NL192456C

NL192456C - Humane eiwitten.

Info

Publication number: NL192456C
Application number: NL8402182A
Authority: NL
Original assignee: Dale Inge; Magne Kristoffer
Priority date: 1983-07-11
Filing date: 1984-07-10
Publication date: 1997-08-04
Also published as: NL192456B; JPH07278194A; JPH0784479B2; JP2558442B2; DK338484D0; FR2550205B1; DK338484A; GB2143239A; DK169439B1; SE8403630L; IT8448540A0; JPS6051113A; BE900119A; FR2550205A1; US4833074A; SE500219C2; DE3425186A1; SE8403630D0; CH661048A5; GB8318754D0

Description

1 192456

Humane eiwitten, antisera en antllichamen en gebruik daarvan en testkits

De uitvinding heeft betrekking op zuivere humane granulocyteiwitten van het type L1 met pl 6,3 of 6,5 werkwijzen voor het bereiden daarvan, tegen deze eiwitten geproduceerde monospecifieke antisera en 5 antilichamen en gebruik daarvan en testkits, die deze antisera of antilichamen bevatten.

Van de bloedcellen bezitten alleen de witte bloedcellen, de leukocyten, kernen en alleen deze zijn in staat de vele eiwitten te produceren, die in bloedplasma worden gevonden. Eén mm3 bevat ongeveer 6000 tot 10.000 leukocyten. Een ondergroep van de leukocyten zijn de granulocyten, die weer onderverdeeld worden in neutrofiele, polymortkemige granulocyten, die ongeveer 95% van alle granulocyten uitmaken, 10 eosinofiele granulocyten en basofiele granulocyten. Bij gezonde volwassenen worden per dag ongeveer 1011 granulocyten door het beenmerg afgegeven, maar dit kan tijdens ernstige infecties en inflammatoire toestanden tot het tienvoudige stijgen. Normaliter bezitten de leukocyten een verblijftijd van ongeveer 6 uren in de circulatie, voordat zij in de weefsels binnendringen, waar zij hun biologische functies vervullen én ten slotte worden gesequestreerd. De turnover van leukocyten kan bij gezonde en zieke toestand aanzienlijk 15 verschillen, zoals blijkt uit onderzoekingen onder toepassing van met isotopen gemerkte granulocyten alsmede histologische methoden, die een wisselende mate van leukocytinfiltratie in weefsels te zien geven. Geen van deze methoden staat echter direct ter beschikking voor klinische onderzoeken met betrekking tot de turnover van leukocyten. Een alternatieve en beter beschikbare methode kan het volgen van de afgifte van één of meer karakteristieke leukocyteiwitten zijn tijdens de werking en/of de sequestrating van de 20 leukocyten.

In de drie vroegere publicaties zijn ondervindingen vermeld, die erop wijzen, dat leukocyten een aantal eiwitten bevatten, waarvan de concentratie tijdens verschillende ziekten kan wisselen. Enkele van deze eiwitten zijn aangeduid als L1, in het bijzonder pl 6,3 en pl 6,5 L1 (literatuurplaats 1 en 2) of R:6 en R:7 (literatuurplaats 3). Volgens de twee-dimensionale elektroforetische analyse (ISO-DALT) is het pl 6,5 L1 25 eiwit identiek met het R:6 eiwit en is het pl 6,3 L1 eiwit identiek aan het R:7 eiwit. In de publicaties (1) tot (3) werden de eiwitten bij analysemethoden vastgesteld onder honderden tot duizenden andere eiwitten. In de publicatie (1) werden pogingen ondernomen de L1-eiwitten te zuiveren teneinde kwantitatieve methoden en voorbereidende karakteriseringen vast te stellen. Preparatieve gelfiltratie, isoelektrische focussering- en affiniteitschromatografie leverden een eiwit met een moleculegewicht van ongeveer 51000 Dalton (volgens 30 SDS polyacrylamidegel-elektroforese en gelfiltratie), dat zeer instabiel was, maar dat voor het immuniseren van konijnen kon worden gebruikt (1). De in literatuurplaats (1) toegepaste methoden voor het isoleren en zuiveren leverden slechts zeer geringe opbrengsten van het eiwit van 51000 Dalton en dikwijls ging het eiwit tijdens de behandelingen verloren. Immunisering van konijnen door het eiwit van 51000 Dalton in te spuiten leverde een antiserum tegen de L1 eiwitten, maar dikwijls eveneens antilichamen tegen andere eiwitten.

35 Deze antisera moesten van de ongewenste antilichamen worden bevrijd door adsorptie met normaal humaan serum of met humane weefselextracten. In publicatie (1) werden niet-gefractioneerde leukocyten door bevriezing/ontdooiing en mechanische homogenisering van de leukocyten zonder toevoeging van enzyminhibitors geëxtraheerd.

In publicatie (3) zijn alleen analysemethoden beschreven voor de bepaling van de R:6 en R:7 eiwitten, 40 maar geen methoden voor de isolering of zuivering.

De uitvinding is gericht op hierna nader gedefinieerde humane granulocyteiwitten van het L1-type met isoelektrisch punt bij pl 6,3 of 6,5 uit leukocyten, die de karakterisering daarvan mogelijk maken, en -monospecifieke antisera of antilichamen tegen deze eiwitten. Deze eiwitten zijn vrij van niet-L1-type eiwitten, zodat ze kunnen worden gebruikt voor het opwekken van specifieke L1 -antilichamen, niet gericht tegen 45 andere eiwitten. Verder heeft de uitvinding een doel proefuitrustingen te verschaffen, die dergelijke antisera en/of antilichamen bevatten, die eventueel gemerkt zijn met een radioactief isotoop of met een enzym, waardoor zij geschikt zijn voor kwantitatieve bepalingen van L1-eiwitten in lichaamsvloeistoffen of cel- of weefselextracten.

De L1 -eiwitten kunnen worden verkregen op de hierna beschreven wijze.

50 De uitvinding heeft betrekking op humaan granulocyteiwit van het type L1 met isoelektrisch punt bij pl 6,3 of pl 6,5, met het kenmerk, dat het vrij is van niet-Ll-type eiwitten en bij bepaling door gelfiltratie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie een moleculegewicht van 36.500 Da heeft en bij bepaling door middel van SDS-eiektroforese polyacrylamidegel drie poiypeptideketens erin aanwezig blijken te zijn en waarbij uitgaande van de N-terminus elk van de poiypeptideketens als eindstandige aminozuursequentie Met-Leu-55 Thr-Glu bezitten bij bepaling volgens het standaard Edmanvoorschrift en mengsels daarvan, werkwijzen ter bereiding daarvan op de hierna gegeven wijze.

Monospecifieke antisera en antilichamen tegen deze eiwitten, de toepassing van de antisera of 192456 2 antilichamen voor kwalitatieve en/of kwantitatieve bepaling van de L1 -eiwitten in cellen, weefsels en lichaamsvloeistoffen en testkits die de monospecifieke antisera en/of antilichamen bevatten, die eventueel gemerkt zijn met radioactieve isotopen of met enzymen.

De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op de zuivere pl 6,3 en pl 6,5 L1-eiwitten, mengsels 5 daarvan en zouten daarvan.

Zouten van de L1 -eiwitten zijn in het bijzonder niet-toxische, farmaceutisch toelaatbare zouten of anders zouten, die gebruikt kunnen worden voor precipitatie- en/of zuiveringsprocessen van de L1-eiwitten.

De eiwitten worden beide gekarakteriseerd door de isoelektrische punten ervan bij een pH van 6,3 resp. een pH van 6,5. Het moleculegewicht van beide eiwitten, zoals bepaald door gelfiltratie en scheiding 10 volgens de dichtheidsgradiënt met de ultracentrifuge, is gelijk en bedraagt ongeveer 36500 Dalton. Bij de SDS-elektroforese aan polyaciylamidegel blijken de eiwitten te bestaan uit drie polypeptiden met ongeveer een gelijk moleculegewicht van 12500 Dalton. Elk van deze polypeptideketens bezit de volgende aminozuur-volgorde uitgaande van het N-einde: Meth-Leu-Thr-Glu, zoals blijkt volgens de gestandaardiseerde Edman methode. De netto elektrische lading en de beschikbaarheid van antigens plaatsen aan de L1 -eiwitten 15 worden sterk beïnvloed door de afwezigheid of aanwezigheid van calciumionen. De eiwitten zullen veel sterker als antigenen in vitro reageren bij aanwezigheid van calciumionen.

De thermische stabiliteit van de L1-eiwitten is hoog bij neutrale en alkalische pH. Bij 15 min. koken in waterig 5 mM EDTA, pH 8,5 zal 90% van het eiwit behouden blijven. De L1 -eiwitten worden door ethanol ten dele geprecipiteerd bij een zure pH, bijvoorbeeld tussen ongeveer 4 en 5.

20 De voomoemde L1 -eiwitten bezitten een karakteristieke verdeling in het menselijke lichaam en worden in grote hoeveelheden gevonden in neutrofiele granulocyten, monocyten en squameuze epitheelcellen, afgezien van de normale huid. Zij worden eveneens in vele kankercellen van het squameuze epitheliële type en enkele leukemie- en lymfomacellen, in het bijzonder die van het myelogene leukemische type en monocytische lymfomatype, gevonden. L1 -eiwitten worden in het overwegende deel van de squameuze 25 kankers van de urineweg en longen gevonden. De L1-eiwitten zijn eveneens in andere lichaamsvloeistoffen aanwezig in vrij lage concentraties bij gezonde individuen, maar in toenemende concentraties onder omstandigheden met een toenemende mate van ontsteking. In de witte bloedcellen zijn de l.1-eiwitten voor 90% aanwezig in de cytosoifractie.

De L1 -eiwitten kunnen als marker-eiwitten worden gebruikt, in het bijzonder in een radioactieve gemerkte 30 vorm, bijvoorbeeld met J125 op P32, voor de kwalitatieve en/of kwantitatieve bepaling van het L1-eiwitgehalte in lichaamsvloeistoffen, cellen en weefsels.

De L1 -eiwitten zijn goede immunogenen in dieren, bijvoorbeeld konijnen.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor de bereiding van de hiervoor beschreven zuivere pl 6,3 en pl 6,5 L1 -eiwitten, mengsels daarvan en zouten daarvan, die het kenmerk bezit, dat 35 humane granulocyten in een geschikt buffersysteem worden verbroken, het niet-oplosbare celmateriaal wordt verwijderd en de bovenstaande vloeistof onderworpen wordt aan a) isoelektrische focussering en eluëring van de banden, die het pl 6,3 en/of pl 6,5 L1-eiwit bevatten, met een buffer, of b) anionuitwisselingschromatografie met een EDTA-bevattende buffer bij een pH van ongeveer 8,5 en 40 eluëring van de gewenste L1 -eiwitten met een buffer, die calciumionen bevat, of c) affiniteitschromatografie, of d) preparatieve agarosegelelektroforese, of e) kationenuitwisselingschromatografie, of f) gelfiltratie, of 45 g) reversibele precipitatie met Zn++ of enige combinatie van trappen a) tot g), de eluaten van mogelijke amfolyten en/of zouten worden bevrijd, de verkregen oplossing van de zuivere L1 -eiwitten wordt geconcentreerd en de verkregen oplossing desgewenst wordt gelyofiliseerd en de verkregen L1-eiwitten desgewenst in een zout worden omgezet of het veikregen zout in de vrije eiwitten wordt omgezet.

50 De granulocyten, die als uitgangsmateriaal voor de extractie van de L1-eiwitten worden gebruikt, worden volgens een willekeurige gebruikelijke methode uit vers humaan bloed verkregen, bijvoorbeeld door dextransedimentatie en scheiding volgens de dichtheidsgradiënt door centrifugering.

Het buffersysteem, waarin de granulocyten worden verbroken, bevat een middel, dat gelijktijdige verbreking van de lysosomen voorkomt, zoals glycerol, dextranen en bij voorkeur sucrose, in een voldoende 55 concentratie om de osmotische druk vóór en na het verbreken van de celwanden te stabiliseren. Zo wordt sucrose bijvoorbeeld gebruikt voor een concentratie tussen 0,27 0,34 M. Het buffersysteem bevat verder enzyminhibitors, die vertering van de L1-eiwitten voorkomen, zoals diisopropylfluorfosfaat (DFP), sojabonen- 3 192456 trypsineinhibitor, Trasilol(R), kwikbenzoaat, pepstatine A en bij voorkeur fenylmethyisulfonylfluoride (PMFS) en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of mengsels daarvan.

Het verbreken van de celwanden kan op een gebruikelijke wijze worden uitgevoerd, bijvoorbeeld mechanisch, bijvooibeeld met behulp van een roterende menger, een vijzel (Potter-Elvelyem methode) door 5 ultrasone trilling, bevriezen en ontdooien, of combinaties van deze methoden. Volgens een bij voorkeur toegepaste methode worden de granulocyten verbroken door drukhomogenisering.

Na het verbreken van de granulocyten worden onoplosbare materialen, zoals niet veibroken cellen, celresten en lysosomen verwijderd, bijvoorbeeld met behulp van de ultracentrifuge.

De L1 -eiwitten worden uit het ruwe granulocytextract in zuivere vorm verkregen volgens een van de 10 volgende zuiveringsmethoden: a) Isoelektrische focussering:

Het isoelektrisch focusseren wordt bij voorkeur uitgevoerd in een gegranuleerde gel, zoals agarose of gepolymeriseeide dextranparels, die een geschikt mengsel van in de handel verkrijgbaar amfolyten bevatten 15 voor het verschaffen van een stabiele pH-gradiënt van ongeveer pH 5 tot 8 tijdens de uitvoering. Dit isoelektrisch focusseren wordt uitgevoerd met een maximale spanning van ongeveer 25 V/cm gedurende ongeveer 10 tot 20 uren bij een temperatuur van ongeveer 5° tot 15°. Een gel, dat de voorkeur verdient, is Ultrodex<R) en het amfolyt, dat de voorkeur verdient, is Ampholine<R).

Het monster wordt bij voorkeur aan de kathodische zijde van het gel aangebracht.

20 Het localiseren van de banden van L1 -eiwit kan worden uitgevoerd door pH-metingen langs het geloppervlak of door filtreerpapierafdrukken van het bovenoppervlak te kleuren, bijvoorbeeld met coomasae-blauw.

De banden, die de L1 -eiwitten bevatten, worden afgeschraapt en met een geschikt EDTA bevattende buffer geëlueerd bij een pH tussen ongeveer 7,5 en ongeveer 9, bij voorkeur bij een PH van ongeveer 8,5. 25 Het eluaat wordt van de amfolyten en de zouten bevrijd door dialyse en/of gelfiitratie en door ultrafiltratie en/of lyofilisering geconcentreerd.

b) Anionenuitwisselingschromatografie:

De bij deze methode gebruikte anionuitwissetende materialen bevatten bijvoorbeeld tertiaire of quatemaire 30 ammoniumgroepen en zijn bijvoorbeeld diethyiaminoethylcellulose, bijvoorbeeld diethylaminoethyl-Sepharose(R> of QAE-cellulose (quatemair ammoniumethylcellulose). Het granulocytextract, dat de L1 -eiwitten bevat, wordt op de kolom aangebracht in een buffer met een lage ionenconcentratie, die EDTA bevat en een pH van 8,5 bezit. De L1-eiwitten worden op specifieke wijze geëlueerd met een calciumionen bevattende buffer, bijvoorbeeld een buffer, die 30 mM barbital en 5 mM calciumchloride bevat.

35 c) Affïniteitschromatografie:

Een derde methode voor het zuiveren van het L1 -eiwit is gebaseerd op affiniteitschromatografie. Deze kan worden uitgevoerd aan glasparels met een geregelde poriëngrootte en een groot oppervlak, bijvoorbeeld ongeveer 50 m2/g. De glasparels worden in een kolom gebracht en het ruwe granulocytextract wordt in een 40 geschikte buffer met een kleine molariteit, die calciumionen bevat, bij een neutrale of enigszins zure pH, bijvoorbeeld een pH van ongeveer 6 of 7, aangebracht. De L1 -eiwitten worden geëlueerd met een alkalische buffer met een pH van ongeveer 7,5 tot 8,5, die ongeveer 50 mM EDTA en polyethyleenglycol of lithium-bromide bevat.

Bij andere affiniteitschromatografiemethoden wordt gebruik gemaakt van een anti-L1 -antilichaamkolom. 45 De L1 -eiwitten worden aan de antilichamen geadsorbeerd, terwijl de andere eiwitten met een buffer worden uitgewassen. Daarna worden de L1 -eiwitten geëlueerd met een zoutoplossing, zoals met een waterige buffer met een pH van ongeveer 3,5, die een zout, zoals natriumchioride of natriumjodide, bevat.

d) Praparatieve agarose-gelelektroforese: 50 Agarosegelen in de vorm van een vlak bed van de juiste afmetingen worden gebruikt, die 75 mM barbital/ 2,5 mM EDTA-buffer, pH 8,5, bevatten. De elektroforese wordt gedurende 10-18 uren uitgevoerd bij 4 V/cm. De L1-eiwitbanden worden door kleuren van filtreerpapierafdrukken van het bovenoppervlak van het gel gelocaliseerd. De L1 -eiwitbanden zullen in het acta-globulinegebied worden gevonden en worden geëlueerd door bevriezen/ontdooien en centrifugeren van de betreffende stroken van het agarosegel.

192456 4 θ) Kationenuitwisselingschromatografie:

Kationenuitwisselingschromatografie wordt uitgevoerd aan kationenuitwisselende harsen, zoals door sulfopropyl gesubstitueerde cellulose of gepolymeriseerd dextran. Het ruwe granulocytextract wordt op de kolom aangebracht, nadat het gemengd is met een buffer met een kleine ionensterkte, die calciumionen 5 bevat, met een pH van ongeveer 6. Niet geadsorbeerde eiwitten worden met de uitgangsbuffer weggewassen en de L1 -eiwitten worden geêlueerd met een buffer, die EDTA en natriumionen in toenemende concentratie bevat.

f) Gelfiltratie: 10 Voor de gelfiltratie worden Sephadex^ G75 tot G200 agarosegelen (Sepharosegelen), zoals Ultragel(R> - of polyacryiamidegelparels, zoals Bio-Gel^ P-60, gebruikt. Het verdient de voorkeur, dat de kolom een lange kolom is. De lengte van de kolom dient ongeveer 50 maal de diameter te zijn. Het ruwe granulocytextract wordt als zodanig aangebracht en de L1-eiwitten worden gechromatografeerd. Voor het vullen van de kolom en welken ermee wordt een buffer gebruikt, die bij voorkeur 0,1 M natriumcitraat, 2,5 mM EDTA-K2 en 0,25 15 mM thimerosal bevat en een pH van 8,5 bezit. De L1 -eiwitten zullen worden gevonden in een fractie, die overeenkomt met een moleculegewicht van 35000 tot 40000 Dalton.

g) Reversibele precipitaüe met Zn**:

De L1 -eiwitten worden kwantitatief uit waterige oplossingen met een neutrale of alkalische pH geprecipiteerd 20 door behandeling met Zn+Nonen, in het bijzonder in de vorm van in water oplosbare zinkzouten, zoals zinkacetaat of zinkchloride. Zo kan bijvoorbeeld een waterige oplossing, die de L1-eiwitten bevat, bij een pH van ongeveer 8,5 worden behandeld met een ongeveer 10 mM tot 100 mM zinkacetaatoplossing in water. Het geprecipiteerde L1 zinkzout wordt verzameld, indien noodzakelijk met een waterige bufferoplossing gewassen, met een complexen vormend zuur, bijvoorbeeld in ongeveer 100 mM dikalium-25 ethyleendiaminetetraazijnzuuroplossing in water met een pH van 8,5, behandeld, waarna voor het winnen van de vrije L1-eiwitten de oplossing over een ionenuiwisselende kolom, bijvoorbeeld Pharmacia PD-10, wordt gefiltreerd en gelyofiliseerd.

Zouten van het L1-eiwit worden volgens gebruikelijke methoden bereid, bijvoorbeeld door behandeling met de betreffende ionen, bijvoorbeeld een base, een zuur of een zout, dat de gewenste ionen bevat, of 30 door een ionenuitwisselende behandeling. Een sterk onoplosbaar mangaanzout kan bijvoorbeeld worden bereid door toevoeging van Mn++-ionen, bijvoorbeeld in de vorm van een ongeveer 10 mM tot 100 mM oplossing van mangaanacetaat of een ander in water oplosbaar mangaanzout in water, aan de waterige oplossing van L1 -eiwitten.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de monospecifieke antisera tegen het L1 -eiwit en het 35 monospecifieke antilichaam bevattende immunoglobulinen, in het bijzonder zoals door konijnen wordt geproduceerd.

Monospecifieke antisera worden volgens gebruikelijke methoden geproduceerd, bijvoorbeeld door wekelijkse injectie van zuivere L1 -eiwitten met compleet Freund’s adjuvans, bijvoorbeeld subcutaan of intramusculair, in doses van ongeveer 100 pg per konijn per week gedurende ongeveer 8 tot 16 weken. Het 40 serum wordt dan bij de dieren verzameld, bijvoorbeeld door venasectie, en stolling. In plaats van konijnen kunnen eveneens andere niet-humane warmbloedige dieren, in het bijzonder zoogdieren, bijvoorbeeld schapen, geiten, ratten, muizen, paaiden en deigelijke, worden gebruikt.

De monospecifieke antilichaam bevattende globulinefractie kan volgens gebruikelijke methoden uit het serum worden geïsoleerd, bijvoorbeeld door ionenuitwisselingschromatografie.

45 Voor de productie van deze monospecifieke anti-L1 -antilichamen wordt het monospecifieke antilichaam bevattende antiserum of de globulinefractie daarvan door een kolom geleid, waarin de gezuiverde L1-eiwitten met een geschikt materiaal, zoals agarose of cellulosegel, worden geconjugeerd. Na het verwijderen van de niet-geadsorbeerde eiwitten door wassen worden de anti-L1-antilichaammoleculen geêlueerd met een buffer met een pH van ongeveer 3,5, die natriumchloride of natriumjodide bevat. De 50 relevante fracties worden op een pH van ongeveer 7 ingesteld, gediafyseerd of geconcentreerd

De anti-L1 antilichamen worden hetzij in gezuiverde hetzij in ruwe vorm, zoals in de voim van de antiserum- of globulinefracties daarvan, gebruikt voor de kwalitatieve of kwantatieve methoden voor de detectie van L1-eiwitten in cellen, weefsels of lichaamsvloeistoffen. Dergelijke methoden omvatten op gebruikelijke wijze uitgevoerde precipitatie in gelen, nefelometrie, radioimmuunproef, enzymimmuunproef, 55 immunofluorescentie en immunoperoxidasecytohistochemische technieken.

De uitvinding heeft verder betrekking op testkits, die het zuivere monospecifieke anti-L1 antilichaam of de anti-L1 antilichaam-globulinefractie of het anti-L1 antilichaam bevattend antiserum bevatten. Dergelijke 5 192456 proefuitrustingen zijn van het gebruikelijke type en zullen gericht zijn op enkelvoudige radioimmunodiffusie, latexagglutinering, vlekproef, radioimmuunproeven, enzymimmuunproeven, immunofluorescentie of enzymimmunohistochemische proeven.

Dergelijke uitrustingen kunnen behalve anti-L1 antilichamen in zuivere of ruwe vorm, gedroogd of 5 gesolubiliseerd in een geschikte buffer, tevoren bereide gelen, latex, polystyreen, met formaline gestabiliseerde dierlijke rode bloedcellen, of soortgelijke deeltjes, enzymen, zoals mierikswortelperoxidase, alkalisch fosfatase, enzymsubstraten, met fluorescentie of enzym geconjugeerde antilichamen en geschikte materialen voor het scheiden van een L1-moleculen gebonden antilichaam van vrije L1-moleculen, zoals gedode stammen van Staphylococcus aureus, die behoren tot de stammen, die Staphylococcus eiwit A 10 produceren, houtskool (dat vrij L1-eiwit zal adsorberen maar niet het antilichaameiwit-complex), of een tweede antilichaam, zoals geit- of antikonijn-immunoglobuline, of L1-eiwitten, die met radioactieve isotopen, zoals J12S, of met enzymen, zoals met mierikswortelperoxidase of alkalisch fosfatase zijn gemerkt. De uitrustingen kunnen eveneens dragers bevatten, waarop monospecifieke anti-L1 antilichamen aan een oppervlak zijn gefixeerd, bijvoorbeeld het binnenoppervlak van reageerbuizen, het oppervlak van glas- of 15 kunststofparels, stukken filtreerpapier, celluloseacetaatmembranen of soortgelijke materialen alsmede buffers voor dergelijke methoden.

Bovenstaand alsmede onderstaand worden de volgende afkortingen toegepast: PMSF : fenylmethylsulfonylfluoride PAGE : polyacrylamidegelelektroforese 20 SDS : natriumdodecylsulfaat IE F : isoelektrische focussering SRID : immunodiffusie met één enkele straal NHS : normaal humaan serum ACD : zuur-citraat-dextrose 25 DFP : diisopropylfluorfosfaat EDTA : ethyleendiaminetetraazijnzuur

EDTA-K2 : dikaliumzout van EDTA

DEAE : diethylaminoethyl RIA : radioimmuunproef 30 PBS : met fosfaat gebufferde zoutoplossing PASA : eiwit A bevattende Staph, aureus

Voorbeeld I

35 Isolering van granulocyten a) Men laat een mengsel bestaande uit 435 ml vers humaan bloed, 65 ml van een waterige oplossing, die 2,2% trinatriumcitraat-dihydraat, 0,8% watervrij citroenzuur en 2,45% dextrose bevat, 250 ml dextran met een hoog moleculegewicht (Dextraven<R)-150) en 23 ml van een oplossing, die 2,5 mM citroenzuur, 45 mM trinatriumcitaat, 80 mM glucose en 15 mM natriumchloride bevat, gedurende één uur bij 4°C uitzakken. De 40 bovenstaande laag wordt verzameld en gedurende 20 min. met 200 x g gecentrifugeerd bij 4eC. Het bezinksel wordt met 50 ml ijskoud gedestilleerd water behandeld, waardoor de rode bloedcellen tot lyse worden gebracht. Na 30 sec. wordt de isotone toestand hersteld door toevoeging van 16,5 ml van een ijskoude 0,6 M natriumchlorideoplossing. De resterende leukocyten worden twee malen met een isotone zoutoplossing gewassen. De granulocyten worden van de eenkemige cellen afgescheiden door centrifuge-45 ren op Lymphoprep<R> [materiaal voor het centrifugeren volgens een dichtheidsgradiënt bestaande uit 9,6% (gew./vol.) van een natriummetrizoaatoplossing, die 5,6% (gew./vol.) van erythrocyten aggregerend polysaccharide (Ficoll) bevat], hetgeen wordt gevolgd door 20 min. centrifugeren met 800 x g bij 20°C. Dit voorschrift levert een opbrengst van ongeveer 5 x 108 cellen, waarvan ongeveer 95% granulocyten zijn.

b) Granulocytextractie 50 De zoals beschreven onder a) verkregen cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 0,27 M sucrose, dat 10 mM PMSF, 2,5 mM EDTA-I^ en 0,25 mM thimerosal bevat en waaraan Trisbuffer tot een pH van 8,5 is toegevoegd. Daarna worden de cellen volgens French and Holm (4) gehomogeniseerd door gedurende twee perioden van 2 min. bloot te stellen aan perslucht van 28 kg/cm2, terwijl men deze uit de drukkamer laat ontsnappen met een snelheid van één druppel per sec. Tijdens deze behandeling worden de celvaten 55 in ijs gehouden. Ongeveer 90% van de cellen wordt verbroken en na het centrifugeren gedurende één uur met 100.000 x g werd ongeveer 90% van het totale L1 -eiwit in de heldere bovenstaande vloeistof gevonden. Deze vloeistof zal worden aangeduid als het ruwe granulocytextract. Het totale eiwitgehalte is ongeveer 3 192456 6 mg/ml, waarvan 30% L1-eiwitten zijn.

c) Preparatieve isoelektrische focussering (IEF)

Voor de preparatieve IEF worden gelplaten van 110 x 240 x 5 mm gebruikt, die bestaan uit Ultradex(R) (Dextrane G75, gezuiverd), dat 2% (gew./vol.) Ampholine(R> pH 5-8 (een mengsel van synthetische 5 amfolyten met een bufferende werking bij de isoelektrische punten daarvan) bevat. De monsters [5 mm van de bovenstaande vloeistof volgens b)j worden met een gelijke volumehoeveelheid Ultradex(R)-gel gemengd en op 5 cm van de kathode op de gelplaten aangebracht. De scheiding wordt gedurende 18 uren uitgevoerd met maximaal 25 V cm'1,15 mA en 10 W. De eiwitbanden worden zowel door kleuring met coomassieblauw van een filtreerpapierafdruk van de gelpiaat als door pH-metingen van het bovenoppervlak van het gel 10 gelocaliseerd. De L1-eiwitten in het pH 6,3 en 6,5 gebied worden geëlueerd met een gelijke volumehoeveelheid van een waterige oplossing, die 0,1 M natriumacetaat, 2,5 mM EDTA-K2 en 0,25 mM thimerosal bevat, pH 8,5, door gedurende 20 min. met 2000 x g te centrifugeren over Millipore^ filters van 0,45 pm. De amfolyten worden verwijderd door gedurende een nacht te dialyseren tegen de elueringsbuffer. De resterende eiwit en buffer bevattende oplossingen worden door ultrafiltratie in Minicon<R>-cellen (half 15 doorlatend membraan) geconcentreerd. De opbrengst van deze behandelingen is ongeveer 20% van het L1-eiwit, dat op het preparatieve IEF gel is aangebracht. 2,5 ml van deze oplossing wordt op een Pharmacia^ PD-10 kolom {Sephadax(R) G25 M) aangebracht, die met gedestilleerd water in evenwicht is gebracht, waarna de L1 -eiwitten met 3,5 ml gedestilleerd water worden geëlueerd en gelyofiliseerd, waarbij 1 mg zuiver L1-eiwit pl 6,3 en 6,5 wordt verkregen.

20 Het pl 6,3 en Pl 6,5 L1-eiwit kunnen volgens deze methode ook afzonderlijk worden gezuiverd, hetgeen ongeveer 0,67 mg van het pl 6,5 en ongeveer 0,33 mg van het pl 6,3 L1-eiwit levert.

Voorbeeld II

a) Bij deze methode wordt voordeel getrokken uit de opvallende verandering van het isoelektrische punt van 25 het L1-eiwit, wanneer men het calciumionen laat opnemen (2). Het eiwit in de ruwe granulocytextracten zal zich aan een anionenuitwisselaar binden, bijvoorbeeld van het diethylammoniumethyltype bij een alkalische pH en met een buffer, die ethyleendiaminetetraazijnzuur in een voldoende hoeveelheid bevat om calciumionen te binden. De L1 -eiwitten kunnen vervolgens op specifieke wijze worden geëlueerd door aan de buffer calciumchloride toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van ongeveer 5-10 mM per liter te 30 waarborgen.

Ruwe granulocytextracten worden bereid, zoals beschreven in voorbeeld I. De totale eiwitgehalten zijn ongeveer 2-5 g per 1, waarvan ongeveer 60% L1-eiwit is.

DEAE-Sephacel(R) (verkregen van Pharmacia, Zweden) wordt in evenwicht gebracht met 60 mM barbitalbuffer (7,7 g diethylbarbituurzuur en 10,5 g van het natriumzout daarvan in 1 I water), die 1 g/l 35 EDTA-Kj, bevat, pH 8,5) en als een vulling aangebracht in een chromatografische kolom met afmetingen van 1,5 x 5 cm, d.w.z. een volume van ongeveer 9 ml.

Het monster, ongeveer 10 ml ruw granulocytextract, verdund met 30 ml EDTA-Ka barbitalbuffer met pH

8,5, wordt aangebracht met behulp van een peristaltisch werkende pomp, die een stroomsnelheid van ongeveer2 ml/min. levert. Niet-geadsorbeerde eiwitten worden doorwassen met 100 ml barbitalbuffer 40 verwijderd. Vóór het elueren van de L1-eiwitten wordt de kolom eveneens met 30 ml barbitalbuffer zonder EDTA-«2 gewassen. De L1 -eiwitten worden daarna geëlueerd met 60 mM barbitalbuffer, die 5 mM CACI2 bevat, pH 8,5.

Figuur 1 toont het elueringsprofiel voor een dergelijke ionenuitwisselingschromatografie van het totaal aan eiwitten en L1-eiwitten, terwijl in figuur 2 de patronen van de eiwitbanden zijn weergegeven, indien ruw 45 leukocytextract en gezuiverd L1 -eiwit aan analytische agarosegelelektroforese worden onderworpen. Het blijkt, dat het gezuiverde L1-eiwit twee hoofdbanden levert, die, zoals bovenstaand beschreven, overeenkomen met pl 6,3 en pl 6,5.

De hoeveelheid L1 -eiwit, die met de calcium bevattende buffer wordt geëlueerd, is vrijwel 50% van de hoeveelheid, die in het monster wordt aangebracht, en wordt gevonden in een totaalvolume van ongeveer 50 20 ml. Deze oplossing kan op geschikte wijze worden geconcentreerd door ultrafiltratie onder toepassing van Millipore<R> CX-10 membranen. Dit leidt tot enig verlies aan eiwit afhankelijk van het feit of al dan niet EDTA wordt toegevoegd om te voorkomen, dat L1-eiwit aan de membranen wordt gebonden. Zelfs zonder toevoeging van EDTA kan een totale opbrengst van ongeveer 35% worden bereikt.

Zoals blijkt uit figuur 1, wordt een deel van het L1-eiwit geëlueerd met 60 mM barbitalbuffer, die 5 mM 55 CaCI2 en 125 mM NaCI bevat, pH 8,5, maar dit eiwit levert banden in hoofdzaak anodaal en kathodaal ten opzichte van de belangrijkste L1 -banden en kan ten dele bestaan uit gedenatureerd of in een complex omgezet L1-eiwit naast andere eiwitten.

7 192456

Op grote schaal uitgeoefende methoden

De bovenbeschreven methode kan met succes op grotere schaal worden uitgevoerd voor het verwerken van 50 ml ruwe granulocytextracten. Dit wordt bereikt onder toepassing van een kolom, die ongeveer 50 mi DEAE-Sephacel^ bevat (ongeveer 2,5 x 10 cm) en evenredige verhogingen van de volumina van dezelfde 5 buffers als bovenstaand vermeld.

b) Hierbij wordt voordeel getrokken uit het feit, dat een reversibele precipitatie van de L1 -eiwitten kan worden bereikt door toevoeging van 10 mM Zn++. Aan 10 ml ruw leukocytextract wordt 90 ml barbitalbuffer, 75 mM, pH 8,5, en 10 ml van een 100 mM Zn-acetaatoplossing in water toegevoegd. Het neerslag wordt verscheidene malen gewassen, bijvoorbeeld vijf maal, met 75 mM barbitalbuffer, pH 8,5, met 10 mM 10 Zn-acetaat. Ten slotte wordt het neerslag gewassen met 75 mM barbitalbuffer, pH 8,5, en opgelost door druppelsgewijs een oplossing van 100 mM EDTA-K2 in water toe te voegen, waarvan de pH op 8,5 is ingesteld met 5 M natriumhydroxide. Deze eiwitoplossing wordt aangebracht op een Pharmacia PD-10 kolom, die met gedestilleerd water in evenwicht is gebracht, waarna de L1 -eiwitten worden geëlueetd met 3,5 ml gedestilleerd water en gelyofiliseeid, waarbij ongeveer 10 tot 20 mg zuivere L1-eiwitten worden 15 verkregen.

Voorbeeld III

Bereiding van antiserum ten opzichte van gezuiverd L1 20 Een oplossing, die ongeveer 1 mg/ml gezuiverd pl 6,3 en pl 6,5 L1 -eiwit bevat (verkregen volgens voorbeeld I of II) in 0,1 M natriumacetaat, 2,5 mM EDTA, 0,35 mM thimerosal met pH 8,5 wordt met Freund’s compleet adjuvans gehomogeniseerd. Een volume van dit mengsel, dat ongeveer 100 pg L1-eiwit bevat, wordt gedurende 6 weken op verscheidene subcutane plaatsen bij konijnen een maal per week ingespoten. Van de konijnen wordt bloed afgenomen door venapunctie. Men laat het bloed in verloop van 25 de nacht bij kamertemperatuur stollen. Het serum wordt verzameld en op L1-antiserumactiviteit onderzocht. Een dergelijk antiserum kan normaliter in een verdunning van 1:32 voor de immunopredpitatie volgens een enkele straal en in een verdunning van 1:2000 voor de radioimmuunproef worden gebruikt.

Voorbeeld IV

30

Testkit voor radioimmuunproef De testkit bevat (voor 100 proeven):

1 ampul 2 ml gelyofiliseerd anti-L1 serum, verkregen volgens voorbeeld III

1 fles 100 ml RIA-buffer: 50 mM natriumchloride, 0,2% runderserumalbumine, 0,2% natrium- 35 azide, ingesteld op een pH van 7,4 1 ampul met een 5 ml van een waterige oplossing van met radioactief jood125 gemerkte L1-eiwitten rubberafsluiting ingesteld voor het verschaffen van 500 cpm/ml (gemerkt volgens de Bolton-Hunter methode) 1 fles 100 ml van een waterige suspensie van met formaline behandelde Staphylococcus 40 aureus (PASA = eiwit A bevattend Staph, aureus van de Cowan I stam) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing 1 fles 2 ml van een RIA-bufferoplossing, die 500 ng L1-eiwit bevat (referentie-oplossing)

Voorschrift voorde kwantitatieve bepaling van L1-eiwitten doorRIA 45 Een reeks standaardoplossingen werd bereid door tweevoudige verdunning van de geleverde L1 referentie-oplossing tot en met 7,8 ng/ml met RIA buffer. In een reeks reageerbuizen wordt 25 μ| plasma van een patiënt, verdund op 1:30 met RIA buffer of gestandaardiseerde referentieoplossing, gepipetteerd. Hierbij wordt 20 μΙ anti-L1 serum gevoegd, waarna de mengsels gedurende 30 min. bij 37°C worden bebroed. Vervolgens wordt 50 μΙ van de oplossing met het radioactief gemerkt L1 -eiwit toegevoegd, gevolgd door een 50 bebroeding gedurende 1 uur bij 37°C. Bij elke buis wordt dan 1 ml gesuspendeerde Staph, aureus-uspensie gevoegd, waarna gedurende 10 min. met 2000 x g wordt gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof wordt afgezogen en de radioactiviteit in het bezinksel wordt gemeten. Het percentage van de radioactiviteit, betrokken op de aanvankelijk toegevoegde radioactiviteit, wordt voor de gestandaardiseerde Li referentie-verdunningen uitgezet, zodat de referentiekromme kan worden getekend. De waarden voor de van de 55 patiënt afkomstige monsters kunnen van deze kromme afgelezen.

192456 8

Voorbeeld V

Testkit voor nefetometrische bepaling van L1-eiwitten in oplossing De testkit bevat: 5 1 ampul 1,5 ml anti-L1 antilichaamoplossing in buffer met pH van 7,5 (natriumacetaatbuffer, die 5 mM calciumchloride bevat) met een titer van ongeveer 1:32, indien onderzocht door dubbel immunodiffusie in agarosegel 1 fles 20 ml verdunningsbuffer, zoals bovenstaand 1 ampul 0,5 ml van een oplossing van L1 -eiwit en concentratie van 400 pg/ml 10 Anti-LI serum wordt tot 1:15 verdund met een verdunningsbuffer. Zes gestandaardiseerde oplossingen van L1 -eiwit (1:1 tot 1:64) worden bereid door tweevoudige verdunning van de gestandaardiseerde L1-oplossing. Vervolgens worden 250 pl van de antilichaamverdunning en 10 μΙ monster of verdunde L1 -standaard in de nefelometercuvettes gemengd en gedurende 10 min. bij kamertemperatuur bebroed. De optische dichtheid wordt van de nefelometer afgelezen.

15

Voorbeeld VI

Testkit voor immunodiffusieanalyse volgens één enkele straal voor L1 -eiwitten in oplossing De testkit bevat: 20 1 of meer tevoren bereide agarosegelen, die 2% van een gelijkmatig verdeelde anti-L1 antilichaamoplossing met een titer van ongeveer 1:32 bevat, indien onderzocht door dubbeldiffusie in gel, en 0,1 M natriumacetaat, 5 mM calciumchloride, 0,25 mM thimerosal met pH 8,5 1 ampul 0,1 ml L1-eiwitoplossing met een concentratie van 300 pg/ml 25 Het agarosegel wordt in een afgesloten kamer verschaft om uitdrogen van het gel te voorkomen. Het gel bezit 18 tevoren aangebrachte verdiepingen voor het aanbrengen van 10 μΙ van de standaardoplossingen en de te onderzoeken monsters.

Voorbee/d VII 30

Testkit voor de latexagglutinatieproef voor een semikwantitatieve bepaling van L1-eiwit De testkit bevat: a) 1 fles 2 ml van een suspensie van latexdeeltjes met een diameter van 50 pm, waarop gezuiverd L1-eiwit is gefixeerd 35 b) 1 fles 2 ml van een bufferoplossing van het L1 -antilichaam, die de bovenvermelde latex deeltjes zal agglutineren, met een titer van 1:3 tot 1:4 c) 1 fles 0,5 ml van een bufferoplossing van het L1-eiwit in een concentratie van 50 pg/ml 1 druppel a), b) en het te onderzoeken monster van een patiënt wordt op een zwarte plaat gemengd en gedurende 5 min. op agglutinatie waargenomen. Afwezigheid van agglutinatie duidt op een A1 concentratie 40 van meer dan 1000 ng/ml. Bij een positieve controle worden oplossingen a), b) en c) gemengd en dient zich geen agglutinatie te ontwikkelingen.

Voorbeeld VIII

45 Testkit voor de vlekproef De testkit bevat: 10 stukken celluloseacetaat van 5 x 50 mm met twee vlekken met een diameter van 4 mm van gedroogd specifiek anti-L1 antilichaam, die zich bevinden op 10 en 30 mm aan het ene einde.

a) 1 fles 2 ml van een bufferoplossing, die specifieke anti-L1 antilichamen geconjugeerd met 50 mierikswortelperoxidase bevatten b) 1 fles 10 ml van een waterige trisbuffer/isotone zoutoplossing, pH 7,4, die 1 mg/ml diamino- benzidine (DAB) bevat c) 1 fles 1 ml van een waterige bufferoplossing van L1 -eiwit in een concentratie van 50 pg/ml

Voor het onderzoek wordt een druppel van de monsteroplossing aangebracht op de eerste vlek en een 55 druppel c) op de tweede vlek. Na 10 min. wordt de proefstrook gedurende 5 min. in trisbuffer/zoutoplossing gewassen. Daarna wordt een druppel van een oplossing a) op elke vlek aangebracht en hierop gedurende 10 min. bij kamertemperatuur gehouden, waarna de strook weer gedurende 5 min. in trisbuffer-

Claims

1. Humaan gralunocyteiwit van het type L1 met isoelektrisch punt bij pl 6,3 en pl 6,5, met het kenmerk, dat 45 het vrij is van niet-L1 -type eiwitten en bij bepaling door gelfiitratie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie een moleculegewicht van 36.500 Da heeft en bij bepaling door middel van SDS-elektroforese polyacrylami-degel drie polypeptideketens erin aanwezig blijken te zijn, welke ketens en waarbij uitgaande van de N-terminus elk van de polypeptideketens als eindstandige aminozuursequentie Met-Leu-Thr-Glu bezitten bij bepaling volgens het standaard Edmanvoorschrift.

2. Werkwijze voor het bereiden van een zuiver eiwit, met het kenmerk, dat men een eiwit volgens conclusie 1 bereidt, waarbij men - granulocyten isoleert, - deze vervolgens vernietigt onder zodanige omstandigheden dat de lysosomen binnen de granulocyten niet tegelijkertijd worden vernietigd, doordat het buffersysteem waarin de granulocyten worden vernietigd 55 een middel omvat dat tegelijkertijd vernietiging van de lysosomen voorkomt en aanwezig is in een concentratie, voldoende om de osmotische druk vóór en na vernietiging van de celwanden te stabiliseren, en 192456 10 - de vernietiging van de celwand van de granulocyten in op zich gebruikelijke wijze plaatsvindt en - onoplosbare materialen in op zich bekende wijze worden verwijderd waarna - het L1 -eiwit vrij van niet-L1-type eiwitten uit het ruwe aldus verkregen granulocytextract volgens één of een combinatie van de volgende zuiveringsstappen worden verkregen: 5 a) isoelektrisch focussen en elutie van de banden die het pl 6,3 en/of pl 6,5 L1 -eiwit bevatten met een buffer of b) anionenuitwisselingschromatografie met een EDTA bevattende buffer bij een pH van ongeveer 8,5 en elutie van de gewenste L1-eiwitten met een buffer die calciumionen bevat of c) affiniteitschromatografie of 10 d) preparatieve agarose gelelektroforese of e) kationenuitwisselingschromatografie of f) gelfiltratie of g) reversibele precipitatie met Zn2* of enige combinatie van de trappen a) t/m g) waarna - de eluaten van mogelijke amfolyten en/of zouten worden bevrijd, 15. de verkregen oplossing van de zuivere L1-eiwitten worden geconcentreerd en - de verkregen oplossing desgewenst wordt gelyofiliseerd en de verkregen L1 -eiwitten desgewenst in een zout worden omgezet en/of - het verkregen zout in de vrije eiwitten wordt omgezet.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het buffersysteem waarin de granulocyten worden 20 verbroken verder enzyminhibitoren bevat die ontleding van de L1 -eiwitten voorkomen.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de enzyminhibitor fenylmethylsulfonylfluoride of ethyleendiamine tetraazijnzuur of een mengsel daarvan bevat.

5. Werkwijze volgens één van de conclusies 2-4, met het kenmerk, dat de celwanden van de granulocyten worden verbroken door drukhomogenisering.

6. Werkwijze volgens één van de conclusies 2-5, met het kenmerk, dat na verbreking van de granulocyten in het geschikte buffersysteem het granulocytextract wordt onderworpen aan anionenuitwisselingschromato-grafie met een EDTA bevattende buffer bij een pH van ongeveer 8,5 en aan eluering van de gewenste L1 -eiwitten met een buffer die calciumionen bevat.

7. Monospecifiek antiserum tegen het eiwit volgens conclusie 1, of tegen een eiwit verkregen volgens de 30 werkwijze volgens één der conclusies 2-6.

8. Monospecifiek antiiichaam tegen het eiwit volgens conclusie 1 of tegen een eiwit verkregen volgens de werkwijze volgens één der conclusies 2-6.

9. Gebruik van monospecifiek antiserum volgens conclusie 7 of monospecifiek antiiichaam volgens conclusie 8 voor de kwalitatieve of kwantitatieve detectie van eiwitten volgens conclusie 1 in cellen, 35 weefsels of lichaamsvloeistoffen.

9 192456 zoutoplossing wordt gewassen. Bij 1 ml oplossing b) wordt 5 μ) 30%’s waterstofperoxide gevoerd. Eén druppel van dit mengsel wordt op elke vlek aangebracht. Een duidelijke brnine verkleuring, die na 3 min. optreedt, wijst op de aanwezigheid van L1 -eiwitten in het monster. Door verdunningsreeksen van het monster te maken kan de proef semikwantitatief worden gemaakt. 5 Voorbeeld IX Testkit voor L1 -eiwitten door enzymimmuunproef De testkits bevatten: 10. microtiterschaal met 5 x 10 verdiepingen, vervaardigd uit kunststofmateriaal, waarvan het inwendige oppervlak van de bodem en het onderste gedeelte van de verdiepingen bekleed zijn met specifieke anti-L1 antilichamen a) 1 fles 2 ml van een bufferoplossing, die specifieke anti-LI antilichamen geconjugeerd met mierikswortelperoxidase bevat 15 b) 1 fles 10 ml van een waterige trisbuffer/isotone zoutoplossing, pH 7,4, die 1 mg/ml diamino- benzidine (DAB) bevat c) 1 fles 1 ml van een waterige bufferoplossing van L1 -eiwit in een concentratie van 50 pg/ml Volgens het proefvoorschrift worden 50 μΙ van de te onderzoeken monsteroplossing of van de oplossing c) in de verdiepingen gebracht en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bebroed. De verdiepingen worden 20 dan met trisbuffer/zoutoplossing gewassen, die 0,5% runderserumalbumine bevat. In elke verdieping wordt 50 μΙ oplossing a) gebracht, waarna gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wordt bebroed. De verdiepingen worden zoals bovenstaand gewassen. Aan 1 ml oplossing b) worden 5 μΙ 30%’s waterstofoxide toegevoegd en 50 μΙ van dit mengsel wordt in elke verdieping gebracht. De schaal wordt dan gedurende 30 min. bij kamertemperatuur bebroed, waarna de kleurintensiteit in elke verdieping fotometrisch wordt bepaald. 25 Verklaringen van de figuren Figuur 1: Chromatografisch profiel van 9 ml ruw leukocytextract op een DEAE-Sephacel^ kolom van 1,5 x 5 cm. Het totale eiwitgehalte werd door UV-lichtabsorptie bepaald bij 280 nm en de L1 concentratie door immunodiffusie volgens één enkele straal.

30 Figuur 2: Eiwitbandenpatroon van ruw granulocytextract (A), de 5 mM CaCI2 fractie (B) en de 125 mM NaCI fractie (C) bij agarosegelelektroforese in barbitalbuffer, 75 mM, met 2,5 mM EDTA-K2, pH 8,5. Fractie B bevat de twee zuivere L1 -eiwitten pl 6,3 en pl 6,5. Literatuurverwijzingen: 35 (1) Magne K. Fagerhol, Inge Dale en Terje Andersson, Scand. J. Haematol. (1980) 24, 393-398. (2) M.K. Fagerhol, I. Dale, T. Andersson, Buil. europ. Physiopath. resp. 1980, 16 (suppl.) 273-281. (3) Karen E. Willard, Anne Karine Thorsrud, Eimar Munthe en Egil Jellum, Clin. Chem. deel 28, nr. 4, 1067-1073 (1982). (4) French, P.C. en Holm, R.A., (1947) Thromb. Diath. Haemorrh. 32, 432-440. 40

10. Testkit, met het kenmerk, dat een monospecifiek anti-L1 antiiichaam volgens conclusie 8 of monospecifiek anti-L1-serum volgens conclusie 7 erin aanwezig is. Hierbij 2 bladen tekening