NL8402182A - Humane eiwitten, antiserum en proefuitrustingen. - Google Patents

Description

* N.0. 32.608

Humane eiwitten, antiserum en proefuitrustingen.

De uitvinding heeft betrekking op twee zuivere humane granuloeyt-eiwitten, werkwijzen voor het isoleren en zuiveren daarvan, toepassing 5 daarvan, tegen deze eiwitten geproduceerde antisera, werkwijzen ter bereiding van de antisera, toepassing van deze antisera en proefuitrus-tingen, die deze antisera bevatten.

Van de bloedcellen bezitten alleen de witte bloedcellen, de leuko-cyten, kernen en alleen deze zijn in staat de vele eiwitten te produce-10 ren, die in bloedplasma worden gevonden. Eén mm^ bevat ongeveer 6000 tot 10000 leukocyten. Een ondergroep van de leukocyten zijn de granulo-cyten, die weer onderverdeeld worden in neutrofiele, polymorfkernige granulocyten, die ongeveer 95% van alle granulocyten uitmaken, eosino-fiele granulocyten en basofiele granulocyten. Bij gezonde volwassenen V^5 worden per dag ongeveer 10^ granulocyten door het beenmerg afgegeven, maar dit kan tijdens ernstige infecties en inflammatore toestanden het tienvoudige worden verhoogd. Normaliter bezitten de leukocyten een verblijftijd van ongeveer 6 uren in de circulatie, voordat zij in de weefsels binnendringen, waar zij hun biologische functies vervullen en 20 tenslotte worden gesequestreerd. De turnover van leukocyten kan bij gezonde en zieke toestand aanzienlijk verschillen, zoals blijkt uit onderzoekingen onder toepassing van met isotopen gemerkte granulocyten alsmede histologische methoden, die een wisselende mate van leukocytin-filtratie in weefsels te zien geven. Geen van deze methoden staat ech-25 ter direct ter beschikking voor klinische onderzoeken met betrekking tot de turnover van leukocyten. Een alternatieve en beter beschikbare methode kan het volgen van de afgifte van één of meer karakteristieke leukocyteiwitten zijn tijdens de werking en/of de sequestrering van de leukocyten.

30 In drie vroegere publicaties zijn ondervindingen vermeld, die erop wijzen, dat leukocyten een aantal eiwitten bevatten, waarvan de concentratie tijdens verschillende ziekten kan wisselen. Enkele van deze eiwitten zijn aangeduid als LI, in het bijzonder pi 6.3 en pi 6.5 LI (li-teratuurplaats 1 en 2) of Rï6 en R:7 (literatuurplaats 3). Volgens de 35 twee-dimensionele elektroforetische analyse (IS0-DALT) is het pi 6.5 LI eiwit identiek met het R:6 eiwit en is het p.1 6.3 Ll eiwit identiek met het R:7 eiwit. In de publicaties (1) tot (3) werden de eiwitten bij analysemethoden vastgesteld onder honderden tot duizenden andere eiwitten. In publicatie (1) werden pogingen ondernomen de Ll-eiwitten te 40 zuiveren teneinde kwantitatieve methoden en voorbereidende karakterise- 8402182 / * * * 2 ringen vast te stellen. Preparatieve gelfiltratie, isoelektrische fo-cussering- en affiniteitschromatografie leverden een eiwit met een mo- v lecuulgewicht van ongeveer 51000 Dalton (volgens SDS polyacrylamidegel-elektroforese en gelfiltratie), dat zeer instabiel was, maar dat voor 5 het immuniseren van konijnen kon worden gebruikt (1). De in literatuur-plaats (1) toegepaste methoden voor het isoleren en zuiveren leverden slechts zeer geringe opbrengsten van het eiwit van. 51000 Dalton en dikwijls ging het eiwit tijdens de behandelingen verloren. Immunisering van konijnen door het eiwit van 51000 Dalton in te spuiten leverde een 10 antiserum tegen de LI eiwitten, maar dikwijls eveneens antilichamen tegen andere eiwitten. Deze antisera moesten van de ongewenste antilicha-men worden bevrijd door adsorptie met normaal humaan serum of met humane weefselextracten. In publicatie (1) werden niet-gefractioneerde leu-kocyten door bevriezing/ontdooiing en mechanische homogenisering van de 15 leukocyten zonder toevoeging van enzyminhibitors geëxtraheerd.

In publicatie (3) zijn alleen analysemethoden beschreven voor de bepaling van de R:6 en R:7 eiwitten, maar geen methoden voor de isolering of zuivering.

De uitvinding heeft ten doel milde en doeltreffende werkwijzen 20 vast te stellen voor het extraheren en zuiveren van de LI eiwitten uit leukocyten, die de karakterisering daarvan mogelijk maken, en monospe-cifieke antisera of antilichamen tegen deze eiwitten te bereiden. Verder heeft de uitvinding een doel proefuitrustingen te verschaffen, die dergelijke antisera en/of dergelijke gezuiverde LI eiwitten bevatten, 25 die eventueel gemerkt zijn met een radioactief isotoop of met een enzym, dat geschikt is voor kwantitatieve bepalingen van LI eiwitten in lichaamsvloeistoffen of cel- of weefselextracten.

Verrassenderwijs werd gevonden, dat de Ll eiwitten in een zuivere en stabiele toestand konden worden verkregen, indien alleen granulocy-30 ten als uitgangsmateriaal worden gebruikt en indien de granulocyten onder zodanige omstandigheden worden vernietigd, dat de lysosomen binnen de granulocyten niet gelijktijdig worden vernietigd. Deze opgave wordt bereikt door drukhomogenisering van de granulocyten bij aanwezigheid van een enzyminhibitor en een middel, dat de lysosomale membranen sta-35 biliseert.

De uitvinding heeft daarom betrekking op zuivere pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwitten en mengsels daarvan, werkwijzen voor de extractie daarvan uit granulocyten door drukhomogeniseren van de granulocyten bij aanwezigheid van een enzyminhibitor en een middel, dat de lysosomale membra-40 nen stabiliseert, alsmede de zuivering ervan volgens diverse methoden, 8402182 3 φ ιί het gebruik van deze eiwitten voor de bereiding van monospecifieke antisera of antilichamen, werkwijzen ter bereiding van de monospecifieke antisera of antilichamen door immunisering van proefdieren met de LI eiwitten, de monospecifieke antisera en antilichamen als zodanig, de toe-5 passing van de antisera of antilichamen en/of de gezuiverde LI eiwitten voor kwalitatieve en/of kwantatieve bepaling van de Ll eiwitten in cellen, weefsels en lichaamsvloeistoffen en proefuitrustingen, die de zuivere Ll eiwitten, antisera en/of antilichamen bevatten, die eventueel gemerkt zijn met radioactieve isotopen of met enzymen.

10 De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op de zuivere pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwitten, mengsels daarvan en zouten daarvan.

Zouten van de Ll eiwitten zijn in het bijzonder niet-toxische, farmaceutisch toelaatbare zouten of anders zouten, die gebruikt kunnen worden voor precipitatie- en/of zuiveringsprocessen van de L-l eiwit-15 ten.

Dergelijke zouten zijn bijvoorbeeld metaalzouten, zoals alkalime-taal- of aardalkalimetaalzouten, bijvoorbeeld natrium—, kalium-, magnesium- of calciumzouten, of zinkzouten en dergelijke, of ammoniumzouten met ammoniak of met primaire, secundaire of tertiaire amines, bijvoor-20 beeld zouten met alifatische, cydoalifatische, cycloalifatische-alifa-tische of aralifatische primaire, secundaire of tertiaire aminen, zoals met mono-, di- of trialkylaminen, waarvan de alkylgroep een klein aantal koolstofatomen bezitten, bijvoorbeeld triethylamine of hydroxyalky laminen, waarvan de hydroxyalkylgroep een klein aantal koolstofatomen 25 bezit, bijvoorbeeld 2-hydroxyethylamIne, bis (2-hydroxyethyl)amine of tris (2-hydroxyethyl)amine, of met basische, alifatische esters van carbonzuren, bijvoorbeeld kleine alkylesters van ethyleendiaminetetra-azijnzuur, bijvoorbeeld de tetraethylester, en dergelijke.

Verdere zouten zijn zuuradditiezouten met anorganische zuren, in 30 het bijzonder minerale zuren, zoals waterstofchloride, zwavelzuur, fos-forzuur, of met organische zuren, zoals carbon-, sulfon- of sulfozuren, eventueel gesubstitueerd klein alkaancarbonzuur, bijvoorbeeld azijnzuur, propionzuur, glycolzuur, maleinezuur, hydroxymaleïnezuur, methyl-maleïnezuur, malonzuur, fumaarzuur, wijnsteenzuur, citroenzuur, of 35 eventueel gesubstitueerde aromatische zuren, bijvoorbeeld benzoëzuur, kaneelzuur, amandelzuur, salicylzuur, 4-amino-salicylzuur, 2-fenoxyben-zoëzuur, 2-acetoxybenzoëzuur, embonzuur, nicotinezuur, isonicotinezuur of aminozuren, kleine alkaansulfonzuren, bijvoorbeeld methaansulfon-zuur, ethaansulfonzuur, 2-hydroxyethaansulfonzuur, benzeensulfonzuur, 40 4-methylbenzeensulfonzuur, naftaleensulfonzuur of ascorbinezuur en der- 8402182 * .9 * 4 gelijke.

De eiwitten worden beide gekarakteriseerd door de isoelektrische punten ervan bij een pH van 6,3 resp. een pH van 6,5. Het molecuulge-wicht van beide eiwitten, zoals bepaald door gelfiltratie en scheiding 5 volgens de dichtheidsgradiënt met de ultracentrifuge, is gelijk en bedraagt ongeveer 36500 Dalton. Bij de SDS-elektroforese aan polyacryl-amidegel blijken de eiwitten te bestaan uit drie polypeptiden met ongeveer een gelijk molecuulgewicht van 12500 Dalton. Elk van deze polypep-tideketens bezit de volgende aminozuurvolgorde uitgaande van het N-ein-10 de: Meth-Leu-Thre-Glu, zoals blijkt volgens de gestandadiseerde Edman methode. De netto elektrische lading en de beschikbaarheid van antigene plaatsen aan de LI eiwitten worden sterk beïnvloed door de afwezigheid of aanwezigheid van calciumionen. De eiwitten zullen veel sterker als antigenen in vitro reageren bij aanwezigheid van calciumionen.

15 De thermische stabiliteit van de LI eiwitten is hoog bij neutrale en alkalische pH. Bij 15 min. koken in waterig 5 mM EDTA, pH.8,5 zal 90% van het eiwit behouden blijven. De LI eiwitten worden door ethanol ten dele geprecipiteerd bij een zure pH, bijvoorbeeld tussen ongeveer 4 en 5.

20 De LI eiwitten bezitten een karakteristieke verdeling in het men selijke lichaam en worden in grote hoeveelheden gevonden in neutrofiele granulocyten, monocyten en squameuze epitheelcellen, afgezien van de normale huid. Zij worden eveneens in vele kankercellen van het squameuze epitheliële type en enkele leukemie- en lymfomacellen, in het bij-25 zonder die van het myelogene leukemische type en monocytische lymfoma-type, gevonden. LI eiwitten worden in het overwegende deel van de squa-meuze kankers van de urineweg en longen gevonden. De LI eiwitten zijn eveneens in andere lichaamsvloeistoffen aanwezig in vrij lage concentraties bij gezonde individuën maar in toenemende concentraties onder 30 omstandigheden met een toenemende mate van ontsteking. In de witte bloedcellen zijn de LI eiwitten voor 90% aanwezig in de cytosolfractie.

De LI eiwitten kunnen als marker-eiwitten worden gebruikt, in het 125 bijzonder in een radioactieve gemerkte vorm, bijvoorbeeld met J of voor de kwalitatieve en/of kwantitatieve bepaling van het Li 35 eiwitgehalte in lichaamsvloeistoffen, cellen en weefsels.

De LI eiwitten zijn goede immunogenen in dieren, bijvoorbeeld konijnen.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor de bereiding van de zuivere pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwitten, mengsels daarvan 40 en zouten daarvan, die het kenmerk bezit, dat humane granulocyten in 8402182 % j # * 5 een geschikt boffersysteem worden verbroken, het niet-oplosbare celma-teriaal wordt verwijderd en de bovenstaande vloeistof onderworpen wordt aan a) isoelektrische focussering en eluëring van de banden, die het pi 6.3 5 en/of pi 6.5 LI eiwit bevatten, met een buffer, of b) anionuitwisselingschromatografie met een EDTA-bevattende buffer bij een pH van ongeveer 8,5 en eluëring van de gewenste LI eiwitten met een buffer, die calciumionen bevat, of c) affiniteitschromatografie, of 10 d) preparatieve agarosegelelektroforese, of e) kationenuitwisselingschromatografie, of f) gelfiltratie, of g) reversibele precipitatie met Zn4"*" of enige combxnacxe vau trappen a) rot g), de eluaten van mogelijke amfo-15 lyten en/of zouten worden bevrijd, de verkregen oplossing van de zuivere LI eiwitten wordt geconcentreerd en de verkregen oplossing desgewenst wordt gelyofiliseerd en de verkregen LI eiwitten desgewenst in een zout worden omgezet of het verkregen zout in de vrije eiwitten wordt omgezet.

20 De granulocyten, die als uitgangsmateriaal voor de extractie van de LI eiwitten worden gebruikt, worden volgens een willekeurige gebruikelijke methode uit vers humaan bloed verkregen, bijvoorbeeld door dex-transedimentatie en scheiding volgens de dichtheidsgradiënt door centrifugering .

25 let buffersysteem, waarin de granulocyten worden verbroken, bevat een middel, dat gelijktijdige verbreking van de lysosomen voorkomt, zoals glycerol, dextranen en bij voorkeur sucrose, in een voldoende concentratie om de osmotische druk voor en na het verbreken van de celwan-den te stabiliseren. Zo wordt sucrose bijvoorbeeld gebruikt voor een 30 concentratie tussen 0,27 en 0,34 M. Het buffersysteem bevat verder en-zyminhibitors, die vertering van de LI eiwitten voorkomen, zoals diiso- (to propylfluorfosfaat (DFP), sojabonentrypslneinhibitor, Trasilol , kwikbenzoaat, pepstatine A en bij voorkeur fenylmethylsulfonylfluoride (PMFS) en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of mengsels daarvan.

35 Het verbreken van de celwanden kan op een gebruikelijke wijze wor den uitgevoerd, bijvoorbeeld mechanisch, bijvoorbeeld met behulp van een roterende menger, een vijzel (Potter-Elvelyem methode) door ultrasone trilling, bevriezen en ontdooien, of combinaties van deze methoden. Volgens een bij voorkeur toegepaste methode worden de granulocyten 40 verbroken door drukhomogenisering.

8402182 . » * . * 6

Na het verbreken van de granulocyten worden onoplosbare materialen, zoals niet verbroken cellen, celresten en lysosomen verwijderd, bijvoorbeeld met behulp van de ultracentrifuge.

De LI eiwitten worden uit het ruwe granulocytextract in zuivere 5 vorm verkregen volgens een van de volgende zuiveringsmethoden: a) Isoelektrische focussering: Het isoelektrisch focusseren wordt bij voorkeur uitgevoerd in een gegranuleerd gel, zoals agarose of gepolyme-riseerde dextranparels, die een geschikt mengsel van in de handel verkrijgbaar amfolyten bevatten voor het verschaffen van een stabiele pH- 10 gradiënt van ongeveer pH 5 tot 8 tijdens de uitvoering. Dit isoelektrisch focusseren wordt uitgevoerd met een maximale spanning van ongeveer 25 V/cm gedurende ongeveer 10 tot 20 uren bij een temperatuur van ongeveer 5° tot 15°. Een gel, dat de voorkeur verdient, is (R)

Ultrodexv 1 en het amfolyt, dat de voorkeur verdient, is 15 Ampholine^^.

Het monster wordt bij voorkeur aan de kathodische zijde van het gel aangebracht.

Het localiseren van de banden van LI eiwit kan worden uitgevoerd door pH-metingen langs het geloppervlak of door filtreerpapierafdrukken 20 van het bovenoppervlak te kleuren, bijvoorbeeld met coomassieblauw.

De banden, die de LI eiwitten bevatten, worden afgeschraapt en met een geschikt EDTA bevattende buffer geëlueerd bij een pH tussen ongeveer 7,5 ten ongeveer 9, bij voorkeur bij een pH van ongeveer 8,5.

Het eluaat wordt van de amfolyten en de zouten bevrijd door dialy— 25 se en/of gelfiltratie en door ultrafiltratie en/of lyofilisering geconcentreerd .

b) Anionenuitwisselingschromatografie i De bij deze methode gebruikte anionuitwisselende materialen bevatten bijvoorbeeld tertiaire of qua- ternaire ammoniumgroepen en zijn bijvoorbeeld diethylaminoethylcellulo- (R) 30 se, bijvoorbeeld diethylaminoethyl-Sepharosev 1 of QAE-cellulose (quaternair ammoniumethylcellulose). Het granulocytextract, dat de Ll eiwitten bevat, wordt op de kolom aangebracht in een buffer met een lage ionenconcentratie, die EDTA bevat en een pH van 8,5 bezit. De Ll eiwitten worden op specifieke wijze geëlueerd met een calciumionen bevat-35 tende buffer, bijvoorbeeld een buffer, die 30 mM barbital en 5 mM cal-ciumchloride bevat.

c) Affiniteitschromatografie: Een derde methode voor het zuiveren van het Ll eiwit is gebaseerd op affiniteitschromatografie. Deze kan worden uitgevoerd aan glasparels met een geregelde poriëngrootte en een groot 40 oppervlak, bijvoorbeeld ongeveer 50 mVg. De glasparels worden in een 8402182 * ^ * 7 kolom gebracht en het ruwe granulocytextract wordt in een geschikte buffer met een kleine molariteit, die calciumionen bevat, bij een neutrale of enigszins zure pH, bijvoorbeeld een pH van ongeveer 6 tot 7, aangebracht. De LI eiwitten worden 'geëlueerd met een alkalische buffer 5 met een pH van ongeveer 7,5 tot 8,5, die ongeveer 50 mM EDTA en poly-ethyleenglycol of lithiumbromide bevat.

Bij andere affiniteitschromatografiemethoden wordt gebruik gemaakt van een anti-Ll-antilichaamkolom. De LI eiwitten worden aan de antili-chamen geadsorbeerd, terwijl de andere eiwitten met een buffer worden 10 uitgewassen. Daarna worden de LI eiwitten geëlueerd met een zoutoplossing, zoals met een waterige buffer met een pH van ongeveer 3,5, die een zout, zoals natriumchloride of natriumjodide, bevat.

d) Preparatieve agarose-gelelektroforese: Agarosegelen in de vorm van een viak bed van de juiste afmetingen worden gebruikt, die 75 mM barbi- 15 tal/2,5 mM EDTA-buffer, pH 8,5, bevatten. De elektroforese wordt gedu rende 10-18 uren uitgevoerd bij 4 V/cm. De Ll eiwitbanden worden door kleuren van filtreerpapierafdrukken van het bovenoppervlak van het gel gelocaliseerd. De Ll eiwitbanden zullen in het ot2-8l°bulinegebied worden gevonden en worden geëlueerd door bevriezen/ontdooien en centri-20 fugeren van de betreffende stroken van het agarosegel.

e) Kationenuitwisselingschromatografie; Kationenuitwisselingschromato-grafie wordt uitgevoerd aan kationenuitwisselende harsen, zoals door sulfopropyl gesubstitueerde cellulose of gepolymeriseerd dextran. Het ruwe granulocytextract wordt op de kolom aangebracht, nadat het gemengd 25 is met een buffer met een kleine ionensterkte, die calciumionen bevat, met een pH van ongeveer 6. Niet geadsorbeerde eiwitten worden met de uitgangsbuffer weggewassen en de Ll eiwitten worden geëlueerd met een buffer, die EDTA en natriumionen in toenemende concentratie bevat.

f ΒΛ f) Gelfiltratie: Voor de gelfiltratie worden Sephadex J G75 tot .

30 G200 agarosegelen (Sepharosegelen), zoals ültragel - of poly- acrylamidegelparels, zoals Bio-Gelv 1 P-60, gebruikt. Het verdient de voorkeur, dat de kolom een lange kolom is. De lengte van de kolom dient ongeveer 50 maal de diameter te zijn. Het ruwe granulocytextract wordt als zodanig aangebracht en de Ll eiwitten worden gechromatogra-35 feerd. Voor het vullen van de kolom en werken ermee wordt een buffer gebruikt, die bij voorkeur 0,1 M natriumcitraat, 2,5 mM EDTA-K2 en 0,25 mM thimerosal bevat en een pH van 8,5 bezit. De Ll eiwitten zullen worden gevonden in een fractie, die overeenkomt met een molecuulgewicht van 35000 tot 40000 Dalton.

40 g) Reversibele precipitatie met Zn**; De Ll eiwitten worden kwanti- 8402132 r *

V

•k 8 tatief uit waterige oplossingen met een neutrale of alkalische pH geprecipiteerd door behandeling met Zn^-ionen, in het bijzonder in de vorm van in water oplosbare 2inkzouten, zoals zinkacetaat of zink-chloride. Zo kan bijvoorbeeld een waterige oplossing, die de LI eiwit-5 ten bevat, bij een pH van ongeveer 8,5 worden behandeld met een ongeveer 10 mM tot 100 mM zinkacetaatoplossing in water. Het geprecipiteerde Ll zinkzout wordt verzameld, indien noodzakelijk met een waterige bufferoplossing gewassen, met een complexen vormend zuur, bijvoorbeeld in ongeveer 100 mM dikalium-ethyleendiaminetetraazijnzuuroplossing in 10 water met een pH van 8,5, behandeld, waarna voor het winnen van de vrije Ll eiwitten de oplossing over een ionenuitwisselende kolom, bijvoorbeeld Pharmacia PD-10, wordt gefiltreerd en gelyofiliseerd.

Zouten van het Ll-eiwit worden volgens gebruikelijke methoden bereid, bijvoorbeeld door behandeling met de betreffende ionen, bijvoor-15 beeld een base, een zuur of een zout, dat de gewenste ionen bevat, of door een ionenuitwisselende behandeling. Een sterk onoplosbaar mangaan-zout kan bijvoorbeeld worden bereid door toevoeging van Mri++ ionen, bijvoorbeeld in de vorm van een ongeveer 10 mM tot 100 mM oplossing van mangaanacetaat of een ander in water oplosbaar mangaanzout in water, 20 aan de waterige oplossing van Ll eiwitten.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de monospecifieke antisera tegen het Ll eiwit en het antlichaam bevattende immunoglobulinen, in het bijzonder zoals door konijnen wordt geproduceerd.

Monospecifieke antisera worden volgens gebruikelijke methoden ge-25 produceer!, bijvoorbeeld door wekelijkse injectie van zuivere Ll eiwitten met compleet Freund's adjuvans, bijvoorbeeld subcutaan of intramus-culair, in doses van ongeveer 100 yg per konijn per week gedurende ongeveer 8 tot 16 weken. Het serum wordt dan bij de dieren verzameld, bijvoorbeeld door venasectie, en stolling. In plaats van konijnen kun-30 nen eveneens andere niet-humane warmbloedige dieren, in het bijzonder zoogdieren, bijvoorbeeld schapen, geiten, ratten, muizen, paarden en dergelijke, worden gebruikt.

De monospecifieke antilichaam bevattende globulinefractie kan volgens gebruikelijke methoden uit het serum worden geïsoleerd, bijvoor-35 beeld door ionenuitwisselingschromatografie.

Voor de productie van deze monospecifieke anti-Ll-antilichamen wordt het monospecifieke antilichaam bevattende antiserum of de globulinefractie daarvan door een kolom geleid, waarin de gezuiverde Ll-ei-witten met een geschikt materiaal, zoals agarose of cellulosegel, wor-40 den geconjugeerd. Na het verwijderen van de niet-geadsorbeerde eiwitten 8402182 9 door wassen worden de anti-Ll-antilichaammoleculen geëlueerd met een buffer met een pH van ongeveer 3,5, die natriumchloride of natriumjodide bevat.

De relevante fracties worden op een pH van ongeveer 7 ingesteld, 5 gedialyseerd of geconcentreerd.

De anti-Ll antilichamen worden hetzij in gezuiverde hetzij in ruwe vorm, zoals ia de vorm van de antiserum- of globulinefracties daarvan, gebruikt voor de kwalitatieve of kwantatieve methoden voor de detectie van Ll eiwitten in cellen, weefsels of lichaamsvloeistoffen. Dergelijke 10 methoden omvatten op gebruikelijke wijze uitgevoerde precipitatie in gelen, nefelometrie, radioimmuunproef, enzymimmuunproef, immunofluores-centie en immunoperoxidasecytohistochemische technieken.

De uitvinding heeft verder betrekking op proefuitrustingen, die het zuivere monospecifieke anti-Ll antilichaam of de anti-Ll antili-15 chaam-globulinefractie of het anti-Ll antilichaam bevattend antiserum bevatten. Dergelijke proefuitrustingen zijn van het gebruikelijke type en zullen gericht zijn op enkelvoudige radioimmunodiffusie, latexagglu-tinering, vlekproef, radioimmuunproeven, enzymimmuunproeven, immiriu-fluorescentie of enzymimmunohistochemische proeven* 20 Dergelijke uitrustingen kunnen behalve anti-Ll antilichamen in zuivere of ruwe vorm, gedroogd of gesolubiliseerd in een geschikte buffer, tevoren bereide gelen, latex, polystyreen, met formaline gestabiliseerde dierlijke rode bloedcellen, of soortgelijke deeltjes, enzymen, zoals mierikswortelperoxidase, alkalisch fosfatase, enzymsubstraten, 25 met fluorescentie of enzym geconjugeerde antilichamen en geschikte materialen voor het scheiden van een Ll-moleculen gebonden antilichaam van vrije Ll-moleculen, zoals gedode stammen van Staphylococcus aureus, die behoren tot de stammen, die Staphylococcus eiwit A produceren, houtskool (dat vrij Ll-eiwit zal adsorberen maar niet het antilichaam-30 eiwit-complex), of een tweede antilichaam, zoals geit- of antikonijn- immunoglobuline, of Ll-eiwitten, die met radioactieve isotopen, zoals 125 J , of met enzymen, zoals met mierikswortelperoxidase of alkalisch fosfatase zijn gemerkt. De uitrustingen kunnen eveneens dragers bevatten, waarop monospecifieke anti-Ll antilichamen aan een oppervlak 35 zijn gefixeerd, bijvoorbeeld het binnenoppervlak van reageerbuizen, het oppervlak van glas- of kunststofparels, stukken filtreerpapier, cellu-loseacetaatmembranen of soortgelijke materialen alsmede buffers voor dergelijke methoden.

Bovenstaand alsmede onderstaand worden de volgende afkortingen 40 toegepast: 8402182 10 PMSF : fenylmethylsulfonylfluoride PAGE : .polyacrylamidegelelektroforese SDS : natriumdodecylsulfaat IEF : isoelektrische focussering 5 SRID : immunodiffusie met éên enkele straal NHS : normaal humaan serum ACD : zuur-citraat-dextrose DFP : diisopropylfluorfosfaat EDTA : ethyleendiaminetetraazijnzuur

10 ÊDTA-K2 : dikaliumzout van EDTA

DEAE : diethylaminoethyl RIA : radioimmuunproef PBS : met fosfaat gebufferde zoutoplossing PASA t eiwit A bevattende Staph, aureus

15 Voorbeeld I

Isolering van granulocyten a) Men laat een mengsel bestaande uit 435 ml vers humaan bloed, 65 ml van een waterige oplossing, die 2,2% trinatriumcitraat-dihydraat, 0,8% watervrij citroenzuur en 2,45% dextrose bevat, 250 ml dextran met (R) 20 een hoog molecuulgewicht (Dextraven -150) en 23 ml van een oplossing, die 2,5 mM citroenzuur, 45 tnM trinatriumcitraat, 80 mM glucose en 15 mM natriumchloride bevat, gedurende éên uur bij 4*0 uitzakken. De bovenstaande laag wordt verzameld en gedurende 20 min. met 200 x g gecentrifugeerd bij 4°C. Het bezinksel wordt met 50 ml ijskoud gedestil-25 leerd water behandeld, waardoor de rode bloedcellen tot lyse worden gebracht. Na 30 sec. wordt de isotone toestand hersteld door toevoeging van 16,5 ml van. een ijskoude 0,6 M natriumchlorideoplossing. De resterende leukocyten worden twee malen met een isotone zoutoplossing gewassen. De granulocyten worden van de eenkernige cellen afgescheiden door (R) 30 centrifugeren op Lymphoprep ' [materiaal voor het centrifugeren volgens een dichtheidsgradiënt bestaande uit 9,6% (gew./vol.) van een natriummetrizoaatoplossing, die 5,6% (gew./vol.) van erythrocyten aggregerend polysaccharide (Ficoll) bevat], hetgeen wordt gevolgd door 20 min. centrifugeren met 800 x g bij 20°C. Dit voorschrift levert een op-35 brengst van ongeveer 5 x 10^ cellen, waarvan ongeveer 95% granulocyten zijn.

b) Granulocytextractie

De zoals beschreven onder a) verkregen cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 0,27 M sucrose, dat 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-K2 en 0,25 40 mM thimerosal bevat en waaraan Trisbuffer tot een pH van 8,5 is toege- 8402182 1 **'*· 11 * voegd. Daarna worden de cellen volgens French and Holm (4) gehomogeniseerd door gedurende twee perioden van 2 min. bloot te stellen aan perslucht van 28 kg/cm^, terwijl men deze uit de drukkamer laat ontsnappen met een snelheid van één druppel per sec. Tijdens deze behande-5 ling worden de celvaten in ijs gehouden. Ongeveer 90% van de cellen wordt verbroken en na het centrifugeren gedurende één uur met 100.000 x g werd ongeveer 90% van het totale LI eiwit in de heldere bovenstaande vloeistof gevonden* Deze vloeistof zal worden aangeduid als het ruwe granulocytextract. Het totale eiwitgehalte is ongeveer 3 mg/ml, waarvan 10 30% LI eiwitten zijn.

c) Preparatieve isoelektrische focussering (IEF)

Voor de preparatieve IEF worden gelplaten van 110 x 240 x 5 mm ge-bruikt, die bestaan uit ïïltradex 1 (Dextrane G75, gezuiverd)» dat 2J> (gew./voi.) Ampnoiine ' pH 5-3 (een mengsel van synthetische 15 amfolyten met een bufferende werking bij de isoelektrische punten daarvan) bevat. De monsters [5 mm van de bovenstaande vloeistof volgens b)] (R) worden met een gelijke volumehoeveelheid Ultradex -gel gemengd en op 5 cm van de kathode op de gelplaten aangebracht. De scheiding wordt gedurende 18 uren uitgevoerd met maximaal 25 V cm*"^, 15 mA en 20 10 W. De eiwit banden worden zowel door kleuring met coomassieblauw van een filtreerpapierafdruk van de gelplaat als door pH-metingen van het bovenoppervlak van het gel gelocaliseerd. De Ll eiwitten in het pH 6,3 en 6,5 gebied worden geëlueerd met een gelijke volumehoeveelheid van een waterige oplossing, die 0,1 M natriumacetaat, 2,5 mM EDTA-K2 en 25 0,25 mM thimerosal bevat, pH 8,5, door gedurende 20 min. met 2000 x g (R) te centrifugeren over Milliporev 1 filters van 0,45 pm. De amfolyten worden verwijderd door gedurende een nacht te dialyseren tegen de elueringsbuffer. De resterende eiwit en buffer bevattende oplossingen (R) worden door ultrafiltratie in Minicon -cellen (half doorlatend 30 membraan) geconcentreerd. De opbrengst van deze behandelingen is ongeveer 20% van het Ll eiwit, dat op het preparatieve IEF gel is aange- (R) bracht. 2,5 ml van deze oplossing wordt op een Pharmaciav ' PD-lö

Cr) kolom (Sephadex J G25 M) aangebracht» die met gedestilleerd water in evenwicht is gebracht, waarna de Ll eiwitten met 3,5 ml gedestil-35 leerd water worden geëlueerd en gelyofiliseerd, waarbij 1 mg zuiver Ll eiwit pi 6.3 en 6.5 wordt verkregen.

Het pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwit kan volgens deze methode ook afzonderlijk worden gezuiverd, hetgeen ongeveer 0,67 mg van het pi 6.5 en ongeveer 0,33 mg van het pi 6.3 Ll eiwit levert.

40 Voorbeeld II

8402182 * * 12 a) Bij deze methode wordt voordeel getrokken uit de opvallende verandering van het isoelektrische punt van het Ll eiwit, wanneer men het calciumionen laat opnemen (2). Het eiwit in de ruwe granulocytextracten zal zich aan een anionenuitwisselaar binden, bijvoorbeeld van 5 het diethylammoniumethyltype bij een alkalische pH en met een buffer, die ethyleendiaminetetraazijnzuur in een voldoende hoeveelheid bevat om calciumionen te binden. De Ll eiwitten kunnen vervolgens op specifieke wijze worden geëlueerd door aan de buffer calciumchloride toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van ongeveer 5-10 mM per liter te 10 waarborgen.

Ruwe granulocytextracten worden bereid, zoals beschreven in voorbeeld I. De totale eiwitgehalten zijn ongeveer 2-5 g per 1, waarvan ongeveer 60% Ll eiwit is.

(R) DEAE-Sephacelv ' (verkregen van Pharmacia, Zweden) wordt in 15 evenwicht gebracht met 60 mM barbitalbuffer (7,7 g diethylbarbituurzuur en 10,5 g van het natriumzout daarvan in 1 1 water), die 1 g/1 EDTA-K2 bevat, pH 8,5) en als een vulling aangebracht in een chromatografische kolom met afmetingen van 1,5 x 5 cm, d.w.z. een volume van ongeveer 9 ml.

20 Het monster, ongeveer 10 ml ruw granulocytextract, verdund met 30 ml EDTA-K2 barbitalbuffer met pH 8,5, wordt aangebracht met behulp van een peristaltisch werkende pomp, die een stroomsnelheid van ongeveer 2 ml/min. levert. Nlet-geadsorbeerde eiwitten worden door wassen met 100 ml barbitalbuffer verwijderd. Voor het elueren van de Ll eiwit-25 ten wordt de kolom eveneens met 30 ml barbitalbuffer zonder EDTA-K2 gewassen. De Ll eiwitten worden daarna geëlueerd met 60 mM barbitalbuffer, die 5 mM CaCl2 bevat, pH 8,5.

Fig. 1 toont het elueringsprofiel voor een dergelijke ionenuitwis-selingschromatografie van het totaal aan eiwitten en Ll eiwitten, ter-30 wijl in fig. 2 de patronen van de eitwitbanden zijn weergegeven, indien ruw leukocytextract en gezuiverd Ll eiwit aan analytische agarosegel-elektroforese worden onderworpen. Het blijkt, dat het gezuiverde Ll eiwit twee hoofdbanden levert, die, zoals bovenstaand beschreven, overeenkomen met pi 6.3 en pi 6.5.

35 De hoeveelheid Ll eiwit, die met de calcium bevattende buffer wordt geëlueerd, is vrijwel 50% van de hoeveelheid, die in het monster wordt aangebracht, en wordt gevonden in een totaalvolume van ongeveer 20 ml. Deze oplossing kan op geschikte wijze worden geconcentreerd door (R) ultrafiltratie onder toepassing van Millipore } CX-10 membranen.

40 Dit leidt tot enig verlies aan eiwit afhankelijk van het feit of al dan 8402182 13 niet EDTA wordt toegevoegd om te voorkomen, dat LI eiwit aan de membranen wordt gebonden» Zelfs zonder toevoeging van EDTA kan een totale opbrengst van ongeveer 35% worden bereikt.

Zoals blijkt uit fig. 1, wordt een deel van het LI eiwit geëlueerd 5 met 60 mM barbitalbuffer, die 5 mM CaCl2 en 125 mM NaCl bevat, pH

8,5, maar dit eiwit levert banden in hoofdzaak anodaal en kathodaal ten opzichte van de belangrijkste LI banden en kan ten dele bestaan uit gedenatureerd of in een complex omgezet Ll eiwit naast andere eiwitten.

Op grote schaal uitgeoefende methoden 10 De bovenbeschreven methode kan met succes op grotere schaal worden uitgevoerd voor het verwerken van 50 ml ruwe granulocytextracten. Dit wordt bereikt onder toepassing van een kolom, die ongeveer 50 ml DEAE-Sephacel 1 bevat (ongeveer 2,5 x 10 cm) en evenredige verhogingen van de volumina van dezelfde buffers als bovenstaand vermeld.

15 b) Hierbij wordt voordeel getrokken uit het feit, dat een reversi bele precipitatie van de Ll eiwitten kan worden bereikt door toevoeging van 10 mM Zn*"*. Aan 10 ml ruw leukocytextract wordt 90 ml barbitalbuffer, 75 mM, pi 8,5, en 10 ml van een 100 mM Zn-acetaatoplossing in water toegevoegd. Het neerslag wordt verscheidene malen gewassen, bij-20 voorbeeld vijf maal, met 75 mM barbitalbuffer, pH 8,5, met 10 mM Zn-acetaat. Tenslotte wordt het neerslag gewassen met 75 mM barbitalbuffer, pH 8,5, en opgelost door druppelsgewijs een oplossing van 100 mM EDTA-K2 in water toe te voegen, waarvan de pH op 8,5 is ingesteld met 5 M natriumhydroxide. Deze eiwitoplossing wordt aangebracht op een 25 Pharmacia PD-10 kolom, die met gedestilleerd water in evenwicht is gebracht, waarna de Ll eiwitten worden geëlueerd met 3,5 ml gedestilleerd water en gelyofiliseerd, waarbij ongeveer 10 tot 20 mg zuivere Ll eiwitten worden verkregen.

Voorbeeld III

30 Bereiding van antiserum ten opzichte van gezuiverd Ll

Een oplossing, die ongeveer 1 mg/ml gezuiverd pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwit bevat (verkregen volgens voorbeeld I of II) in 0,1 M natriumace-taat, 2,5 mM EDTA, 0,35 mM thimerosal met pH 8,5 wordt met Freund’s compleet adjuvans gehomogeniseerd. Een volume van dit mengsel, dat on-35 geveer 100 yg Ll eiwit bevat, wordt gedurende 6 weken op verscheidene subcutane plaatsen bij konijnen een maal per week ingespoten. Van de konijnen wordt bloed afgenomen door venapunctie. Men laat het bloed in verloop van de nacht bij kamertemperatuur stollen. Het serum wordt verzameld en op Ll-antiserumactiviteit onderzocht.

40 Een dergelijk antiserum kan normaliter in een verdunning van 1:32 8402182 * - *** 14 voor de immunoprecipitatie volgens een enkele straal en in een verdunning van 1:2000 voor de radioimmuunproef worden gebruikt.

Voorbeeld IV

Proefuitrusting voor radioimmuunproef 5 De proefuitrusting bevat (voor 100 proeven): 1 ampul 2 ml gelyofiliseerd anti-Ll serum,

verkregen volgens voorbeeld III

1 fles 100 ml RIA-buffer: 50 mM natrium- chloride , 0,2% runderserumalbumine, 10 0,2% natriumazide, ingesteld op een pH van 7,4 1 ampul met een rubber- 5 ml van een waterige oplossing van 125 afsluiting met radioactief jood gemerkte

Ll eiwitten ingesteld voor het ver- 15 schaffen van 500 cpm/ml (gemerkt vol gens de Bolton-Hunter methode) 1 fles 100 ml van een waterige suspensie van met formaline behandelde Staphylococcus aureus (PASA * eiwit A bevattend 20 Staph, aureus van de Cowan I stam) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing 1 fles 2 ml van een RIA-bufferoplossing, die 500 ng Ll eiwit bevat (referentie-oplossing)

25 Voorschrift voor de kwantitatieve bepaling van Ll eiwitten door RIA

Een reeks standaardoplossingen werd bereid door tweevoudige verdunning van de geleverde Ll referentieoplossing tot en met 7,8 ng/ml met RIA buffer. In een reeks reageerbuizen wordt 25 pl plasma van een patiënt, verdund op 1:30 met RIA buffer of gestandaardiseerde referen-30 tieoplossing, gepipetteerd. Hierbij wordt 20 pl anti-Ll serum gevoegd, waarna de mengsels gedurende 30 min. bij 37°C worden bebroed. Vervolgens wordt 50 pl van de oplossing met het radioactief gemerkt Ll eiwit toegevoegd, gevolgd door een bebroeding gedurende 1 uur bij 37°C. Bij elke buis wordt dan 1 ml gesuspendeerde Staph, aureus-suspensie ge-35 voegd, waarna gedurende 10 min. met 2000 x g wordt gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof wordt afgezogen en de radioactiviteit in het bezinksel wordt gemeten. Het percentage van de radioactiviteit, betrokken op de aanvankelijk toegevoegde radioactiviteit, wordt voor de gestandaardiseerde Li referentieverdunningen uitgezet, zodat de referentie-40 kromme kan worden getekend. De waarden voor de van de patiënt afkomsti- 8402182 « ^ 15 ge monsters kunnen van deze kromme afgelezen.

Voorbeeld V

Proefultrustlng voor nefelometrische bepaling van LI eiwitten in oplossing 5 De proefultrustlng bevat: 1 ampul 1,5 ml anti-Ll antilichaamoplossing in buffer met pH van 7,5 (natrium-acetaatbuffer, die 5 mM calciumchlo-ride bevat) met een titer van onge-10 veer 1:32, indien onderzocht door dubbel immunodiffusie in agarosegel 1 fles 20 ml verdunningsbuffer, zoals boven staand I ampul 0,5 ml van een oplossing van LI eiwit 15 en concentratie van 400 yg/ml

Anti-Ll serum wordt tot 1:15 verdund met verdunningsbuffer. Zes gestandaardiseerde oplossingen van LI eiwit (1:1 tot 1:64) worden bereid door tweevoudige verdunning van de gestandaardiseerde Ll oplossing. Vervolgens worden 250 yl van de antilicbaamverdunning en 10 μΐ 20 monster of verdunde Ll-standaard in de nefelometercuvettes gemengd en gedurende 10 min. bij kamertemperatuur bebroed. De optische dichtheid wordt van de nefelometer afgelezen.

Voorbeeld VI

Proefuitrusting voor immunodiffusieanalyse volgens één enkele straal 25 voor Ll eiwitten in oplossing De proefultrustlng bevat: 1 of meer tevoren bereide agarosegelen, die 2% van een gelijkmatig verdeelde anti-Ll antilichaamoplossing met een titer van 30 ongeveer 1:32 bevat, indien onderzocht door dubbeldiffusie in gel, en 0,1 M natriumacetaat, 5 mM calciumchloride, 0,25 mM thimerosal met pH 8,5 1 ampul 0,1 ml Ll eiwitoplossing met een con- 35 centratie van 300 yg/ml

Het agarosegel wordt in een afgesloten kamer verschaft om uitdrogen van het gel te voorkomen. Het gel bezit 18 tevoren aangebrachte verdiepingen voor het aanbrengen van 10 yl van de standaardoplossingen en de te onderzoeken monsters.

40 Voorbeeld VII

8402182 16

Proefuitrustingen voor de latexagglutinatieproef voor een semikwan-titatieve bepaling van LI eiwit De proefuitrusting bevat: a) 1 fles 2 ml van een suspensie van latexdeel- 5 tjes met een diameter van 50 ym, waar op gezuiverd LI eiwit is gefixeerd b) 1 fles 2 ml van een bufferoplossing van het

Ll antilichaam, die de bovenvermelde latexdeeltjes zal agglutineren, met 10 een titer van 1:3 tot 1:4 c) 1 fles 0,5 ml van een bufferoplossing van het

Ll eiwit in een concentratie van 50 yg/ml 1 druppel a), b) en het te onderzoeken monster van een patiënt 15 wordt op een zwarte plaat gemengd en gedurende 5 min. op agglutinatie waargenomen. Afwezigheid van agglutinatie duidt op een Al concentratie van meer dan 1000 ng/ml. Bij een positieve controle worden oplossingen

a) , b) en c) gemengd en dient zich geen agglutinatie te ontwikkelen. Voorbeeld VIII

20 Proefuitrustingen voor de vlekproef De proefuitrusting bevat: 10 stukken celluloseacetaat van 5 x 50 mm met twee vlekken met een diameter van 4 mm van gedroogd specifiek anti-Ll antilichaam, die zich bevinden op 10 en 30 mm aan het ene einde.

25 a) 1 fles 2 ml van een bufferoplossing, die spe cifieke anti-Ll antilichamen geconjugeerd met mierikswortelperoxidase bevatten b) 1 fles 10 ml van een waterige trisbuffer/iso- 30 tone zoutoplossing, pH 7,4, die 1 mg/ml diaminobenzidine (DAB) bevat c) 1 fles 1 ml van een waterige bufferoplossing van Ll eiwit in een concentratie van 50 yg/ml 35 Voor het onderzoek wordt een druppel van de monsteroplossing aan gebracht op de eerste vlek en een druppel c) op de tweede vlek. Na 10 min. wordt de proefstrook gedurende 5 min. in trisbuffer/zoutoplossing gewassen. Daarna wordt een druppel van een oplossing a) op elke vlek aangebracht en hierop gedurende 10 min. bij kamertemperatuur gehouden, 40 waarna de strook weer gedurende 5 min. in trisbuffer-zoutoplossing 8402182 17 wordt gewassen. Bij 1 al oplossing b) wordt 5 ul 30%’s waterstofperoxide gevoerd. Eén druppel van dit mengsel wordt op elke vlek aangebracht. Een duidelijke bruine verkleuring, die na 3 min. optreedt, wijst op de aanwezigheid van LI eiwitten in het monster.

5 Door verdunningsreeksen van het monster te maken kan de proef se- mikwantitatief worden gemaakt.

Voorbeeld IX

Proef uitrustingen voor LI eiwitten door enzymimmuunproef De proefuitrustingen bevatten: 10 1 microtiterschaal met 5 x 10 verdiepingen, vervaardigd uit kunststofmateriaal, waarvan het inwendige oppervlak van de bodem en het onderste gedeelte van de verdiepingen bekleed zijn met specifieke 15 anti-Ll antilichamen a) 1 fles 2 ml van een bufferoplossing, die spe cifieke anti-Ll antilichamen geconjugeerd met mierikswortelperoxidase bevat 20 b) 1 fles 10 ml van een waterige trisbuffer/iso- tone zoutoplossing, pH 7,4, die 1 rag/ml diaminobenzidine (DAB) bevat c) 1 fles 1 ml van een waterige bufferoplossing van LI eiwit in een concentratie van 25 50 yg/ml

Volgens het proefvoorschrift worden 50 μΐ van de te onderzoeken monsteroplossing of van de oplossing c) in de verdiepingen gebracht en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bebroed. De verdiepingen worden dan met trisbuffer/zoutoplossing gewassen, die 0,5% runderserumalbumine 30 bevat. In elke verdieping wordt 50 μΐ oplossing a) gebracht, waarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wordt bebroed. De verdiepingen worden zoals bovenstaand gewassen. Aan 1 ml oplossing b) worden 5 μΐ 30%'s waterstofoxide toegevoegd en 50 μΐ van dit mengsel wordt in elke verdieping gebracht* De schaal wordt dan gedurende 30 min. bij kamertempe-35 ratuur bebroed, waarna de kleurintensiteit in elke verdieping fotometrisch wordt bepaald.

Verklaringen van de figuren

Fig. 1 : Chromatografisch profiel van 9 ml ruw leukocytextract op een DEAE-Sephacelv 1 kolom van 1,5 x 5 cm. Het totale eiwit-40 gehalte werd door UV-lichtabsorptie bepaald bij 280 om en de 8402182 ·*·.- sj: * 18

Li concentratie door immunodiffusie volgens êén enkele straal. Fig. 2 : Eiwitbandenpatroon van ruw granulocytextract (A), de 5 mM

CaCl2 fractie (B) en de 125 mM NaCl fractie (C) bij agarose-gelelektroforese in barbitalbuffer, 75 mM, met 2,5 mM 5 EDTA-K2, pH 8,5.

Fractie B bevat de twee zuivere LI eiwitten pi 6.3 en pi 6.5. Literatuurverwijzingen; (1) Magne K. Fagerhol, Inge Dale en Terje Andersson, Scand. J. Haematol. (1980) 24, 393-398.

10 (2) M.K. Fagerhol, I. Dale, T. Andersson, Buil. europ. Physiopath.

resp. 1980, 16 (suppl.) 273-281.

(3) Karen E. Willard, Anne Karine Thorsrud, Eimar Munthe en Egil Jellum, Clin. Chem. deel 28, nr 4, 1067-1073 (1982).

(4) French, P.C. en Holm, R.A., (1947) Thromb. Diath. Haemorrh. 32, 15 432-440.

8402182

Claims (22)

1. Zuivere pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwitten, mengsels daarvan en zouten daarvan.

2. Het zuivere pi 6.3 LI eiwit en zouten daarvan volgens conclusie 1.

3. Het-zuivere pi 6.5 Ll eiwit en zouten daarvan volgens conclusie 1.

4. Toepassing van de Ll eiwitten volgens conclusie 1 als markeΓΙΟ eiwitten of als immunogenen bij dieren.

5. Werkwijze ter bereiding van de zuivere pi 6.3 en pi 6.5 Ll eiwitten, mengsels daarvan en zouten daarvan, met het kenmerk, dat men humane granulocyten in een geschikt buffersysteem verbreekt, het niet-oplosbare celmatenaal verwijdert en de bovenstaande vloeistof onder- 15 werpt aan a) isoelektrlsche focussering en eluëring van de banden, die het pi 6.3 en/of het pi 6.5 Ll eiwit bevatten, met een buffer, of b) anionuitwisselingschromatografie met een EDTA-bevattende buffer bij een pH van ongeveer 8,5 en eluëring van de gewenste Ll eiwitten met 20 een buffer, die calciumionen bevat, of c) affiniteitschromatografie, of d) preparatieve agarosegelelektroforese, of e) kationenuitwisselingschromatografie, of f) gelfiltratie, of 25 g) reversibele precipitatie met Zn4"1", of enige combinatie van trappen a) tot g), de eluaten van mogelijk aanwezige amfolyten en/of zouten bevrijdt, de verkregen oplossing van de zuivere Ll eiwitten concentreert, desgewenst de verkregen oplossing lyofiliseert en desgewenst de verkregen Ll eiwitten omzet in een zout 30 of het verkregen zout omzet in de vrije eiwitten.

6. Monospecifieke anti-Ll antisera en monospecifieke anti-LI anti-lichamen geproduceerd met de zuivere Ll eiwitten volgens een der conclusies 1 tot 4.

7. De monospecifieke anti-Ll antisera en antilichamen volgens con-35 dusie 6 verkregen bij konijnen.

8. Werkwijze ter bereiding van anti-Ll antisera en anti-Ll antilichamen, met het kenmerk, dat men dieren behandelt met zuivere Li eiwitten volgens conclusie 1 en de antisera of antilichamen volgens gebruikelijke methoden wint.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de monospe- 8402182 w V A . ' 20 cifieke antisera geproduceerd worden door wekelijkse injectie van de zuivere LI eiwitten met compleet Freund’s adjuvans, bijvoorbeeld subcu-taan of intramusculair, in doses van ongeveer 100 yg per konijn per week gedurende ongeveer 8 tot 16 weken en verzameling van het serum van 5 de dieren door venasectie en stolling.

10. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat niet-huma-ne warmbloedige dieren worden gebruikt.

11. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat schapen, geiten, ratten, muizen, paarden en dergelijke worden gebruikt.

12. Werkwijze volgens concluisie 8, met het kenmerk, dat konijnen als de dieren worden gebruikt.

13. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de mono-specifieke antilichamen bevattende globulinefracties uit de LI antisera worden geïsoleerd en als uitgangsmateriaal worden gebruikt voor het 15 isoleren van de anti-Ll antilichamen.

14. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het mono-specifieke antilichaam bevattende antiserum of de globulinefractie daarvan door een kolom wordt geleid, waarin de gezuiverde Ll-eiwitten met een geschikt materiaal zijn geconjugeerd, en men na het verwijderen 20 van de niet geadsorbeerde eiwitten door wassen de anti-Ll antilichamen elueert met een buffer met een pH van ongeveer 3,5, die natriumchloride of natriumjodide bevat.

15. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de anti-Ll antisera of anti-Ll antilichaamoplossingen worden gedialyseerd en ge- 25 concentreerd.

16. Toepassing van de anti-Ll antisera en anti-Ll antilichamen voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van LI eiwitten in cellen, weefsels of lichaamsvloeistoffen.

17. Proefuitrusting gekenmerkt door de monospecifieke anti-Ll an- 30 tilichamen, anti-Ll antilichaam-globulinefracties of anti-Ll antisera volgens conclusie 1.

18. Proefuitrusting volgens conclusie 17 zoals in hoofdzaak beschreven in een' der voorbeelden V tot IX.

19. Zuiver pi 6.3 en pi 6.5 LI eiwit, mengsels daarvan en zouten 35 daarvan verkregen volgens de werkwijze volgens conclusie 5 of een voor de hand liggend equivalent daarvan.

20. Zuiver pi 6.3 en pi 6.5 LI eiwit, mengsels daarvan en zouten daarvan verkregens volgens een der voorbeelden I of II of voor de hand liggend equivalent daarvan.

21. Monospecifiek anti-Ll antiserum of anti-Ll antilichaam verkre- 8402182 / V» gen volgens de werkwijze van conclusie 8 of een voor de hand liggend equivalent daarvan»

22. Homospecifiek anti—LI antiserum of anti—LI antilichaam verkregen volgens voorbeeld III of een voor de hand liggend equivalent daar-5 van. 6402182