JPH04503076A

JPH04503076A - 非通常ウイルスによる汚染のないグリコスフィンゴ脂質混合物の製造および精製方法

Info

Publication number: JPH04503076A
Application number: JP2515353A
Authority: JP
Inventors: デッラ・バッレ，フランチェスコ; カッレガーロ，ランフランコ; ロレンジ，シルバナ
Original assignee: フィディーア・ソシエタ・ペル・アチオニ
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1990-11-16
Publication date: 1992-06-04
Anticipated expiration: 2016-03-05
Also published as: HU210145B; PT95917B; ES2119747T3; AU6727590A; DE69032578D1; IL96346A; IN171530B; NO912780L; PT95917A; CN1027895C; NO175311C; AU649635B2; HUT58754A; FI97138C; IE904135A1; YU218790A; NO912780D0; WO1991007417A1; ATE169926T1; CA2045142A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】非通常ウィルスによる汚染のないグリコスフィンゴ脂質混合物の製造および精製方法発明の分野本発明は、ガングリオシド混合物の中枢および末梢神経系への作用に関係したその生物学的および薬理学的性質を変えることなく、非通常の生命を脅かすウィルスに関連した不純物を選択的に除去する方法によって得られる、特定のガングリオシド混合物の製造方法およびこのような方法によって得られる生成物に関する。

聚■９考屡シアル酸を含むグリコスフィンゴ脂質であるガングリオシドは、哺乳動物の全ての細胞膜の普通の構成成分であり、神経組織に多く含まれている［Ａｎｄｏ　Ｓ、　：　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ、　”ｑ、　５０７　（１９８３）コ。

４種類のガングリオシド、即ちＧＭ、、、ＧＤ、、、ＧＤｌｂおよびＧ　Ｔ　、ｂ［Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ　Ｌ、　：　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　１０．６１３　（１９６３）に従った命名］が、哺乳動物編の全ガングリオシド含量の８０〜９０％を構成する。ガングリオシドは形質膜の外層に特異的に局在し、このことはこれらが多くの生物学的活性に、例えば種々の分子の「センサー」および／または受容体として、および細胞膜を経る情報の移転に重要な役割を果たしていることを示唆する［Ｆｉｓｈｏ＋ａｎら＋　５ｃｉｅｎｃｅ　１９４．９０６　（１９７６）〕。従って、これらはニューロン系長の調節ならびに中枢および末梢神経系の修復に重要な役割を果たしている。

ガングリオシドが、ニューロン培養物でのインビトロの研究によって明らかにされたような神経栄養因子との相互作用により、および特異的な膜機序の関与により、末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮ　Ｓ　）の損傷の後の機能的な回復に好ましい影響を与えうろことについては実に多（の文献が存在する［Ｄｏｈｅｒｔｙ　Ｐ、ら：　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　４４．１２５９　（１９８５）；　５ｋａｐｅｒ　Ｓ、ら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３゜１７３　（１９８９）］。

特に、インビボでガングリオシドを投与すると病的状態のＰＮＳにおいて神経再生および機能的回復が促進されることが報告されている：即ち、外傷性の神経障害［Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ　Ｂ、ら：　Ａｄｖ、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、　Ｂｉ代謝性の神経障害［Ｎｏｒｉｄｏ　Ｆ、ら：　Ｅｘｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、　８３．２２１　（１９８４）コおよび毒物性の神経障害［Ｄｉ　Ｇｒｅｇｏｒｉｏ　Ｆ、ら：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　＋　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　２６．３１　（１９９０）］のモデルにおいてポジティブな作用が記載されている。

ＣＮＳについては、異なる動物種の種々のニューロン系の虚血［Ｃｕｅｌｌｏ　Ａ、Ｃ，ら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、３７６、　３７３　（１９８６）；　Ｋａｒｐｉａｋ　Ｓ、Ｅ、ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　Ｓ中のＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　（１９９０年３月発行）］、外傷性の損傷［Ｔｏｆｆａｎｏ　Ｇ、ら、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２９６．２３３　（１９８４）］および神経毒損傷［Ｊｏｈｎｓｓｏｎ　Ｊ、、　Ｄｅｖ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１６．１７１　（１９８４）］のモデルにおいて、モノシアロガングリオシドＧＭ、により誘導される回復についてポジティブな作用が広く報告されている。最近になって、ガングリオシドがグルタメートによって誘導されるタンノ４り質キナ−ゼＣの転移および活性化を抑制しうろことが見い出された［ＶＢｃａｒｉｎｏ　Ｆ、ら、　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．８７０７　（１９８７）］。この作用は虚血損傷の状態では極めて重要である（この状態において、二ニーロンの死を導（現象のカスケードの引き金となるグルタメートなどの興奮性のアミノ酸によって果たされる決定的な役割が報告されている）。この機序は、損傷の周辺領域の二ニーロンの生存を助け、逆行性の退化を妨げ、そして局所栄養因子に対する回復成長反応を促進する。

これら実験的研究の結果は、ガングリオシドの臨床使用による結果によって十分に確認されている。１０年以上にわたり、機械的損傷に由来する形態から毒性因子もしくは欠損によって引き起こされる形態に至るまで、感染性および炎症性障害から代謝性機能障害に至るまでのほとんど全ての形態の末梢性神経障害においてガングリオシドが治療薬物として使用されている。この薬物は、単神経障害および多発神経障害において、感覚−運動障害において、および自律神経系に影響を及ぼす病変において、例えば頭蓋神経に影響を及ぼす多くの神経障害、例えばベル麻痺、三叉神経痛、および帯状ヘルペスによって引き起こされる神経痛において等しく有効であることが示された。ガングリオシド、特にモノシアロガングリオシドは、脈管または外傷型のＣＮＳにおける急性損傷に関係した全ての病変において、およびこのような病変（大脳虚血、頭蓋およびを髄損傷）の続発症において広く用いることができる。

また、ＣＮＳにおいて証明されたこれらの修復活性は、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの慢性の神経退化性の病変においてこれらを使用することを支持する。これらが本質的に［エンドコイド（ｅｎｄｏｃｏｉｄ）Ｊ　（内生の薬物）であり、二ニーロン膜の天然の構成成分であるという事実は、これらの優れた寛容性、および高用量による長期治療においても副作用がないこと（末梢神経障害の通常の治療法の一部において非常に多い）を示すものである。

通常、適当なガングリオシド混合物、例えば１８％〜２４％のＧＭ、、３６％〜４４％のＣＤ、、、１２％〜１８％のＣＤ、Ｔｈおよび１６％〜２２％のＧＴｌｂの配合の混合物、または単一のガングリオシド分画、特にモノシアロガングリオシドＧＭ、が、記載されているような生物学的活性を提供する。適当な混合物または単一分画、特にモノシアロガングリオシドＧＭ、などのこれらガングリオシド類は哺乳動物の脳から抽出され、従って、末梢および中枢神経系に対してこれまで記載されていたこれら物質の特定の生物学的機能およびこれら物質の治療学的応用が得られるよう、生物学的および化学的不純物を含まない完全に純粋な最終産物を保証する精製法を用いることが必要である。

研究レベルでガングリオシド混合物の抽出が可能であることが既知となって久しいが［Ｔｅｔｔａｓａｎｔｉら＋　Ｂｉｏｃｈｉｍ、ｅ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２９６゜１６０　（１９７３）；　Ｔｒａｍｓ＋ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、ｅ　Ｂｉｏ　ｈｙｓ、Ａｃｔａ　６０．　３５０　（１９６２）；ＢＯｇｏｃｈら、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ、Ｐｈａｒｓ、１ｇ＋　６２５　（１９６２）；　ｌｌｉｅｇａｎｄｔら、むμｍＣｈｅｗ、　８０．８９　（１９６８）；米国特許Ｎｏ、　３．４３６．４１３；およびＣ，Ａ、　６１．９８５１ｃ、　９８９５ｄ］、これら方法はいずれも非通常ウィルスに関連した成分の除去および破壊の観点から開発されたものではない。この理由の１つは、この当時、脳の抽出に用いる哺乳動物種に罹患するそのような疾患が未知であったことである。別の理由は、危険の可能性がある成分を特異的に同定する試薬がなかったことであるが、今日では、分子生物学的方法の科学的発展によって集められた新たな知識に基づいて開発された特異的な方法によりこのような試薬が利用可能になっている。

病原物質または物質群を同定することができない種類の病的状態が発生することがある。このような病的状態の１つは、１９８６年に英国で初めて報告されたウシ海綿状脳障害（ＢＳＥ）である［ＷｅｌｌｓＧ、ら、　Ｖｅｔ、Ｒｅｅｏｒｄ、　４１９．１９８６］。この名称は、罹患した動物の脳組轍の海綿状の見掛けに由来する。組織切片を顕微鏡で調べると、主な損傷には広範囲な二ニーロン小胞が関与している。

利用可能な全ての証拠は、ＢＳＥが中枢神経系の退化性脳障害の群に属し、その結果が間違いなく致死性であり、一群の非通常の感染性媒体によって引き起こされることを示す［Ｆｒａｓｅｒら、　Ｖｅｔ、Ｒｅｃｏｒｄ　１２３．４７２　（１９８８）ＨＨｏｐｅら、　Ｎａｔｕｒｅ　３に６．３９０　（１９８ｇ）］。また、この群には、ヒツジおよびヤギのスクラピー、捕らえたシカが罹患する慢性の痩せ疾患、ミンク飼育場のミンクの感染性の脳障害、ならびに２つのヒト疾患、即ちクル病およびクロイツフェルトーヤーコブ病が含まれる。これら疾患によって脳に引き起こされる組織病理学的な損傷は全ての場合に類似しており、ＢＳＨによって引き起こされる損傷と共通点が存在する。多数の理論がこれら病因媒体、即ち細菌でもウィルスでもなく、あらゆる他の既知生物とは類似しておらず、従って非通常ウィルスとして知られている媒体の性質に対して提出されている。感染の時から症状の始まりに至る長い潜伏期間の故に、これらウィルスは「スローウィルス」としても知られている。

１９８６年に観察されたいくつかの例から、英国でこの病気が広がり、流行性の比率に達した（約１４，０００のウシが罹患し、毎週約２５０〜３００の例で着実に増加した）。感染したウシは数年間は病気の徴候を示さないが（潜伏期間は４〜５年である）、一度症状が現れるとこの動物は急速に悪化し、死に至る。

Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｒ１ｔｊｓｈ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｒ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅによる疫学的研究［Ｗｉｌｅｓｍｉｔｈら、　Ｖｅｔ、Ｒｅｃｏｒｄ、　１２３．６３８　（１９８８）］は、粉末の肉または骨の形態で売られている他の反別動物の加工された死骸を用いて調製された動物飼料が感染源であることを示した。脳障害は広範囲な動物種に伝染することができるので、これら汚染された食糧によってヒツジから伝染したスクラピーの原因である病因学的媒体による感染の結果がＢＳＥであると仮定するのが妥当と考えられる［Ｍｏｒｇａｎ　ＫＬ、　Ｖｅｔ、Ｒｅｃｏｒｄ　１２２＋　４４５　（１９ｇ＋１１）コ。

この研究の結果に基づいて、英国政府は反別動物由来の動物タンパク質を含有する動物飼料の販売および供給を１９８８年７月１８日発効の政令により禁止した。

一般的な見解は、多くの因子が一緒になって英国での突然のＢＳＥの出現に寄与しているというものである［Ｃｈｅｒｆａｓ　Ｊ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。

５２３　（１９９０年２月）コ。

始めに、英国でのヒツジの数が７０年代後期および８０年代初期に急速に増加し、これに伴って２５０年以上にわたる欧州のヒツジの風土病であるスクラビーの発生が増加した［Ｐａｔｔｉｓｏｎら＋　Ｙｅｔ、　Ｒｅｅｏｒｄ　９０．４６５　（１９７２）］。これと同時に、石油危機に引き続いて、動物飼料を製造している工場は死骸を加工する方法を比較的低温の系に変えたく耐性の高いスクラビー媒体を破壊する効率が恐らくは低い〉。これら飼料の製造元の一部を除く全ては、大豆および骨粉から過剰の脂肪を除去するための溶媒（ベンゼン、ヘキサンおよびトリクロロエチレンなど）の使用をやめた。全ての中で最も重要なことは、恐らく、生成物を加熱して溶媒を除去するための最後の段階を結果的にやめたことであろう。実際的には、この段階は極めて高いｍ度を必要としていた。

さらに、政府の政策は飼育室がさらに多くの牛乳を生産することを奨励しており、子牛をタンパク質に富む食餌で飼育することにより早期に乳離れさせることを奨励していた。これらは品質に劣っていることが多かったが、これは肉および骨から調製した粉末がより確かなタンパク質供給源である大豆および魚を用いて調製した製品よりも安かったためである。どのようにして病気が伝染するかを見つける研究がＢＳＥ研究の基礎である。これら実験の最も重要な側面は、病原媒体の伝播に対する種間の障壁の限界を同定することによって、いずれかの種に対するＢＳＥ感染の危険を評価しつるということである。Ｆｒａｓｅｒら［Ｖｅｔ、　Ｒｅｃｏｒｄ上２３．４７２　（１９８８）］は、この病気がウシからマウスに伝わりうることを示した。彼等は、ＢＳＥで死んだウシの脳からの抽出物をマウスの脳に接種した。すると後にマウスにこの病気が現れた。Ｌａｔｅｒ、　Ｂａｒｌｏｗら［Ｖｅｔ、Ｒｅｃｏｒｄ　（１９９０年２月３日）］は、感染した脳でマウスを飼育することによりマウスにこの病気を伝染させた。これが、感染した物質を食べることによってＢＳＨに罹患させうろことの最初の証明であった。罹患動物の他のいずれの組織（膵臓、を髄、リンパ組織、乳など）もマウスにこの病気を起こすことはできなかった。

スクラビーは母から子羊に伝染しうろことが証明されているが、ウシにおけるＢＳＨの病因学的媒体の垂直伝播または水平伝播の可能性を証明するものはこれまでなかった。

亜急性の感染性脳障害を引き起こす媒体は通常の浄化法に対して極めて耐性が高い。この側面での利用可能なデータのほとんどはスクラピーおよびクロイッフェルトーヤーコプ病の媒体の不活性化に基づ（研究に由来している。スクラビーの病因学的媒体は温度変化に対して極めて耐性が高い。８０℃までの温度に暴露してもその感染性はわずかに減少するのみであるコしかし、さらに高い温度は感染性を顕著に減少させる［Ｈｕｎｔｅｒら、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３７．２５１　（１９６４）］。感染した物質の懸濁液を１００℃で１時間または１１８℃で１０分間加熱したときに、少量の感染性「ウィルス」が残存することがある。

最近になって、オートクレーブ中の高水蒸気圧のもとでこれら感染性媒体を滅菌する標準を新たにする必要が気付かれた。米国におけるクロイツフェルトーヤーコプ病浄化のためのオートクレーブ処理を規定する現在の標準は１３２℃で１時間の処理からなり［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、＾ｎｎａ１ｇ　ｏｒ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　１９．７５　（１９ｇ＆）コ、これはスクラビーまたはクロイッフェルトーヤーコブ媒体を含む脳ホモジネートで行った研究に基づいている［Ｂｒｏｗｎら、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　摩。

１１４５　（１９８６）］。英国におけるクロイツフェルトーヤーコブ病からの浄化のためのオートクレーブ処理の現在の標準は１３４〜１３８℃で１８分間オートクレーブ処理することからなり、これはＫｉｍｂｅｒｌｉｎら［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　５９．３５５　（１９８３）］による研究を含むいくつかの研究に基づいている。

残念なことに、ウシ海綿状脳障害媒体は、通常の化学的処理ならびに物理的処理に対して極めて耐性が高い。ベンゼン、ヘキサン、石油およびトリクロロエチレンなどの溶媒が抽出溶媒として使用されたが、感染性に対するこれらの作用はわずかしか知られていない。

感染性媒体の化学的不活性化についてはほんのわずかのデータしか利用できないが、これは主として多数の動物と長期の観察期間が研究に必要とされるためである。０．３％〜２．５％の濃度の次亜塩素酸ナトリウムは、使用された生物学的検定において感染性を大きく減少させたが、それを完全には排除しないことが多かった［Ｗａｌｋｅｒら、　ＡｔＪ、Ｐｕｂｌ、Ｈｅａｌｔｈ　７３．６６１　（１９８３）コ。０．２５Ｎまでの水酸化ナトリウムによる処理に関するデータは極めて一定しないが、ＩＮを越える濃度では、これが調べたもの全ての中で最も有効な化学的試薬であるようであった。また、６Ｍ〜８Ｍ尿素による処理も極めて一定しないものであることが報告されている。

このように、浄化についての研究結果は、感染性の大部分は多数の異なる物理的および化学的処理によって迅速に破壊されるが、少量の耐性感染性媒体のサブ集団の存在が実施の上で汚染物質の滅菌を極めて困難なものにすることを示している。

ＢＳＥが「メクラピ一様」の疾患であると同定されたときに、重要な疑問が疫学的レベルおよび分析レベルで問われ始め、特にこの後者は感染性に関連した媒体を同定することに照準が当てられていた。しかし、病因媒体に関係した核酸を同定するためにこれまで為された全ての努力は好結果をもたらすものではなかった。感染作用に明確に関係している唯一の単離された成分は、スクラピー・ブライオン（ｐｒｉｏｎ）タンパク質（ＰｒＰｓｃ）と呼ばれるシアロ糖タンパク質である。

このタンパク質で行われた遺伝的な研究は次にいくつかの驚くべき情報を提供した。このタンパク質のＮ末端配列に′従って合成されたいくつかのＤＮＡプローブは、感染動物の脳におけると同様、健康な動物の脳においても同じ制限パターンを示す個々のコピーにおける染色体遺伝子の存在を示すことを可能にした。極めて異なった種においてさえも保存されているこの遺伝子は、見掛は分子量３３〜３５．０キロダルトン（ｋｄ）を有する細胞性プライオンタンパク質（ＰｒＰｃ）と呼ばれるタンパク質をコードしており、これがＰｒＰ”に対して特に明確な相違を示した二１）ＰｒＰ’はプロテアーゼに対して感受性であるが、ＰｒＰ″′は耐性である。特に、ＰｒＰｃは酵素プロテイナーゼＫによって完全に分解されるが、ＰｒＰｓｅは約５ｋｄのフラグメントにＮ末端のレベルで加水分解され、Ｐ　ｒＰ　＊ｑ−ｓ。と呼ばれるタンパク質を生じる。この形態が感染性と同時精製され、感染性物質の調製において得られる最も量の多い成分である。

２）ＰｒＰｃおよびＰｒＰ１′ｅの両方は膜タンパク質であり、第１のものは清浄剤による処理によって溶解するが、第２のものはアミロイド線維状の構造にポリマー化する傾向にある。同様の構造（スクラビー関連の原線維、５ＡＦ）が感染した脳に見い出され、これはこの型の感染に特有である。不活性化に対するこの感染性タンパク質の耐性は独特なものである：例えば、これは濃アルカリ溶液による処理に対して、または１２０°Ｃ以上の温度への暴露に対して、およびこれらの組合せもしくは別の変性剤との組合せに対して感受性である。従って、これら海綿状脳障害の絶対的な同定のために利用できる唯一の診断方法は、感染した脳組織、抽出物中のＳＡＦの存在の確認、およびタンパク質ＰｒＰｔｔ−３゜の免疫化学的同定であり、病理学的解剖のときだけに適用できる方法である。

ＳＡＦが感染したウシ脳において同定され、ＰｒＰｓｃの同族体が単離され、マウスＳＡＦに対して得た血清との反応性が示された。

さらに、最初の１２アミノ酸のＮ末端記動はヒツジのＰｒＰ”との１００％の相同性を示し、ただ１つのグリシンの挿入によってマウス、ハムスターおよびヒトのものとの相違を示した。ＢＳＥが「メクラビ一様」疾患であることが確かめられてすぐに、いくつかの重要な疑問が疫学レベルおよび分析レベルで生じ、特にこの後者が感染性に関係したタンパク質を同定するために充てられた。

これらの神経学的疾患においてなお説明されるべき全ての側面およびＢＳＨの予想外の出現は、この問題に考慮を払うべき必要性を、特にウシ原料から導かれる産物の製造に関与している者に引き起こした。

実際のところ、食品用途に保証された粗原料を医薬的に興味ある化合物またはそれらの混合物を得るために使用するのが十分ではないこともある。従って、感染性に関係したタンパク質および感染性それ自体の排除を保証する抽出法を用いて問題の産物を製造する方法を開発することが必要である。感染性が活性である分画の抽出法が、同時に、最終産物として所望の活性成分の生物学的活性を保存するものであるべきなのは明白である。

ヒト用のこれら調製物のレベルで危険の可能性がある他のタンパク質は、ミニリンの塩基性タンパク質（ＭＢＰ）である。

これは、ヒトおよびほとんどのを椎動物において約１９．５ｈｄの分子量（Ｍｙ）を有するタンパク質である。これは、ヒトミニリンでは３種の分子形態で存在し、マウスミニリンでは６種の形態で存在し、染色体１８に位置する１個の遺伝子によってコードされ、全ミニリンタンパク質の約３０％を構成する。その正確な局所解剖学的な局在は今なお確かではない。これは、髄鞘形成のときにだけ乏突起膠細胞の細胞質において観察された。同一と考えられるタンパク質が末梢神経系に存在しくプロティンＰＩ）、実験室動物において実験的なアレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）を誘導する末梢ミニリンの能力はそれによっている。

ＭＢＰの全分子が脳炎誘発性ではなく、種によって異なるその一部にすぎない、即ち、ウサギでの脳炎誘発性部分はアミノ酸フラグメント６４〜７３であり、Ｌｅｗｉｓラットでは７１〜８５であり、モルモットでは１１３〜１２１であり、ＳＪＬ／Ｊマウスでは８９〜１６９である。このＥＡＥは典型的な細胞依存性の自己免疫疾患である：実に、これは感作されたＴリンパ球の注入によっである動物から他の動物に移すことができるが、血清の注入によっては移すことができない。この場合、この疾患は移入されたリンパ球によって維持されるが、受入体のそれによっては維持されない。別の細胞依存性の自己免疫形態はアレルギー性の実験的な神経炎（ＥＡＮ）である。これも、完全フロイント・アジバント中の末梢ミニリンの粗製ホモジネートの接種によって高等を椎動物の全ての種に誘導することができる。この自己免疫化の主な原因である抗原は、末梢神経系に存在するＭＶ１２．Ｏｋｄを有するプロティンＰ２であると考えられる。

これら調製物において考慮されるべき他の不純物はウシのゲノムＤＮＡである。

薬学物質として使用することができる生物学的に活性なタンパク質を組換えＤＮＡ法によって製造しうる可能性は、所望のタンパク質を発現する細胞に帰属されるＤＮＡ残基の存在を最いようとしている医薬調製物中のＤＮＡフラグメントの７在は、これらフラグメントをゲノム中に導入する危険の問題を引き起こし、これは遺伝型情報のコントロールされない移転の可能性を伴う。組換えＤＮＡ法によってガングリオシドを得ることは今なお可能ではないが、動物由来の粗原料を用いる抽出産物にこの型のフントロール分析法を適用することが必要である。

最後に、インビトロおよびインビボの研究で用いるガングリオシドは、非シアロガングリオシドおよびグリコセレブロシドなどの他の化合物を含まないものであるべきである。これらの物質が高濃度で存在していると、重要かつ密接な免疫学的関係を有することがあり、また、間違った実験考察を導くこともある。

ＢＳＨの突然の始まりおよびこれら神経学的疾患において今なお明らかにされるべき他の全ての側面は、特にウシ原料から得られる産物の製造に関与している者によって、この問題に対して考慮が払われるべき必要を引き起こした。

上に挙げたような以前のガングリオシドの製造方法は、この産物が、健康に害を与える可能性があることがその当時知られていた生物学的不純物を含まない薬学的に許容しうるちのであることを必要としていた。しかし、その後の成体ウシにおける上記異常の始まりによって、上記の治療学的性質を失うことなく非通常ウィルス媒体を確実に含まないことを特徴とする活性成分を得ること、これら非通常ウィルス媒体の不活性化および感染性の完全な除去を保証する　。

特異的な方法を使用することによってこれを達成すること、およびこのような媒体を同定するための特異的な方法を使用することが必要になったことが明らかである。実際には、消費用に適当であると保証された粗原料を用いて医薬目的用の化合物またはその混合物を得ることが十分でないこともある。ＢＳＨの開始は、インビボでのその生物学的作用を考慮に入れて評価されなければならないことが明白であり、これはこの過程の種々段階の確認の例とみなさなければならず、その結論とみなしてはならない。このインビボでの生物学的作用の分析は、感染をＰ　ｒＰ　ｙｔ−ｓ。などのある種のタンパク質と関連させることについて科学者が今なお一致してないので必要である。感染活性を除去する抽出法が、同時に、活性成分の生物学的活性を無傷のまま残すものでなければならないことは明白であるが、これはそれが治療学的使用のために必須であるからである（生物工学／薬学に関するＡｄｈｏｃ専門委貴会：ウィルス除去および不活性化方法の認可、　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｍｍｕｎｉｔｆｅｓ、１９９０年３月）。科学的な研究によって、一方ではタンパク質、化学的および生物学的不純物を含まない形態で適当なガングリオシド混合物またはその単一の分画を得ることを保証する方法が得られ、また、他方ではスローウィルスに関係した感染性を破壊するのに効果を示した方法が得られた。しかし、ある産物の同様の未知の結果物を、スローウィルスとして定義しうる病原媒体に関係した感染性のない所望の純粋かつ薬理学的に活性な産物として、工業的スケールでも得ることができる方法は知られていない。

１画然鼠惠ム封囚図１は、本発明の方法を図式的に示すものである。

図２は、抗Ｐ　ｒＰ　＊ｔ−ｓ。抗体を用い、ウェスタン・プロット法により、本発明方法の中間段階で採取したいくつかの試料を分析することによって得た結果を示す写真である。

図３は、本発明方法の種々段階で採取したいくつかの試料についてウシゲノムＤＮＡを分析した結果を示す写真である。

図４は、ウェスタン・プロット法において抗ＭＢＰ抗体を用い、本発明方法の中間段階で採取したいくつかの試料を分析することによって得た結果を示す写真である。。

図５は、本発明方法に従って調製したガングリオシド混合物のシリカゲル・クロマトグラフィー分析の結果を示す写真である。

図６は、本発明に従って調製したガングリオシド混合物の生物学的活性を示す写真である。

図７は、本発明方法の中間段階で採取した試料の抗Ｊ’　ｒＰ　＊ｑ−＊。抗体による免疫化学的分析の結果を示す写真である。

発明の詳細な説明本発明の目的は、工業生産に適用しうる有利な方法、および種々の抽出段階の適切な配列に基づく新規な方法によって得られる、スローウィルスが存在しないことを特徴とする産物を提供することである。ウシ海綿状脳障害などのスローウィルスに関係した感染性不純物を種々の段階の間に排除する本方法は、産物それ自体の治療学的活性を示すものである混合物の活性が変化しないままであることを可能にする。本方法によって得られる産物は、ウシ脳またはその部分から得られる一定のガングリオシド混合物または単一の分画からなる。

本発明に係る方法は、上に記した理由から、以下の主要な段階からなる：ａ）ウシ脳組繊をアセトン中で脂質除去にかけ；ｂ）アセトン沈澱物を塩化メチレン／メタノール／水酸化ナトリウムの混合物中、３０℃〜３５℃の温度で少なくとも３時間懸濁させて、疎水性物質と親水性物質を分配し；Ｃ）この沈澱物を水／クロロホルム／メタノールおよび水酸化ナトリウム（ｐＨ１２）により、３８℃〜４３℃で４〜８時間加熱することによって可溶化し；ｄ）この沈澱物をＩＮ水酸化ナトリウムにより、室温で少なくとも１時間可溶化し：そしてｅ）このガングリオシド混合物を含有する溶液を中和し、１０ｋｄの分子量（Ｍｙ）排除の膜で透析する。

以下に限定のためではなく例示のために実施例を挙げる。これら実施例は、海綿状脳障害の形態の感染ウシ脳から、または２６３にスクラピー株由来の感染物質を一定量加えた未感染つシ脳から得たタンパク質粗原料から調製した産物を説明するものである。

原料および方法ガングリオシド混合物を抽出するための方法に用いたウシ脳は、感染動物由来の原料に帰属される組織に典型的な原線維を組織学的な分析により示した。

製造法の工程図を図１に示す。

粉砕し蒸留水に懸濁した感染ウシ脳（１０００ｇ）を、撹拌しながら室温で約３時間、アセトン（３００〜６００　ｍｌ）と接触させた（１：５の重量／容量比）。次いで、この溶液を、沈澱が完結するまで７℃〜４℃の温度および６０００ｘｇで遠心した。次に、溶媒を除去し、適当なガラス容器に入れたこの湿潤粉末に塩化メチレン／メタノール／水酸化ナトリウムの混合物（１８０〜３５Ｃ）＋１）を加え、３０℃〜３５°Ｃの温度で少な（とも３時間、さらに磁気撹拌下に置いた。これを最後に冷却し、次いで１０℃、６０００ｘｇで２０分間遠心した。この液相を、４°Ｃの温度で濾過ロートによって濾過した。この液体に適切量の塩化カルシウムおよびアセトンを加え、約３０分間撹拌下に置き、１０’Ｃおよび６０００ｘｇで遠心した。この沈澱物（粗原料１）を最後に一晩乾燥させ、次いで高真空下で５時間乾燥させた。回収した粗原料１を水／クロロホルム／メタノールの混合物（１０〜１８ｍ１）に再懸濁した。５Ｎ　ＮａＯＨを用いてそのｐＨを１２近辺に調節した。この全体を４〜８時間、３８℃〜４３℃に加熱し、撹拌下に置いた。この終了時点で冷却した後、これを５Ｎ　ＨＣＩで中和し、必要量の水／ｎ−ブタ／−ル／クロロホルムを加えた。これを１５〜３０分間撹拌し、２〜４時間そのままにした。

最後に、下方の有機相を捨て、残りの水相にアセトンおよび塩化ナトリウムを加え、これを約３０分間撹拌し、１５°Ｃおよび６０００ｘｇで２０分間遠心した（粗原料２）。

この産物を高真空下で乾燥し、無水メタノール（６〜１５ｍ１）に再懸濁し、次いで液を時々撹拌しながら約２時間熱く維持した。次いで、この懸濁液を６０００ｘｇで素早く遠心し、その上清を冷凍庫に約２時量大れた。次に、乳白光を発する白色溶液を０℃および６００ｘｇで遠心し、その沈澱を高真空下で乾燥した。この産物をＩＮ水酸化ナトリウム中に集め、室温で少なくとも１時間、この溶液と接触させた。最後に、この懸濁液のｐＨを約９の値とし、１０ｋｄの分子量排除を有する膜を用い、適切量の蒸留水に対して透析した。

適切量の塩化ナトリウムおよびアセトンを加え、５℃および６０００ｘｇで遠心し、次いで高真空下で乾燥した（最終産物）。この試料を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に取り、１２１℃で３０分間滅菌した（滅菌した最終産物）。

方法の評価先に説明したように、本発明方法の重要な側面は、望ましくない不純物を含まない、特に非通常ウィルスを含まないガングリオシド産物を提供することである。

この方法を評価するために、工程の種々段階の試料について不純物の可能性を試験した。

生物学的／臨床的試験の方法および結果を以下に示す。

スクラビーに対する生　的試験これらの実験に用いた動物はＧｏｌｄｅｎ　５ｙｒｉａｎハムスター（ＬＶＧ／Ｌａｋ）である。感染試験は、滅菌ＰＢＳで１０倍希釈した試料（０゜０５ｍ１）を大脳内（ｉ、ｃ、）接種しておいた４匹の乳離れさせた雌性動物の群で行った。この大脳内接種は、２６Ｇ、３／８インチの滅菌針を備えた使い捨てのガラス製注射器を用いて熟練職員が行った。

２０倍濃縮した滅菌最終産物をそのまま次のように用いた：・４．Ｑｍｌを４０匹の動物に大脳内注射；・ｌ：２０希釈した３、０＋１を未希釈のまま５０匹の動物に大脳内注射および２２匹の動物に腹腔内注射した：腹腔内注射の量は２゜５■ｌであった。

これら動物について、特徴的な神経学的および臨床的症状の始まりを１２ケ月間にわたり週２回またはそれ以上調べた。それぞれの動物の初期症状の始まりを記録し、動物を犠牲にし、疾患を十分に確かめた。これら動物の脳を半分に分け、一方は１０％ホルマリン中で固定し、他方は一７０℃で保存した。病理学的な診断は、疑わしい原因で死んだ動物および神経学的疾患の徴候を示した動物の全てにおいて行った。観察期間の終了時に全ての生存動物を犠牲にし、これらの脳について病理学的な評価を行った。

感染力価はＲｅｅｄおよびＭｕｎｃｈの方法に従って「最終終点」で計算し、ｌｏｇＬ　Ｄ、。７■ｌで表した。

試験した試料を以下に示すが、これらは図１に記した産物の名称を用いている。

出発物質である１６．７％（豐／Ｖ）ホモジネートに対して同次の力価／容量を確保するように計算して、以下に示す容量の滅菌ＰＢＳに全ての試料を再懸濁した：粉末化した脳　２．０■ｌ　脳ホモジネート、１６．７％（ｗ／ｖ）、未希釈粗原料１　５．４謡ｌ　未希釈粗原料２　９．７！１１　未希釈別の評価スクラピータンパク質ＰｒＰの測定は、ウシ由来のスクラピ−ＰｒＰと交差反応する、ネズミ脳由来の精製タンパク質類似体に対して特異的なポリクローナル抗体によって行った。ウェスタン・プロット法をこの測定に用いた。スクラビ−ＰｒＰの存在は、種々の分子量を有するタンパク質標準との比較によって評価した。

ＭＢＰタンパク質の測定は、ウシ大脳組織由来の精製タンパク質類似体に対して特異的なポリクローナル抗体によって行った。この測定に用いた方法はウェスタン・プロット法である。ＭＢＰの存在は、種々の分子量を有するタンパク質標準との比較によって評価した。

る処理段階で採取した試料についてドツト・プロット法により行った。試料が宵効であるとみなすためには、スポットが異種ＤＮＡの供託物中に存在しているべきではない。ラジオオートグラフィーで試験した試料中にスポットが存在しないことは、ウシゲノムＤＮＡが存在しないことを示すものである。

図２は、ガングリオシドの調製および精製工程のいくつかの中間段階から得た試料を抗Ｐ　ｒＰ　ｔｔ−ｓ。抗体による免疫化学的分析によって測定した結果を示すものである。分析した試料の数字による表示は、図１の精製工程図に示したカッコ内の数字に対応している。

レーン１：数字１の試料；レーン２：数字２の試料；レーン３：数字３の試料；レーン４：数字４の試料：レーン５：数字５の試料；レーン６：最終産物；レーン７：標準分子量のタンパク質（下方に向かって、そのｋｄは９７．４．６６．２．４５．０．３１．０．２１．５である）。

星印を付したバンドは、検定の増幅システムに起因する非特異的な交差反応を示すものである。

図３は、工程の種々の段階で採取した試料のドツト・プロット法によるウシゲノムＤＮＡの分析を示すものである。

数字と文字の交点は以下のことを示す。

標準曲線ＩＡ−７Ａ：ウシＤ　Ｎ　Ａ　（１ｎａｇ）　：ＩＢ−７Ｂ：ウシＤＮＡ（ｌｎｇ）；Ｉｃ−７Ｃ：ウシＤＮＡ（１００ｐｇ）　；ＩＤ−７Ｄ＋ウシＤＮＡ（１０ｐｇ）；１Ｅ−７Ｅ：ウシＤＮＡ（ＩＰｇ）；ＩＦ−７Ｆ：ウシＤＮＡ（Ｏｐｇ）。

被験試料２Ａ−２Ｆ　：数字ｌの試料：２Ｂ　二数字２の試料：２Ｃ：数字３の試料；２Ｄ　＝数字５の試料：２Ｅ　：数字６の試料；３Ａ　：粗製の３の試料：３Ｂ　＝最終産物：３Ｃ：滅菌最終産物。

標準曲線と分析試料の各点は二重に示されている。

図４は、調製および精製工程のいくつかの中間段階から得た試料の抗ＭＢＰ抗体による免疫化学的分析の結果を示すものである。試料の番号は、図１の精製工程図に示した数字に対応する。

レーン１　：数字１の試料：レーン２　：数字２の試料；レーン３　：数字３の試料：レーン４　：数字４の試料；レーン５　：数字５の試料（粗原料ｌ）；レーン６　：粗製の２の試料；レーン７　：数字６の試料；レーン８　：粗製の３の数字の試料；レーン９　：最終産物：レーン１０：滅菌最終産物。

使用したポリクローナル抗体によって認識される種々形態のＭＢＰをカッコ内に示す。

図５は、以下の試料（図１に示した工程に従う）のシリカゲル・クロマトグラフィーの結果を示すものである。

レーン１　：滅菌最終産物；レーン２　：最終産物；レーン３　：トリシアクガングリオシドＧＴ、ｂの標準；レーン４　：ジシアロガングリオシドＧＤ、ｂの標準：レーン５　：ジシアロガングリオシドＧＤ、、の標準；レーン６　：モノシアロガングリオシドＧＭ、（Ｄ標準。

図６は、本発明に従って調製したガングリオシド混合物の末梢神経に対する生物学的活性を示すための例示写真である（矢印は成長を示す）。

図７は、ガングリオシドの精製および調製工程のいくつかの中間段階から採取した試料の抗Ｐ　ｒＰ　！？−３゜抗体による免疫化学的分析の結果を示すものである。分析した試料の数字は、図１の精製工程図に示した数字に対応している。

レーン１　：　１．５ａｇ／ｍｌのＰ　ｒＰ　ｔｔ−ｓｏを加えた粗原料１の溶液：レーン２：粗原料２の試料：レーン３；数字６の試料；レーン４：粗原料３の試料；レーン５：最終産物；レーン６：滅菌最終産物。

実施例２感染した脳からの浄化されたホモジネートの調製２６３にスクラピー株に感染させた正味型ｊ１３．９ｇの４個のハムスター脳を蒸留水（１０ｍｌ）中でホモジナイズした。次いで、この容量を１５．５ｍｌにして２５％（Ｗ／Ｖ）のホモジネートを得た。この懸濁液を４℃および１８００ｘｇで４０分間遠心した。７．５ｍｌの上清を回収し、少量づつ分け、使用時まで一７０℃で維持した。

試料の調製感染ホモジネート（５ｍｌ）、メタノール／塩化メチレン（１２０■ｌ）および５．７Ｎ水酸化ナトリウム（０，７１ａ＋１）を、ウシ脳のアセトン粉末（１０ｇ）に加えた。この添加は、水性相の全体容量を溶媒一定に保つため、および最も適切な操作条件を得るために行った。出発溶液の最終力価は１％（ｖ／ｖ）であった。この懸濁液を３３℃の温度で３時間磁気撹拌した。次いで、この液を冷却し、１０℃および６０００ｘｇで２０分間遠心した。この液相をＧｏｏｃｈロート（孔サイズＮｏ、３）により４℃の温度で濾過して溶媒の蒸発を避けた。この段階の終了時に７８ｍ１の液相を回収した。この２ｉ１を生物学的検定用に取った。この両方に適切量の塩化カルシウムおよびアセトンを加え、室温で約３０分間磁気撹拌した後、この試料を１０℃および６０００ｘｇで１０分間遠心した。この沈澱物（粗原料１）をフード中で一晩乾燥し、次いで高真空下で２時間乾燥した。この一方を生物学的検定用に一７０℃で維持した。

反応容器から回収した粗原料１（９２５ａ＋ｇ）をクロロホルム／メタ再懸濁して１％（ｗ／ｖ）の力価を得た。５ＮＮａＯＨを加えてｐＨを約１２（リドマス紙で測定）に調節し、この混合物を４０℃で６時間磁気撹拌した。室温まで冷却した後、この溶液を６ＮＨＣ１で中和し、２５０μｌ量を生物学的検定用に取った。

この両方を適切量のｎ−ブタノール／クロロホルム／水で処理し、１５分間撹拌した後、これらを４時間放置した。最後に、下方の有機相を捨てた。残りの水性相に塩化ナトリウムおよびアセトンを加え、室温で約３０分間磁気撹拌した後、これらを１５℃および６０００ｘｇで１０分間遠心した（粗原料２）。

この産物を高真空下で乾燥し、その一部を生物学的検定用に取り、−７０℃で保存した。残りの物質を無水メタノール（６，５ａ＋１）に再懸濁し、５０℃で２時間放置し、時々撹拌した。この懸濁液を６０００ｘｇで素早（遠心し、その上清を一２０℃の冷凍庫中に２時量大れた。次いで、この冷却した白色の乳白光を発する溶液を０℃および６０００ｘｇで５分間遠心し、その沈澱を高真空下で乾燥した。

この時点での収量は産物６ａ＋ｇであった。次に、これを水酸化ナトリラム（５ｏＯμｍ）、蒸留水（４６０μｌ）およびホモシ＊−１−（４０μｌ）に再懸濁し、室温で１時間、この溶液と接触させた。最後に、この懸濁液のｐＨを約９（リドマス紙で測定）に調節し、１０ｋｄの分子量排除を有する膜を用いて２００００容量の蒸留水に対して４時間透析した。透析後の最終容量は９８０１１１であった。これをそれぞれ５００μｍおよび４８０μｌの２つの部分に分けた。

この第１の部分に必要量の塩化ナトリウムおよびアセトンを加え、５°Ｃおよび６０００ｘｇで１０分間遠心した。この試料を高真空下で乾燥した（最終産物）。

第２の部分にはホモジネート（２０μｍ）および１０ｘＰＢＳ（５０μｌ）を加え、これを１２１°Ｃで３０分間滅菌した（滅菌最終産物）。

方法の評価先の実施例１に記載したように、工程の種々段階がら採取した試料について不純物の存在の可能性を試験した。

被験試料および結果を以下に示す。

出発物質である１％（ｗ／ｖ）ホモジネートに対して同次の力価／容量を確保するように計算して、以下に示す容量の滅菌ＰＢＳに全ての試料を集めた：１％まで希釈した２５％（ｖ／ｖ）脳ホモジネート　未希釈の懸濁液粗原料１　３．２ｍｌ　未希釈粗原料２　１　、　Ｏｉｔ　未希釈最終産物　０．５＋ｅｌ　未希釈滅菌最終産物　０．５ｍｌ　未希釈以下の表２は生物学的検定によって得られた結果を示すものである。

表２　生物学的検定および臨床的評価（スパイク実験）希釈未希釈　４−２０４５０　０／４　４−２０４５６　Ｄ／３　４−２０４８２　２／３　４〜２０４６＋３　４／４１０”　４−２０４５１　０／４　４−２０４５７　０／３　４−２０４６３　０／３　４−２０４６９　４／４１０””　４−２０４５２　０／３　４−２０４５８　０／２　４−２０４６４　０／３　４−２０４７０　３／３ｔｏ−’　４−２０４５３　０／４　４−２０４５９　０／３４−２０４６５　０／３　４−２０４７１　０／２１０−’　４−２０４４４　４／４　４−２０４５４　０／３　４−２０４６０　０／３　４−２０４６６　０１０　４−２０４７２　０／R １０−’　４−２０４４５　４／４　４−２０４５５　０／１　４−２０４６１　０／３　４−２０４６７　０／３　４−２０４７３　０／R １０−”　４−２０４４６　２／３１０”　４−２０４４７　０１０１０−’　４−２０４４８　０／３１０”＠４−２０４４９　０／２スクラピーの臨床的徴候を示した全動物および１年間の監視期間の終了時になお生存していた全動物がこの試験に含まれている。事故および／または健康状態が劣るために排除された動物、ならびにスクラビーとは無関係の原因で死んだかまたは肉用に層殺された動物（この病気の臨床的徴候を全く示さなかった動物）は含まれていない。

「試料」の欄には、実験の開始時に注射を行った動物の数および檻の番号を示す。この番号が試料および希釈の相違を示す。「病気」の欄には、スクラピーの臨床的徴候を示した動物の数／注射を行った動物の数−スクラピーとは無関係の原因で死んだ動物の数を示す。

実施例３ガングリオシド混合物（上記方法に従って得た）が末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮ　Ｓ　）の異常を治療するための治療学的応用を予測させるいずれかの生物学的活性を保持しているが否かを確認するために、一連の実験をインビトロで行った。特に、神経芽腫細胞（Ｎ、Ａ）の培養物における軸索形成を調べるために、ガングリオシドの活性をインビトロで試験した。この細胞は、文献［Ｄｅｎｉｓ−Ｄｏｎｉｎｉら、Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｐａｒｔ　Ｉ＋、３２３．　３４８−　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９８０）；　Ｌｅｏｎら、　Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　ｃ！、１０８　（１９８２）コに記載されているように、ある種の条件においては成熟二ニーロンに特有の種々の機能の発現を誘導することができ、従って、発生の各段階に関係した生化学的パラメーターの定性および定量分析を可能にする。

即ち、このモデルで行った評価（軸索形成した細胞の割合、軸索の長さおよび相対的分枝度）は、神経系の機能回復におけるある薬物の治療学的応用の可能性を調べる際の有効な手段となる。

玉料互主旦方韮阻朧璧ＩＡｍｅｒｉｃａ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｙｐｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から供給されるマウスＣ１３００細胞、クローンＮ　ｔ　Ａを、Ｐ／Ｇ（１００Ｕペニシリン／＋ａｌ）および１０％ウシ胎児血清（ＳｅｒｏｍｅｄからのＦＣ８１バッチ４−Ｃ０４）を含むＤ　ｕｌｂｅｃｅｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）の存在下、ウェル（２４−容器）あたり１０，０００細胞の濃度でプレートした。

この翌日に、培養培地を同じ容量のガングリオシド含有の新鮮な培地に変えたく後記を参照）。この培養物を湿気を含む大気中、５％ＣＯ１および３７℃で維持した（）ｌａｅｒｕｓインキュベーター）。次に、この培養物を定めた時間（２４時間後）に２％グルタルアルデヒドで固定した。

生成物の試験溶液の調製ガングリオシド混合物（３つの異なるバッチ；Ｎｏ、１．２．３）をクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、窒素気流中で乾燥シ、所望の濃度に達するまでＤＭＥＭ＋Ｐ／Ｇ＋１０％ＦＣ５に再懸濁した。

試験した濃度は、Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍ％　５　ｘ　１０−６ＭおよびｌＸｌ０− ’Ｍである。

次のように４つの異なる試験を行った：・１ｘｌＯ−’Ｍの濃度でのガングリオシド混合物（バッチＮｏ、１ｔｄよび２）の効果を調べるための３つの実験；・試験下のガングリオシド混合物（バッチＮｏ、３）の異なる濃度（ＩＸＩＯ−’ 、５ｘｌＯ−’および１　ｘ　１０−’Ｍ）の用量一応答効果を調べるための１つの実験。

方迭ウェルから培地を除き、３５０μｍのＤＭＥＭ十Ｐ／Ｇ＋１０％ＦＣＳ士試験下の産物（上記の濃度）で置換した。

対照の培養物は、ガングリオシド混合物を加えることなく同じ方法で処理した。

次いで、この培養物を２４時間、インキ１ベーター内に保ち、次に２％グルタルアルデヒドで固定し、顕微鏡下で観察した。

パラメーター形態学的検査を行って以下について評価した：・軸索を有する細胞の割合（％）；・軸索の長さおよび相対的な分枝度。

殖里表３に示すように、試験下の産物がＮ、Ａ細胞において軸索の形成を誘導するのに有効（１ｘ　１０−’Ｍ）であることが明確である。ガングリオシド混合物の作用は用量依存性であり、１ｘｌＯ−’Ｍの用量のときに最大の効果を有する（表４）。

ＧＡ（１）　２９±６　２７±６　２４±５時間後に形態学的な評価を行った（カッコ内はバッチ番号を示す）。

ＧＡ（３）　１ｘｌｏ−’　３５±６ＧＡ（３）　５ｘｌＯ−’　・　１７±５インビトロでの生物学的活性のデータの統計学的な評価は、異なるバッチのガングリオシド混合物の間に有意の差が存在しないことを示す（表５）。

さらに、軸索の形態学的評価によって、ガングリオシド混合物で処理された細胞が長くかつ分枝度の高い軸索（即ち、顕著な分枝）を与えることが示される。

このように、上記の観察は試験下のガングリオシド混合物が生物学的活性を有することを確かめるものであり、実際に、ガングリオシドの特定の性質を保証する方法によって得られた生成物はＮｔＡ細胞において軸索の形成を誘導することができる。この事実は、この生成物が末梢および中枢神経系の修復現象において有効であることを示すものである。また、危険の可能性がある非通常ウィルスに関係した不純物を含まない本明細書記載のようにして得たガングリオシド混合物を、モノシアロガングリオシドＧＭ、などの個々の成分またはガングリオシド混合物の製造用に用いることもできる。

上記の薬理学的性質に鑑みて、ガングリオシド混合物を末梢および中枢の両神経系における多数の病変（種々の発生原因を有する）の薬物として広く用いることができる。治療することができる具体的な症状は、球後視神経炎、動眼神経の麻痺、三叉神経痛、顔面神経の麻痺およびベル麻痺、ガルシン症候群、神経根炎、末梢神経の外傷性損傷、糖尿性およびアルコール性多発神経炎、分娩麻痺、麻痺性座骨神経痛、運動ニューロン障害、筋萎縮側索硬化、を髄障害性筋萎縮、進行性球麻痺、重症筋無力症およびランバート−イートン症候群、筋ジストロフィー、ＣＮＳおよびＰＮＳにおけるシナプス神経伝達の障害、意識欠損、例えば錯乱、振とう、血栓、大脳塞栓、大脳およびを髄外傷である。

通常の投与は、注射、筋肉内、皮下もしくは静脈内によるか、または経皮、肺もしくは経口経路によるが、適切に緩衝化された水溶液中であるのが好ましい。以下に挙げる医薬調製物の例に示したように、産物の溶液を含むバイアルの形態で、所望により他の補助成分と共に医薬調製物を製造することによって、その信頼性ある保存を確保することができる。上記の非経口経路による治療学的適用または予防適用のためには、その用量は１０〜］、　ＯＯｍｇ／日の活性物質であるのが好ましい。

以下に本発明に従って調製した医薬組成物の例を挙げるが、これらは説明のためのみのものであって、限定のためのものではない。

製剤例１１個のバイアルは以下の成分を含有している：活性成分・ガングリオシドのナトリウム塩　１０．０ｍｇ・モノシアロチトラへキソシルガングリオシド（ＧＭ、）・ジンアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＤ、、）・ジンアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＤ、ｂ）・トリジアロテトラへキソシルガングリオシド（ＧＴ、ｂ）他の成分・リン酸水素二ナトリウム１２　Ｈｔｏ　６　、０　ｍｇ・リン酸二水素ナトリウム２Ｈ＊ＯＯ，５ａ＋ｇ・塩化ナトリウム　１６．０＋ｇ・注射用水　２．０ｍｌまで製剤例２１個のバイアルは以下の成分を含有している：活性成分・ガングリオシドのナトリウム塩　２０．０＋ｎｇ・モノシアロチトラへキソシルガングリオシド（ＧＭ、）・ジンアロテトラへキソシルガングリオンド（ＣＤＩ−）・ジンアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＤ、ｂ）・トリジアロテトラへキソシルガングリオンド（ＧＴｌｂ）他の成分・リン酸水素二ナトリウム１２Ｈ，０６，Ｏｍｇ・リン酸二水素ナトリウム２Ｈ２Ｏ０，５ｏ＋ｇ・塩化ナトリウム　１６・Ｏｍｇ・注射用水　２．０ｍｌまで製剤例３１個のバイアルは以下の成分を含有している：盾箪戊分・ガングリオシドのナトリウム塩　１００．０ｍｇ・モノシアロチトラへキソシルガングリオシド（ＧＭ、）・ジシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＤ、、）・ジシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＤ、ｂ）・トリジアロテトラへキソシルガングリオシド（ＧＴゆ）他Ω成匁・リン酸水素二ナトリウム１２Ｈ＊０　１２．Ｏｍｇ・リン酸二水素ナトリウム２Ｈ，０１，Ｏｍｇ・塩化ナトリウム　３２．０ｍｇ・注射用水　４．０ｍｌまで以上に本発明を説明したが、これが多（の態様で変化しうろことは明らかであろう。このような変法は本発明の思想および範囲から逸脱するものとみなすべきではなく、当業者に明らかなこれら変法の全ては以下の請求の範囲内に含まれているものとする。

Ｆ　Ｉ　Ｇ、　１ＦＩＧ、２ＢＣＤＥＦＦＩＧ、３ＦＩＧ、６ＦＩＧ、７閑１ｌｉＩ謹審磐失 □−４−−−醜ＰＣｒ／ＥＰ　９０１０１％０１、．１１１．＾―−ｍ　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１９６０−惰−ｍｍ−−−＋−昧　ＰＣＴ／ＥＰ９０１０１９６０国際調査報告ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１９６０Ｓ＾　４１ｇ０７

Claims

【特許請求の範囲】

１．ガンダリオシド混合物の製造方法であって、ａ）ガングリオシドを含有する組織をアセトンによる脂質除去にかけてアセトン沈澱物を得；ｂ）該アセトン沈澱物を、親水性物質から疎水性物質を分配することができる第１の溶媒混合物中に懸濁させ；ｃ）該分配混合物を濾過して第１の液相を得；ｄ）該第１の液相を沈澱させて第１の粗原料を得；ｅ）該第１の粗原料を可溶化し、この可溶化した第１の粗原料をｐＨ約１２で加熱し：ｆ）該加熱して可溶化した第１の粗原料を、親水性物質から疎水性物質を分配することができる第２の溶媒混合物中で第２の分配にかけ；ｇ）該第２の分配混合物を分隣して有機相を除去し、そして水性相を残し；ｈ）該水性相を沈澱させて第２の粗原料を得；ｉ）該第２の粗原料を可溶化し、これを冷却して第３の粗原料を得；ｊ）該第３の粗原料を塩基中で可溶化し；ｋ）該可溶化した第３の粗原料を中和し；そして１）該可溶化して中和した第３の粗原料を約１０ｋｄの分子量排除の膜で透析してガンダリオシド混合物を得る；ことを特徴とする方法。
２．第１の溶媒混合物が塩化メチレン、メタノールおよび水酸化ナトリウムの混合物である請求項１に記載の方法。
３．アセトン沈澱物を含む第１の溶媒混合物が約３０〜３５℃で少なくとも約３時間加熱される請求項１または２に記載の方法。
４．第１の粗原料の沈澱が塩化カルシウムおよびアセトンの添加によって行われる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．第１の粗原料の加熱が約３８〜４３℃で約４〜８時間行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．第１の粗原料が水、クロロホルムおよびメタノールの混合物中で可溶化され、加熱後に、水、クロロホルムおよびｎ−ブタノールの混合物からなる第２の溶媒混合物が添加される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．第２の粗原料の沈澱がアセトンおよび塩化ナトリウムの添加によって行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
８．第２の粗原料の可溶化がメタノール中においてである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
９．第３の粗原料の可溶化が１Ｎ水酸化ナトリウム中においてである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．ガンダリオシドを含有する組織がウシ脳組織である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．得られたガンダリオシド混合物を乾燥してガンダリオシド混合物の最終産物を得る請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．ガンダリオシド混合物の最終産物を緩衝液に懸濁させ、滅菌してガンダリオシド混合物の滅菌最終産物を得る請求項１１に記載の方法。
１３．ガンダリオシド混合物の製造方法であって、ａ）ウシ脳組織をアセトンによる脂質除去にかけてアセトン沈澱物を得；ｂ）該アセトン沈澱物を、メチレン、メタノールおよび水酸化ナトリウムからなる第１の溶媒混合物中に懸濁させ；ｃ）該アセトン沈澱物を含む該第１の溶媒混合物を濾過して第１の液相を得：ｄ）該第１の液相を塩化カルシウムの添加によって沈澱させて第１の粗原料を得；ｅ）該第１の粗原料を水、クロロホルムおよびメタノール中で可溶化し、この可溶化した第１の粗原料をｐＨ約１２および約３８〜４３℃の温度で少なくとも約４〜８時間加熱し；ｆ）該加熱して可溶化した第１の粗原料を、水、ｎ−ブタノールおよびクロロホルムの混合物中で第２の分配にかけ；ｇ）該第２の分配混合物を分離して有機相を除去し、そして水性相を残し；ｈ）該水性相をアセトンと塩化ナトリウムの添加および遠心によって沈澱させて第２の粗原料を得；ｉ）該第２の粗原料をメタノール中で可溶化し、加熱し；ｊ）該可溶化して加熱した第２の粗原料を遠心して上清を得；ｋ）該上清を冷却して第３の粗原料を得；１）該第３の粗原料を水酸化ナトリウム中で約１時間可溶化し；ｍ）該可溶化した第３の粗原料を中和し；そしてｎ）該可溶化して中和した第３の粗原料を約１０ｋｄの分子量排除の膜で透析してガンダリオシド混合物を得る；ことを特徴とする方法。
１４．第３の粗原料の可溶化が１Ｎ水酸化ナトリウム中においてである請求項１３に記載の方法。
１５．ガンダリオシドを含有する組織がウシ脳組織である請求項１３または１４に記載の方法。
１６．得られたガンダリオシド混合物を乾燥してガンダリオシド混合物の最終産物を得る請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．ガンダリオシド混合物の最終産物を緩衝液に懸濁させ、滅菌してガンダリオシド混合物の滅菌最終産物を得る請求項１６に記載の方法。
１８．請求項１〜１２のいずれかに従って製造したガンダリオシド混合物。
１９．ガンダリオシドＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂの混合物からなる請求項１〜１２のいずれかに従って製造したガンダリオシド混合物。
２０．約１８〜２４％のＧＭ１、３６〜４４％のＧＤ１ａ、１２〜１８％のＧＤ１ｂおよび１６〜２２％のＧＴ１ｂらなる請求項１９に記載のガンダリオシド混合物。
２１．ガングリオシド混合物を個々のガンダリオシド成分に分離することをさらに包含する請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
２２．ガンダリオシド混合物からガンダリオシドＧＭ１を分離する請求項２１に記載の方法。
２３．請求項２２に従って製造されたガンダリオシドＧＭ１を含有する調製物。
２４．活性成分として請求項１８〜２０および２３のいずれかに記載のガンダリオシド産物の有効量を、薬学的に許容しうる担体または希釈剤と共に含有することを特徴とする、末梢および中枢神経系の障害を治療するための医薬組成物。
２５．末梢および中枢神経系の障害を治療する際の請求項１８〜２０および２３のいずれかに記載のガンダリオシド産物の使用。