produto acabado a granel são armazenados em câmara fria à temperatura de 2 °C a 8 °C até a liberação dos < resultados pelo Serviço de Controle de Qualidade.

36.3. Arquivo de Amostras

De cada lote de soro produto acabado a granel é retirada uma amostra e conservada à temperatura de 2°C a 8 °C, devidamente identificada, por 6 0 meses a partir da data da ultima prova de potência.

36.4. Registros

Os dados do processo de fabricação de cada lote de soro produto acabado a granel e os resultados das provas de controle, são registrados e arquivados. As cópias destas documentações são arquivadas na Seção de Processamento de 30 Plasmas Hiperimunes.

36.5. Liberação do Soro Produto Acabado a Granel pelo Serviço de Controle de Qualidade Interno.

Após a liberação dos resultados pelo Serviço de Controle de Qualidade, o produto recebe a etiqueta de 5 "APROVADO" e aguarda a ordem de envase emitida pela Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção.

36.6. Reprocessamento

O soro acabado a granel poderá ser reprocessado por ordem da Diretoria de Divisão de Desenvolvimento 10 Tecnológico e Produção após liberação dos resultados emitidos pelo Serviço de Controle de Qualidade na seguinte situações: a) Reprovado no teste fisico-químico tais como: concentração de fenol, concentração de cloreto de sódio e 15 pH. Em caso de excesso destes elementos, o produto acabado a granel deverá ser submetido ao processo de dessanilização (IB/POP/PS/P-004) e concentração e receber novo número de lote de soro concentrado a granel. b) Reprovado no teste biológico de potência. Neste caso o 20 soro acabado a granel deverá ser concentrado e receber novo número de lote de soro concentrado a granel. c) Reprovado no teste biológico de pirogênio "In Vivo" e microbiológico de esterilidade. Nestes casos os soros acabados a granel deverão ser submetidos a cromatografia em 25 gel de troca iônica e concentração e receber novo número de lote de soro concentrado a granel.

36.7. Descarte

O soro acabado a granel poderá ser descartado por ordem da Diretoria de Divisão de Desenvolvimento 30 Tecnológico e Produção se após o reprocessamento, for reprovado nos testes de controle de qualidade. Além disso, poderá ser aproveitado para ensaios "In Vitro" de pesquisa e desenvolvimento. O soro produto acabado a granel e outros materiais a serem descartados são colocados a disposição da

Divisão de Desenvolvimento Tecnológico e Produção mediante ofício emitido pela Seção de Processamento de Plasmas Hiperimunes.

36.8. Expedição do Soro Produto Acabado a Granel

Com ordem de envase expedida pela Divisão de

Desenvolvimento Tecnológico e Produção, o produto é encaminhado para o envase com a respectiva documentação de produção.

36.9. Prazo de Validade

O prazo de validade do lote final de soro heterólogo é de 36 meses contados a partir da data de fabricação do produto acabado a granel.

A presente invenção apresenta o processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha. Embora a invenção tenha sido ilustrada com exemplo no qual as etapas são específicas, o mesmo se destina a ser típico do processo em geral, não limitando de maneira alguma o escopo da invenção.

37. REFERÊNCIAS:

Candiano, G., Bruschi, M. , Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., and Righetti, P. G. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis 25: 1327-1333, 2004. de Souza, B. M. ; Mendes, M. A. ; Santos, L. D. ; Marques, M. R.; César, L. M.; Almeida, R. N. A.; Pagnocca, F. C.; Konno, K. ; Palma, M. S. Structural and functional characterization of two novel peptide toxins isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista. New York, Peptides, v.26, p.2157-64, 2005 Schumacher, M.J.; Egen, N.B. Significance of Africanized bees for public health. Arch Intern Med., V.155, p.2038-2043, 1995. Sedmak, J.J.; Groosberg, S. E. A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue 10 G-250. Analytical Biochemistry, v.79, p. 544-552, 1977. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, 0. and Mann, M. Anal. Chem. 68, pp.850-858, 1996. Rocha T.,- Barros L.L.S.; Santos L.D.; De Souza, B.M.; Palma M.S; Cruz-Hôfling M.A. Phospholipase A2 and mastoparan from 15 Polybia paulista wasp venom on mice skeletal muscle. J.Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis. V.13(1), 2007.

Claims (4)

1. Processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) extração do veneno total de Apis melífera ssp. manualmente ou método automatizado; b) imunização de cavalos utilizando o veneno total de Apis mellifera ssp. com as frações proteicas selecionadas do grupo que compreendem fosfolipase A2 (diversas isoformas), fosfatase ácida, hialuronidase, proteínas abundantes de geleia Real (MRPJ)-9, Fatores de Crescimento Derivados de Plaqueta (PDGF) e Fatores de Crescimento Endotelial vascular (VEGF), melitina, MRJP-1, precursor de melitina, transferrina, alfa-glicosidase, MRJP-2 e MRJP-8; e c) purificação de IgG total dos antissoros, através da mistura e processamento com ácido caprílico ou outro método por diferença de solubilidade e tratamento enzimático por pepsina.

2. Processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a purificação foi realizada nas seguintes condições: I - Primeira precipitação: a) adicionar sulfato de amônio 50% sob agitação ao plasma a granel até saturação final de 29%; b) ajustar o pH para 6,8 a 6,9 com solução de ácido cítrico 40% ou solução de hidróxido de sódio 40% sob agitação; e c) agitar por 30 minutos, repousar por 4 horas, e separar as fases por centrifugação; 11- Segunda precipitação: a) diluir o precipitado obtido na primeira precipitação com água para injetáveis sob agitação até concentração de proteínas ser < 4% (p/p) e saturação de sulfato de amônio < 8% (p/p); b) ajustar o pH para 3,1 a 3,2 com solução de ácido cítrico 40% ou solução de hidróxido de sódio 40% sob agitação; c) adicionar pepsina na proporção 1:80 (pepsina:proteína) e manter sob agitação por 10 minutos; d) ajustar o pH para 3,1 a 3,2 com solução de ácido cítrico 40% ou solução de hidróxido de sódio 40% e manter sob agitação por 35 minutos; e) ajustar o pH para 4,5 a 4,6 com solução hidróxido de sódio 40%; f) adicionar solução sulfato de amônio 50% até saturação final de 11,3%; g) ajustar o pH par 4,5 a 4,6 sob agitação; h) adicionar ácido caprílico para uma concentração final de 0,01M, e manter sob agitação constante por 30 minutos; i) termoregular o produto através de aquecimento a 55 °C por 60 minutos sob agitação; j) ajustar o pH para 6.8 - 6.9 com solução de hidróxido de sódio 40%; k) resfriar o produto para 25°C - 29°C; l) adicionar solução de sulfato de amônio 50% até saturação final de 17,6% (p/p) e manter sob agitação por 30 minutos; m) verificar novamente a concentração de sulfato de amônio por condutividade e ajustar se necessário; n) ajustar o pH para 6,8 a 6,9 e manter em agitação por mais 30 minutos; e o) separar as fases por centrifugação, recuperar a fase líquida (sobrenadante) e desprezar a fase sólida (precipitado); III - Dessalinizar o sobrenadante obtido na segunda precipitação por ultrafiltração molecular com membrana de corte de 30kDa; e IV - Submeter à cromatografia em coluna de troca iônica utilizando tampão fostato com NaCl.

3. Processo de obtenção de soro equino antiveneno de abelha, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação neutraliza as proteínas: transferina, alfa-glicosidase, protease homóloga à proteinase 26,29kDa de Sarcophaga, proteina Kruppel-like, MRJP1, MRJP2, similar a (CG15011-PA, proteína com domínio de dedo de zinco, proteína similar a Stretchin-Mick (quinase de cadeia leve da miosina) CG18255-PA, isoforma A e similar aos fatores PDGF- e VEGF- (CG7103-PaA).

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa de purificação foi introduzido uma etapa de visualização de gel de eletroforese 2-D.