NO175311B - Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus - Google Patents
Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virusInfo
- Publication number
- NO175311B NO175311B NO912780A NO912780A NO175311B NO 175311 B NO175311 B NO 175311B NO 912780 A NO912780 A NO 912780A NO 912780 A NO912780 A NO 912780A NO 175311 B NO175311 B NO 175311B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- raw material
- mixture
- subjecting
- ganglioside
- acetone
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 53
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 16
- 238000011109 contamination Methods 0.000 title description 2
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 title description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims description 54
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 42
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 28
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 25
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 6
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 18
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 14
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 13
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 5
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 5
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 5
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 5
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 4
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 208000006373 Bell palsy Diseases 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 3
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037187 Autoimmune Experimental Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 108010007288 PrPSc Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical group ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036826 VIIth nerve paralysis Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001712 encephalitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000003130 Alcoholic Neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 206010006542 Bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010008088 Cerebral artery embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010254 Concussion Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101001121580 Enterobacteria phage PRD1 Adsorption protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 201000010743 Lambert-Eaton myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028424 Myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000009032 Obstetric Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 101001125164 Parietaria judaica Probable non-specific lipid-transfer protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108700021402 PrP 27-30 Proteins 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 101000580771 Pseudomonas phage phi6 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010037779 Radiculopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 208000008765 Sciatica Diseases 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010067722 Toxic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 231100000126 Toxic neuropathy Toxicity 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 1
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 1
- KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCO KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000017580 chronic wasting disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000256 facial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000003502 gasoline Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 201000010849 intracranial embolism Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000003818 metabolic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 231100000112 neuronotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003168 neuronotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002589 oculomotor nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 201000002241 progressive bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 206010061928 radiculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- UBOXGVDOUJQMTN-UHFFFAOYSA-N trichloroethylene Natural products ClCC(Cl)Cl UBOXGVDOUJQMTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av en spesifikk blanding av gangliosider, og produktet fremstilt ved en slik fremgangsmåte, oppnådd ved en fremgangsmåte som selektivt eliminerer kontaminanter assosiert med ikke-konvensjonelle, livstruende virus, uten å forandre de biologiske og farmakologiske egenskaper til blandingen med hensyn på dens virkning på det sentrale og perifere nervesystem.
Gangliosider, glykosfingolipider som inneholder sialinsyre er alle normale bestanddeler av alle cellemebraner i pattedyr og er hyppig forekommende i nervevevet (Ando S.: Neurochem. Int. 5:507, 1983). Fire gangliosider, GM^, GDla, GD^ og GT^
(nomenklatur i henhold til Svennerholm L., J. Neurochem, 10:613, 1963), utgjør 80-90% av det totale gangliosidinnhold i pattedyrhjernen. Gangliosider er spesifikt lokalisert i de ytre lag av plasmamembranen, hvilket antyder at de spiller en viktig rolle i mange biologiske virkningsmekanismer, f.eks. som en "sensor" og/eller reseptor for forskjellige molekyler, og i overforing av informasjon gjennom cellemembraner (Fishman et al.: Science 194:906, 1976). De spiller derfor en nøkkelrolle i reguleringen av neuronal utvikling og vedlikehold i det sentrale og perifere nervesystem.
Det er virkelig fyldig dokumentasjon på at gangliosider er istand til å influere gunstig funksjonell restitusjon etter en lesjon i det perifere nervesystem (PNS) og sentrale nervesystem CNS), ved engasjement av spesifikke membranmekanismer, og ved gjensidig påvirkning med neurotrofe faktorer, som vist i in vitro studier på nevronkulturef (Doherty P. et al., J. Neurochem. 44:1259, 1985; Skaper S. et al., Molecular Neurobiology,3:173, 1989).
Spesielt er det blitt rapportert at foreskriving av gangliosider in vivo fremmer nerveregenerasjon og funksjonell regenerasjon i PNS under patologiske forhold: Positive virkninger er blitt beskrevet i modeller på traumatiske neuropatier (Ceccarelli B. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 71:275, Plenum Press, New York, 1976; Gorio A. et al., Brain Res. 7:236, 1980; Gario A. et al., Neuroscience 8:417, 1983), metabolske neuropatier (Norido F. et al., Exp. Neurol. 83:221, 1984) og toksiske neuropatier (Di Gregorio F. et al., Cancer Chemoter., Pharmacol. 26:31, 1990).
Med hensyn på CNS er positive virkninger i utstrakt grad blitt rapportert, såsom restitusjon indusert ved monosialogangliosid GMii modeller på ischemi (Cuello A.C. et al., Brain Res. 376:373, 1986; Karpiak S.E. et al., CRC Critical Rev. in Neurobiology, Vol. 5, Issue 3, 1990), traumatiske lesjoner (Toffano G. et al., Brain Res. 296:233, 1984) og neurono-toksiske lesjoner (Johnson J., Dev. Brain Res., 16:171, 1984) i forskjellige neuronale systemer hos forskjellige dyrearter. Det er nylig blitt oppdaget at gangliosider kan inhibiere trans-lokasjon og aktivering av proteinkinase C, indusert ved glutamat (Vaccarino F. et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 84:8707, 1987). Denne virkning er meget viktig i lidelser med ischemisk skade, hvor det er blitt rapportert at eksitatoriske aminosyrer, såsom glutamat, spiller en avgjørende rolle idet de igangsetter en kaskade av hendelser som fører til neurondød. Denne mekanisme kunne begunstige overlevelse av neuroner i området rundt lesjonen, hindre retrograd regenerasjon og akselerere den helende vekstrespons på lokale trofiske faktorer.
Resultatene fra eksperimentell forskning er i stor grad blitt konfirmert av resultater fra klinisk anvendelse av gangliosider. I mer enn ti år har gangliosider blitt anvendt som terapeutisk middel ved nesten alle former for perifer neuro-pati, fra de som er resultat av mekanisk skade til de forårsaket av toksiske faktorer eller defekter, fra infeksiøse og inflammatoriske lidelser til metabolske dysfunksjoner. Disse legemidler har vist seg å være like effektive i mono- og polyneuropatier, i sensorisk-motoriske lidelser og i patologiske tilstander som påvirker det autonome nervesystem, såsom i mange neuropatier som påvirker hjernenervene, f.eks. Bells paralyse, trigeminal neuralgi og neuralgi forårsaket av herpes zoster. Gangliosider, og spesielt monosialogangliosidet, kan i utstrakt grad anvendes på alle patologiske tilstander som er forbundet med akutte vaskulære og traumatiske lesjoner i CNS og ved sekvele av slike patologiske tilstander (cerebral ischemi, kraniale og spinale traumer).
Deres beviste helende virkning i CNS understøtter også deres anvendelse ved kroniske neurodegenerative patologiske tilstander, såsom Parkinsons sykdom og Alzheimers sykdom. Det faktum at de er "endocider" (endogene legemidler) av natur, idet de er naturlige komponenter av nervemembraner, forklarer at de tolereres i utmerket grad og fraværet, selv ved forlenget behandling med høye doser, av bivirkninger som er så hyppige i noen konvensjonelle behandlingsmåter for perifere neuropatier.
Generelt viser egnede gangliosidblandinger, f.eks. en formule-ring av følgende type: GM^fra 18% til 24%, GDlafra 3 6% til 44%, GDlbfra 12% til 18%, G<T>lbfra 16% til 22%, eller de enkelte gangliosidfraksjoner, spesielt monosialogangliosidet GM^, biologiske virkninger, såsom de beskrevet. Disse gangliosider, som egnede blandinger eller enkle fraksjoner, spesielt monosialogangliosid GM-^, ekstraheres fra pattedyrhjerner og det er derfor nødvendig gitt deres spesielle biologiske funksjon og deres terapeutiske anvendelse tidligere beskrevet med hensyn på det perifere og sentrale nervesystem, å benytte rensefrem-gangsmåter som garanterer et endelig produkt som er absolutt rent og fritt for biologiske og kjemiske kontaminanter.
Det har lenge vært kjent at det er mulig å ekstrahere, på forskningsnivå, blandinger av gangliosider (Tettamanti et al., Biochim. e Biophys. Acta, 296:160, 1973; Trams et al., Biochim. e Biophys. Acta, 60:350, 1962; Bogoch et al., British J. Pharm., 18:625, 1962; Wiegandt et al., Angew Chem. 80:89, 1968; US patent nr. 3 436 413; og CA. 61, 9851C, 9895d) , men ingen av de ovennevnte fremgangsmåter ble utviklet med henblikk på å utvise eliminasjon og destruksjon av komponenter assosiert med ikke-konvensjonelle virus. En årsak til dette er at på den tiden var ikke slike sykdommer kjent i de pattedyrarter hvis hjerner ble benyttet til ekstraksjon. En annen årsak er at ingen reagens var tilgjengelig for den spesifikke identifikasjon av mulig farlige komponenter, mens idag har slike reagenser blitt gjort tilgjengelige, ved spesifikke fremgangsmåter utviklet på basis av nylig oppnådd kunnskap, hentet fra den vitenskapelige utvikling av molekylbiologi-teknikologi.
Noen ganger kan patologiske situasjoner oppstå hvor de patogene agens ikke kan identifiseres. En slik patologisk situasjon er kalt bovin spongiform encefalopati (BSE), først rapportert i England i 1986 (Wells G. et al., Vet. Record, 419, 1986). Dette navnet er avledet fra det svampaktige utseende til hjernevev fra affiserte dyr. Når snitt av vevet analyseres i mikroskop, sees det at hovedlesjonene omfatter utstrakte neuronale vakuoler.
Alt tilgjengelige bevismateriale peker på det faktum at BSE tilhører en gruppe av degenerative encefalopatier i sentral-nervesystemet, som uten unntak er dødelig og forårsakes av en gruppe av ikke-konvensjonelle, infeksiøse agens (Fraser et al., Vet. Record 123:472, 1988; Hope et al., Nature 336:390, 1988) . Denne gruppe inkluderer også skrapesyken (scrapie) hos sau og geiter, den kroniske avmagrende sykdom som påvirker fangede hjortedyr, infeksiøs encefalopati hos mink i mink-farmer, og to humane sykdommer; kuru og Creutzfeldt-Jacobs sykdom. De histopatologiske lesjoner forårsaket i hjernen, av disse sykdommer, er like i alle tilfelle og er sammenlignbare med de forårsaket av BSE. Mange teorier er blitt fremmet angående naturen til disse etiologiske agens, som hverken er bakterier eller virus, er ulike alle andre kjente organismer og er derfor kjent som ukonvensjonelle virus. Med bakgrunn i deres lange inkubasjonsperiode, regnet fra infeksjonsøyeblikket til utbrudd av symptomer, kalles disse virus også "sene virus"
("slow viruses").
Etter de få tilfeller observert i 1986 har sykdommen spredd seg og har nådd epidemiske størrelser i Storbritannia, idet den affiserer rundt 14 000 kveg, og øker stadig med tilnærmet 250-300 tilfelle hver uke. Det infiserte kveg viser ingen tegn til sykdommen på mange år (inkubasjonsperioden er 4-5 år), men når symptomene har kommet til syne svekkes dyrene raskt og dør.
En epidemiologisk undersøkelse av "Central Veterinary Laboratory, British Ministry of Agriculture" (Wilesmith et al., Vet. Record. 123:638, 1988) viste at infeksjonskilden var dyrefor som var tilberedt med behandlede skrotter av andre drøvtyggere, og solgt i form av pulverisert kjøtt eller ben. Siden encefalopati kan overføres til et stort område av dyrearter, synes det rimelig å anta at BSE er resultatet av infeksjon av det etiologiske agens ansvarlig for skrapesyke, overført fra sau ved hjelp av disse kontaminerte næringsmidler (Morgan KL, Vet. Record 122:445, 1988).
På basis av resultater fra denne undersøkelse forbød den britiske regjering, ved en forordning som ble satt i kraft 18. juli 1988, salg og tilførsel av dyrefor som inneholder dyreproteiner avledet fra drøvtyggere.
Den generelle oppfatning er at mange faktorer har sammen bidratt til den plutselige tilsynekomst av BSE i Storbritannia (Cherfas J. , Science, Feb. 1990, 523).
Først økte antallet av sau i Storbritannia hurtig sent i 70-årene og tidlig i 80-årene, og med dette insidensen av skrapesyke som har vært en endemisk sykdom hos sau i Europa i over 250 år (Pattison et al., Vet. Record 90:465, 1972). Samtidig, i kjølvannet av oljekrisen, forandret fabrikkene som produserte dyrefor, sine fremgangsmåter for behandling av skrotter til et lavere-temperatur system, som muligens var mindre effektivt til å ødelegge det meget motstandsdyktige skrapesykeagens. Alle unntagen én av produsentene av disse næringsmidler gikk bort fra anvendelse av oppløsningsmidler, såsom benzen, heksan og trikloretylen til å fjerne overskudds-fett fra soyabønner og benmel. Kanskje mest viktig i det hele var at det avsluttende trinn, hvor produktene ble opphetet for å fjerne oppløsningsmidlene, ble utelatt: Dette trinn krevet virkelig meget høye temperaturer.
Videre ble oppdretterne, ifølge regjeringens politikk, oppmuntret til å produsere mer melk og avvenne kalvene tidlig ved å gi dem proteinrikt for. Dette var ofte av dårlig kvalitet siden mel laget fra kjøtt og ben var billigere enn produkter laget med soyabønne og fisk, som er bedre proteinkilder. Undersøkelser for å forstå hvordan sykdommen overføres er fundamentalt for BSE-forskning. Det viktigste aspekt ved disse eksperimenter er at, ved å identifisere begrensningene av barrierene mellom artene, med hensyn på overføring av det patogene agens, er det mulig å vurdere risikoen for BSE-infeksjon hos enhver art. Fraser et al. (Vet. Record, 123:472,1988) viste at sykdommen kunne overføres fra kveg til mus. De inokkulerte ekstrakter av hjernen til kveg, som hadde dødd av BSE, inn i hjernene til mus, som deretter utviklet sykdommen. Senere overførte Barlow et al. (Vet. Record, 3. feb. 1990) sykdommen til mus ved å fore dem med infiserte hjerner. Dette var det første bevis på at BSE kunne pådras ved å spise infisert materiale. Intet annet vev fra affiserte dyr (milt, ryggmarg, lymfevev, melk, etc.) var istand til å fremskaffe sykdommen hos mus.
Det er indikasjoner på at skrapesyke kan overføres til lam av deres mødre, men så langt finnes intet opplysende bevismateriale på mulig vertikal eller horisontal overføring av det etiologiske agens til BSE hos kveg.
Agens som forårsaker subakutte infeksiøse encefalopatier er ekstremt motstandsdyktige overfor standard dekontaminerings-prosesser. Tilgjengelig data vedrørende dette aspekt stammer hovedsakelig fra studier av agens som frembringer skrapesyke og Creutzfeldt-Jacobs sykdom. Det etiologiske agens for skrapesyke er meget motstandsdyktig mot temperaturforandring. Deres evne til å forårsake infeksjoner er bare lett redusert ved eksponering til temperaturer opptil 80°C; høyere temperaturer reduserer imidlertid infeksjonsevnen markert (Hunter et al., J. Gen. Microbiol. 37:251, 1964). En liten mengde av infeksiøs "virus" persisterer noen ganger når suspensjoner med infisert materiale varmes opp til 100°C i 1 time eller til 118°C i 10 minutter.
Nylig ble det følt et behov for å fornye steriliserings-standardene for disse infeksiøse agentia under høyt damptrykk i autoklaver. De gjeldende standarder i USA, som gjelder autoklavering for dekontaminering med hensyn på Creutzfeldt-Jacobs sykdom, omfatter behandling ved 132°C i 1 time (Rosenberg et al., Annals of Neurology 19:75, 1986), og er basert på studier utført på hjernehomogenater som inneholder skrapesyke eller Creutzfeldt-Jacobs agentia (Brown et al., J. of Infectious Diseases 153:1145, 1986). I Storbritannia omfatter den gjeldende standard for autoklavering for dekontaminering av Creutzfeldt-Jacobs sykdom behandling i en autoklav ved 134-138°C i 18 minutter, basert på noen studier, inkludert en ved Kimberlin (Kimberlin et al., Journal of Neurological Sciences 59:355, 1983). Uheldigvis er det bovine spongiforme encefalopati-agens meget motstandsdyktig, til og med mot vanlig kjemisk behandling, såvel som fysikalsk. Oppløsningsmidler, såsom benzen, heksan, bensin og trikloretylen er blitt benyttet som ekstraksjonsoppløsningsmidler, men lite er kjent vedrørende deres virkning på infeksiøsiteten. Bare en liten datamengde er tilgjengelig på kjemisk inaktivering av infeksiøse agens, hovedsakelig fordi undersøkelser krever store antall dyr og lange observasjonsperioder. Konsentrasjoner på 0,3-2,5% natriumhypokloritt reduserte betydelig infeksiøsitet i det anvendte biologiske analysesystem, men eliminerte den ikke fullstendig (Walker et al., Am. J. Publ. Health 73:661, 1983). Data som angår behandling med opptil 0,25 N natriumhydroksid er meget variable; ved konsentrasjoner på over 1 N synes denne forbindelse imidlertid å være det mest effektive kjemiske middel av alle de som er undersøkt. Behandling med 6M-8M urea ble også rapportert å være meget variabelt.
Resultatene fra disse undersøkelser vedrørende dekontaminering viser således at, skjønt mesteparten av infeksiøsiteten blir hurtig ødelagt av mange av de forskjellige fysikalske og kjemiske fremgangsmåtene, eksistensen av små subpopulasjoner av motstandsdyktig infeksiøse agens, gjør sterilisering av kontaminert materiale meget vanskelig i praksis.
Da BSE var blitt identifisert som en "skrapesyke-lignende" sykdom, begynte viktige spørsmål å stilles på epidemiologiske og analytiske nivåer, de siste ble spesielt rettet mot identifisering av agens assosiert med infeksiøsitet. Alle anstrengelser foretatt så langt for å identifisere nukleinsyrer assosiert med det etiologiske agens har imidlertid vært ufruktbare. Den eneste komponent som er isolert, og som er assosiert utvetydig med den infeksiøse virkning, er et sialoglykoprotein som er kalt "scrapie prion protein" (Prp<Sc>).
Påfølgende genetiske undersøkelser, utført på dette protein, tilveiebragte overraskende informasjon. Noen DNA-søkere, syntetisert i henhold til N-terminalsekvensen til proteinet, har gjort det mulig å påvise nærvær av et kromosomalt gen i individuelt kopi, som utviser det samme restriksjonsmønster, både i hjernene på friske dyr og i hjernene på infiserte dyr. Dette gen, som er observert til og med i meget forskjellige arter, koder et protein kalt cellulært prion protein (PrP<c>), med en tilsynelatende molekylvekt på 33-35,0 kilodalton (kd), som viser spesielt klart forskjeller med hensyn på PrP<Sc>: 1) PrP<c>er påvirkelig av protease, mens<p>rP<Sc>er motstandsdyktig. Spesielt, mens PrP<c>degraderes fullstendig av enzymet proteinase K, hydrolyseres PrP<Sc>på nivået til N-terminalen for et fragment på tilnærmet 5 kd, og gir opphav til et protein som er kalt PrP27_3o«Denne form renses sammen med infeksiøsitet og er den mest forekommende komponent som er oppnådd i preparater med infeksiøst materiale.2) Både PrP<c>og PrP<Sc>er membranproteiner, men mens den første oppløses ved behandling med rensemidler, har den andre tendens til å polymerisere til amyloide fibrøse strukturer. Lignende strukturer (scrapiesyke-assosierte fibriller, SAF) er funnet i infiserte hjerner og er spesielle ved denne infek-sjonstype. Dette infeksiøse proteins motstand mot inaktivering er uvanlig: det er følsomt, f.eks. for behandlinger med konsentrerte alkaliske oppløsninger eller for eksponering til temperaturer over 120°C og kombinasjon av begge, eller kombinasjoner med forskjellig denaturerende midler. Følgelig er de eneste diagnostiske fremgangsmåter, tilgjengelige for entydig identifikasjon av disse spongiforme encefalopatiene, verifisering av nærvær av SAF i det infiserte cerebrale vev, ekstraksjon og immunokjemisk identifisering av proteinet Pr<P>27_3Q»fremgangsmåter som bare er anvendelig ved patologisk anatomi.
SAF er blitt identifisert i infiserte bovine hjerner, hvor homologen av<p>rP<Sc>ble isolert og viste reaktivitet med et serum oppnådd mot muse-SAF. Videre viste N-terminalsekvensen til de første 12 aminosyrer 100% homologi med PrP<Sc>hos sau, og en forskjell fra den hos mus, hamster og menneske ved et enkelt innskudd av glycin. Så snart det var slått fast at BSE er en "scrapie-liknende" sykdom, reiste det seg viktige spørsmål på epidemiologisk og analytisk nivå, i det siste tilfelle spesielt rettet mot identifisering av proteinet assosierbart med infeksiøsitet.
Den uventede tilstedeværelse av BSE og alle de aspekter som enda må forklares vedrørende disse nevrologiske lidelser, har forårsaket at problemet er gitt den nødvendige oppmerksomhet, spesielt av dem som er knyttet til fremstilling av produkter avledet fra bovint materiale.
Det kan faktisk ikke være tilstrekkelig å benytte råmaterialer som er sertifisert for næringsmiddelanvendelse, til å oppnå forbindelser eller blandinger av farmasøytisk interesse. Følgelig er det nødvendig å utvikle en produksjonsprosess for angjeldende produkter ved å anvende ekstraksjonsmetoder som garanterer eliminasjon av proteinet som er assosiert med infeksiøsitet og infeksiøsiteten i seg selv. Det er klart at fremgangsmåten for ekstraksjon av den infeksiøst aktive fraksjon samtidig skal bevare den biologiske virkning av de aktive prinsipp som er ønskelig som endeprodukt.
Det andre protein som er potensielt farlig for mennesker på dette preparatnivå, er de myeline basisproteiner (MBP).
Det er et protein, som hos mennesker og de fleste vertebrater, har en molekylvekt (MW) på tilnærmet 19,5 kd. Det forefinnes i tre molekylære former i humant myelin og i seks former i musemyelin, det er kodet av et enkelt gen lokalisert på kromosom 18, og det omfatter tilnærmet 30% av det totale myeline protein. Dets nøyaktige topografiske lokalisering er enda ikke sikker. Det er bare blitt observert i cytoplasma i oligodendrocytter på myeliniseringstidspunktet. Et protein som er betraktet som identisk, er tilstede i det perifere nervesystem (protein Pl), og perifert myelins evne til å induse eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) hos laboratorie-dyr skyldes dette.
Ikke hele MPB-molekylet er encefalitogent, men bare en del som varierer fra art til art: hos kanin er den encefalitogene del et aminosyrefragment 64-73, i Lewis-rotten 71-85, i marsvin 113-121, i SJL/J-mus 89-169. EAE er en typisk celleavhengig autoimmunsykdom: den er i virkeligheten overførbar fra ett dyr til et annet ved infusjon av sensitiviserte T-lymfocytter og ikke ved infusjon av serum. I dette tilfelle understøttes sykdommen av transfuserte lymfocytter og ikke av de fra resipienten. En annen celleavhengig autoimmunsykdom er allergisk eksperimentell nevritt (EAN). Også den kan induseres i alle arter av høyere vertebrater ved inokulering av råhomo-genat av perifert myelin i fullstendig Freunds adjuvans. Det er ment at antigenet som hovedsakelig er ansvarlig for denne au to immun i ser ing, er protein P2, med en MW på 12,0 kd, som er til stede i det perifere nervesystem.
En annen kontaminant som må tas i betraktning i disse preparater, er bovint genomisk DNA. Muligheten til å være i stand til å fremstille, ved rekombinant DNA-teknologi, biologisk aktive proteiner som kan anvendes som farmasøytiske midler, har nødvendiggjort analyse av endeproduktene med hensyn på nærvær av DNA-rester, som hører til cellen hvor det ønskede protein er uttrykt. Nærvær av DNA-fragmenter i farmasøytiske preparater som skal benyttes av mennesker reiser problemet med faren for en inkorporasjon av disse fragmenter i genomet, med en mulig ukontrollert overføring av genetisk informasjon. Selv om det enda ikke er mulig å oppnå gangliosider ved rekombinant DNA-teknologi, er det nødvendig å anvende denne type analyse-kontrollteknologi på ekstraksjonsprodukter som bruker råmaterialer av dyrisk opprinnelse.
Til slutt burde gangliosider, som skal anvendes in vitro- og in vivo-undersøkelser, være fri for andre forbindelser, såsom asialogangliosider og glykocerebrosider. Disse stoffer kan ha viktige immunologiske implikasjoner hvis de er til stede i høye konsentrasjoner, og kan også føre til gale eksperimentelle konklusj oner.
Den plutselige opptreden av BSE og alle de andre aspekter som fremdeles må klargjøres vedrørende disse nevrologiske lidelser, har forårsaket at problemet blir gitt nødvendig oppmerksomhet, spesielt av dem som deltar i fremstilling av produkter avledet fra bovint materiale.
Tidligere fremgangsmåter for fremstilling av gangliosider, såsom de sitert ovenfor, krevet at produktet måtte være farmasøytisk akseptabelt, fri for de biologiske kontaminanter som på den tiden var kjent for å være potensielt skadelige for helsen. Den påfølgende opptreden av ovennevnte patologi i voksent kveg har klart gjort det nødvendig å oppnå et aktivt prinsipp som, uten å miste de ovennevnte terapeutiske egenskaper, erkarakterisert vedsikkert fravær av ikke-konvensjonelle virusagens, og må kunne oppnås ved anvendelse av spesifikke fremgangsmåter som garanterer inaktivering av disse ikke-konvensjonelle virusagens, og fullstendig eliminasjon av infeksiøsitet, og ved å anvende spesifikke fremgangsmåter kunne identifisere slike agens. I virkeligheten behøver det ikke være tilstrekkelig å anvende råmateriale som er blitt sertifisert som egnet til menneskeføde, for å oppnå forbindelser eller blandinger av de samme til farmasøytiske formål. Opptreden av BSE må klart vurderes ved å ta hensyn til dens biologiske virkning in vivo, som må betraktes som et eksempel på verifisering av de forskjellige faser i prosessen, men ikke som et sammendrag av de samme. Denne analyse av biologisk virkning in vivo er nødvendig siden vitenskapsmenn ennå ikke er enige i assosiering av infeksjon med visse proteiner, såsom PrP27_3o« De"t er klart at ekstraksjons-prosessen som eliminerer infeksiøs virkning samtidig må bevare den biologiske virkning av det aktive prinsipp, siden dette er essensielt for terapeutisk anvendelse. (Ad hoc arbeidsgruppe vedrørende bioteknologi/farmasi: Validering av fjerning av virus og inaktiveringsfremgangsmåte. Commission of the EuropeanCommunities, mars 1990). Vitenskapelig forskning har frembragt, på én side, fremgangsmåter som garanterer egnede blandinger av gangliosider eller deres enkle fraksjoner, som kan oppnås i former fri for proteiner, kjemiske og biologiske kontaminanter, og på den annen side, fremgangsmåter som viser seg effektive til å ødelegge infeksiøsitet assosiert med "sene virus". Det er imidlertid ikke kjent en metode hvor det er mulig å oppnå, også i industriell målestokk, det tilsvarende ukjente resultat av et produkt, som er ønsket rent, farmakologisk aktivt og fri for infeksiøsitet assosiert med patogene agens definert som "sene virus".
Det er derfor en hensikt med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte som ikke har overnevnte ulemper.
Denne hensikt er oppnådd med den foreliggende oppfinnelse som er kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.
Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter følgende trinn: a) å utsette bovint hjernevev for lipideliminasjon med aceton for å fremstille et acetonpresipitat; b) å suspendere acetonpresipitatet i en første oppløsnings-middelblanding av metylen, metanol og natriumhydroksid; c) å filtrere første oppløsningsmiddelblanding som inneholder nevnte acetonpresipitat for å oppnå en første væskefase; d) å utsette den første væskefase for presipitering ved tilsetting av kalsiumklorid for å oppnå et første råmateriale; e) å oppløse nevnte første råmateriale i vann, kloroform og metanol og å utsette det oppløste første råmateriale for oppvarming ved en pH-verdi på tilnærmet 12 og en temperatur på 38-43°C i minst 4-8 timer; f) å utsette det oppvarmede oppløste første råmateriale til en andre adskilling i en blanding av vann, n-butanol og kloroform; g) å separere den andre adskillelsesblanding for å fjerne en organisk fase og beholde en vandig fase; h) å utsette den vandige fase for presipitering ved tilsetting av aceton og natriumklorid og sentrifugering for å
fremstille et andre råmateriale;
i) å oppløse og oppvarme det andre råmateriale i metanol;
j) å sentrifugere nevnte oppløste og oppvarmede andre
råmateriale for å fremstille en supernatant;
k) å avkjøle nevnte supernatant for å fremstille et tredje
råmateriale;
1) å oppløse det tredje råmateriale i IN natriumhydroksid i
tilnærmet 1 time;
m) å nøytralisere det oppløste tredje råmateriale;
n) å utsette det nøytraliserte oppløste tredje råmateriale for dialyse gjennom en membran med en molekylvekt "cut-off"-verdi på ca. 10 kd for å fremstille en gangliosidblanding;
o) å utsette gangliosidblandingen for tørking for å fremstille gangliosidblanding som sluttprodukt; og
p) å suspendere sluttproduktet gangsliosidblandingen i buffer og sterilisere denne for å fremstille et endelig, sterilisert gangliosidblandingsprodukt.
Fig. 1 er et skjematisk diagram av fremgangsmåten ifølge
oppfinnelsen.
Fig. 2 er et fotografi som viser resultater oppnådd ved anvendelse av anti-PrP27_3oantistoff med Western Blot-teknikken for å analysere noen prøver tatt fra intermediære trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 er et fotografi som viser resultatene fra analyse av bovint genomisk DNA i noen prøver tatt fra forskjellige trinn i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Fig. 4 er et fotografi av resultatene oppnådd ved anvendelse av anti-MBP-antistoff med Western Blot-teknikken, for å analysere noen prøver tatt fra intermediære trinn i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Fig. 5 er et fotografi av resultatene av silikagelkromatografi-analyse av gangliosidblandingen fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fig. 6 er et fotografi som viser den biologiske virkning av
gangliosidblandingen fremstilt ifølge oppfinnelsen.
Fig. 7 er et fotografi som viser resultatene fra immunokjemiske analyser med anti-PrP27_30-antistoff i prøver tatt fra intermediære trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Målet med den foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe et produkt, som erkarakterisert vedfravær av "sene viruser", oppnådd ved en fordelaktig fremgangsmåte som kan anvendes til industriell produksjon, og en fremgangsmåte hvor det nyskapende er bygget på en egnet sekvensering av dens forskjellige ekstraksjonsfaser. Denne fremgangsmåte som gjennom de forskjellige faser eliminerer infeksiøse kontaminanter assosierbare med "sene viruser", såsom bovin spongiform encefalopati, og tillater blandingens virkning, som er den terapeutiske virkning av selve produktet, å forbli uforandret. Produktet som avledes fra denne fremgangsmåte utgjøres av en bestemt blanding av gangliosider eller enkelte fraksjoner, oppnådd fra bovin hjerne eller deler av samme.
Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er, med ovenstående begrunnelser, sammensatt av de følgende hovedfaser: a) lipid eliminasjon i bovint hjernevev med aceton; b) suspensjon av et acetonpresipitat i en blanding av metylenklorid/metanol/natriumhydroksid ved en temperatur på mellom 30°C og 35°C i minst 3 h for å skille hydrofobe og hydrofile stoffer; c) oppløsning av presipitatet med vann/kloroform/metanol og natriumhydroksid (pH-verdi 12) ved oppvarming til mellom 38°C og 43°C i 4-8 h; d) oppløsning av presipitatet med IN natriumhydroksid ved værelsestemperatur i minst 1 h; og e) nøytralisering og dialyse av oppløsningen som inneholder gangliosidblandingen gjennom et membran med en MW- eller
molekylvektgrense på 10 kd.
For å illustrere og ikke begrense er det i det følgende beskrevet eksempler på preparater fremstilt fra infiserte bovine hjerner, hvor den spongiforme form av encefalopati ble påvist, eller fra proteinråmaterialer oppnådd fra uinfiserte bovine hjerner, til hvilke konstante mengder av infisert materiale fra scrapie-stammen 263K er tilsatt.
Materialer og metoder
De bovine hjerner som ble anvendt ved fremgangsmåter for ekstraksjon av gangliosidblandingen, viste, ved histologisk analyse, fibriller som typisk tilhører vevsmaterialer fra dyr med infeksjon.
Fremstillingseksempler
Eksempel 1
Et diagram av fremgangsmåten for fremstilling er vist på fig. 1.
1000 g infisert bovin hjerne, malt og suspendert i destillert vann, ble etterlatt i kontakt med 300-600 ml aceton
(vekt/volum-forhold 1:5) i tilnærmet 3 h ved værelsestemperatur under omrøring. Oppløsningen ble deretter sentrifugert med 6000 x g ved en temperatur mellom 7°C og 4°C inntil utfelling var fullstendig. Oppløsningsmiddelet ble deretter fjernet og 180-350 ml av en blanding av metylenklorid/metanol/natriumhydroksid ble satt til det våte pulver som var plassert i en egnet glassbeholder, og ble igjen etterlatt under magnetisk omrøring i minst 3 h ved en temperatur mellom 30°C og 35°C. Den ble til slutt avkjølet og deretter sentrifugert i 20 min med 6000 x g ved +10°C. Væskefasen ble filtrert gjennom en filtertrakt ved en temperatur på +24°C. En egnet mengde av kalsiumklorid og aceton ble satt til væsken, som ble etterlatt i tilnærmet 30 min under omrøring og sentrifugert med 6000 x g ved +10°C. Presipitatet (råmateriale 1) ble til slutt tørket natten over og deretter i 5 h i høyt vakuum. Restituert råmateriale 1 ble resuspendert i 10-18 ml av en blanding av vann/kloroform/metanol. pH-verdien ble justert til tilnærmet 12 med 5N NaOH. Det hele ble oppvarmet til mellom 38° og 43°C fra4til 8 h og etterlatt under omrøring. Etter å ha blitt avkjølt ble blandingen til slutt nøytralisert med 6N HC1 og den nødvendige mengde vann/n-butanol/kloroform ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 15-30 min og latt stå mellom 2 og 4 h. Til slutt ble den lavere organiske fase kastet, aceton og natriumklorid ble satt til de gjenværende vandige faser, omrørt i tilnærmet 3 0 min og sentrifugert i 20 min med 6000 x g ved +15°C (råmateriale 2).
Produktet ble tørket i høyt vakuum, resuspendert i 6-15 ml absolutt metanol og deretter holdt hett i tilnærmet 2 h med omrøring av oppløsningen fra tid til annen. Suspensjonen ble deretter hurtig sentrifugert med 6000 x g og supernatanten plassert i en fryser i tilnærmet 2 h. Den opalescerende hvite oppløsning ble deretter sentrifugert ved 0°C med 600x g og presipitatet tørket i høyt vakuum. Produktet ble samlet i IN natriumhydroksid og latt være i kontakt med oppløsningen i minst 1 h ved værelsestemperatur. Endelig ble suspensjonens pH-verdi justert til en tilnærmet pH-verdi på 9 og dialysert med en membran som har en MW-grense på 10 kd, mot et egnet volum av destillert vann. En egnet mengde natriumklorid og aceton ble tilsatt og blandingen sentrifugert ved +5°C med 6000 x g og tørket i høyt vakuum (sluttprodukt). Prøven ble tatt opp i 10 mM fosfatbuffer, pH-verdi 7,2 og sterilisert ved +121°C i
3 0 min (sterilisert sluttprodukt).
Evaluering av fremgangsmåte
Som forklart ovenfor er et viktig aspekt i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tilveiebringelse av et gangliosid-produkt som er fritt for uønskede kontaminanter, spesielt fritt for ikke-konvensjonelle virus. For å evaluere fremgangsmåten ble prøver tatt på forskjellige trinn i fremgangsmåten og testet for mulig kontaminering.
Fremgangsmåten og resultatene av biologisk/klinisk testing er som følger:
Biologisk test for scrapie ( skrapesyke):
Dyrene anvendt i disse eksperimenter var hamstere (Golden Syrian, LVG/Lak). Infeksjonstester ble utført på grupper av fire avvente hundyr som hadde mottatt intracerebral (i.c.) inokulasjon med 0,05 ml av prøvene, fortynnet ti ganger i sterilt PBS. De intracerebrale inokulasjoner ble utført av trenet personale som anvendte engangs glassprøyter med 26G, 3/8-tommers sterile nåler.
Det steriliserte sluttprodukt, konsentrert 20 ganger, ble anvendt nøyaktig som følger:
4,0 ml injisert intracerebralt i 40 dyr
3,0 ml fortynnet 1:20 og injisert, ufortynnet, intracerebralt i 50 dyr og i.p. i 22 dyr. Volumet injisert i.p. var 2,5 ml.
Dyrene ble to ganger i uken eller mer, i en periode på 12 måneder, undersøkt for utbrudd av karakteristiske nevrologiske, kliniske symptomer. Opptreden av tidlige symptomer i hvert dyr ble registrert, og dyrene ble avlivet når sykdommen var vel etablert. Deres hjerner ble delt i to halvdeler, en fiksert i 10% formalin og den andre preservert ved -70°C. Patologisk diagnose ble gitt for alle dyr som døde av mistenkelige årsaker og de som hadde vist tegn på nevrologisk sykdom. Ved slutten av observasjonstiden ble alle overlevende dyr avlivet og en patologisk vurdering av deres hjerner ble foretatt.
Infeksjonstiter ble beregnet på "endelig avslutningspunkt" i henhold til fremgangsmåten til Reed og Munch, og er uttrykt som log LD50/ml.
Følgende prøver ble testet, idet produktene ble navngitt som vist på fig. 1: Alle prøver ble resuspendert i sterilt PBS i følgende volum, beregnet slik at en homogen titer pr. volum, sammenlignet med 16,7% (vekt/volum) homogenat som utgangsmateriale, ble sikret:
Resultater av de biologisk/kliniske tester er vist i tabell l.
Tilleggsevalueringer:
Bestemmelse av skrapesyke-protein PrP er foretatt ved hjelp av polyklonale antistoffer, spesifikke for den rensede protein-analog fra musehjerne, og som kryssreagerer med skrapesyke-Prp av bovin opprinnelse. Western Blot-metoden ble anvendt for bestemmelsen. Nærvær av skrapesyke-PrP ble evaluert ved sammenligning med standarder for proteiner med forskjellige molekylvekter.
Bestemmelse av MBP-proteinet ble foretatt ved hjelp av polyklonale antistoffer spesifikke for den rensede protein-analog fra bovint cerebralt vev. Fremgangsmåten benyttet for bestemmelsene var Western Blot. Nærvær av MBP ble evaluert ved sammenligning med standarder for proteiner med forskjellige molekylvekter.
Bestemmelse av det bovine genomiske DNA ble utført ved
DOT BLOT-teknikken, på prøver tatt på forskjellige trinn i fremgangsmåten, i henhold til en fremgangsmåte kjent for fagfolk. For å vurdere prøven som valid skal nærvær av flekker ikke kunne konstateres i avsetningen av heterolog DNA. Fravær av flekker i prøvene, undersøkt ved radioautografi, viser fravær av bovint genomisk DNA.
Fig. 2 viser resultatene bestemt ved immunokjemisk analyse med anti-PrP27-3o~antist°ff av prøver tatt fra noen intermediære trinn i fremstilling og rensing av gangliosid. Nummerkodene til de analyserte prøver tilsvarer numrene i parentes, gitt i rensediagrammet på fig. 1.
Felt 1: kode 1 prøve
Felt 2: kode 2 prøve
Felt 3: kode 3 prøve
Felt 4: kode 4 prøve
Felt 5: kode 5 prøve
Felt 6: sluttprodukt
Felt 7: protein med standard molekylvekt (kd er nedover som
følger: 97,4, 66,2, 45,0, 31,0, 21,5)
Bånd merket med stjerne betegner ikke spesifikke kryss-reaksjoner som tilskrives forsterkningssystemet til analysen.
Fig. 3 viser analyse av bovint genomisk DNA ved hjelp av DOT BLOT-teknikken på prøver tatt fra forskjellige trinn i fremgangsmåten.
Skjæringspunktet av bokstaver med tall angir:
Standardkurver Undersøkte prøver
Punktene for standardkurven og de analyserte prøver er gitt i duplikat.
Fig. 4 viser resultater fra immunokjemisk analyse med anti-MBP-antistoff av prøver tatt fra noen intermediære trinn i fremstilling og rensing. Prøvekoden korresponderer med numrene angitt i rensediagrammet på fig. 1.
Felt 1: kode 1 prøve
Felt 2: kode 2 prøve
Felt 3: kode 3 prøve
Felt 4: kode 4 prøve
Felt 5: kode 5 prøve (råmateriale 1)
Felt 6: rå 2 prøve
Felt 7: kode 6 prøve
Felt 8: rå 3 kode prøve
Felt 9: sluttprodukt
Felt 10: sterilisert sluttprodukt
De forskjellige former av MBP, gjenkjent av de anvendte polyklonale antistoffer, er i parenteser.
Fig.5viser resultatene fra kromatografi på silikagel av de følgende prøver (også i henhold til fremgangsmåten skissert på fig. 1):
Felt l: sterilisert sluttprodukt
Felt 2: sluttprodukt
Felt3: standard av trisialogangliosid GTlb
Felt 4: standard av disialogangliosid GD-^-,
Felt 5: standard av disialogangliosid GDla
Felt 6: standard av monosialogangliosid GM^_
Fig.6er et fotografisk eksempel for å vise den biologiske virkning av gangliosidblandingen fremstilt i henhold til oppfinnelsen (pilene angir spiringen (sprouting)) på en perifer nerve. Fig.7viser resultater fra immunokjemisk analyse med anti-PrP27_3o~antistoff av prøver tatt fra noen intermediære trinn i rensing og fremstilling av gangliosider. Koden på de analyserte prøver korresponderer med tallene angitt i rensediagrammet på fig. 1.
Felt 1: oppløsning av råmateriale 1 som er blitt tilsatt 1,5
mikrogram/ml av PrP27_3o
Felt 2: råmateriale 2 kode prøve
Felt 3: kode 6 prøve
Felt 4: råmateriale 3 kode prøve
Felt 5: sluttprodukt
Felt 6: sterilisert sluttprodukt
Eksempel 2
Fremstilling av et klaret homogenat fra infiserte hjerner
Fire hamsterhjerner, infisert med skrapesykestamme 263 K, tilsvarende en nettovekt på 3,9 g, ble homogenisert i 10 ml destillert vann. Volumet ble deretter bragt opp til 15,5 ml for å oppnå et homogenat på 25% (vekt/volum). Suspensjonen ble sentrifugert i 40 min med 1800 x g ved 4°C: 7,5 ml av supernatanten ble gjenvunnet, delt i porsjoner og holdt ved
-70°C inntil anvendelse.
Fremstilling av provene
5 ml av det infiserte homogenat, 120 ml av metanol/metylen-klorid og 0,71 ml av 5,7 N natriumhydroksid ble satt til 10 g acetonpulver fra bovine hjerner. Denne tilsetning ble foretatt for å holde det totale volum av den vandige fase i oppløsningen konstant og for å oppnå de mest egnede arbeidsbetingelser. Den endelige titer til utgangsoppløsningen var 1% (vekt/volum). Suspensjonen ble magnetisk omrørt i 3 h ved en temperatur på 33°C. Den ble deretter avkjølt og sentrifugert i 20 min med 6000 x g ved 10°C. Væskefasen ble filtrert gjennom en Gooch-trakt (porestørrelse nr. 3) ved en temperatur på +4°C for å unngå fordampning av oppløsningsmidlene; på slutten av dette trinn ble 78 ml av væskefasen gjenvunnet. En 2 ml's porsjon ble holdt igjen for biologiske analyser. Begge porsjoner ble tilsatt et passende volum av kalsiumklorid og aceton, og etter magnetisk omrøring i tilnærmet 3 0 min ved værelsetemperatur ble prøvene sentrifugert i 10 min med 6000 x g ved 10°C. Presipitatet (råmateriale 1) ble tørket i en hette natten over og deretter i 2 h under høyt vakuum. En porsjon ble holdt ved
-70°C for å brukes til biologisk analyse.
925 mg råmateriale 1, gjenvunnet fra reaksjonsbeholderen, ble resuspendert i 18,5 ml av en blanding av kloroform/metanol/vann og 0,74 ml av homogenatet for å oppnå en titer på 1% (vekt/- volum). pH-verdien ble justert til tilnærmet 12 (vurdert med lakmuspapir) ved å tilsette 5N NaOH, og blandingen ble magnetisk omrørt ved 40°C i 6 h. Etter avkjøling til værelsestemperatur ble oppløsningen nøytralisert med 6N HC1 og en porsjon på 250 jul ble holdt igjen for å brukes til biologisk analyse.
Begge porsjoner ble behandlet med et egnet volum av n-butanol/- kloroform/vann og etter omrøring i 15 min ble de latt stå i 4 h. Til slutt ble de lavere organiske faser kastet. De gjenværende vandige faser ble tilsatt natriumklorid og aceton, og etter magnetisk omrøring ved værelsestemperatur i tilnærmet 3 0 min ble de sentrifugert i 10 min med 6000 x g ved 15°C (råmateriale 2).
Dette produkt ble tørket i høyt vakuum og den porsjon som ble satt til side for biologisk analyse ble preservert ved -70°C. Det gjenværende materiale ble resuspendert i 6,5 ml absolutt metanol og etterlatt ved 50°C i 2 h under tidvis omrøring. Suspensjonen ble raskt sentrifugert med 6000 x g og supernatanten plassert i en fryser ved -20°C i 2 h. Den kalde, hvite, opalescerende oppløsning ble deretter sentrifugert ved 0°C med 6000 x g i 5 min og presipitatet ble tørket i høyt vakuum. Utbyttet på dette punkt var 6 mg av produktet. Dette ble deretter resuspendert i 500 fil natriumhydroksid, 460 fil destillert vann og 40 fil homogenat og latt være i kontakt med denne oppløsning i 1 h ved værelsestemperatur. Til slutt ble pH-verdien i denne suspensjon justert til tilnærmet 9 (vurdert med lakmuspapir) og dialysert med en membran med en MW-grense på 10 kd i 4 h mot 20000 volumenheter destillert vann. Det endelige volum etter dialyse var 980 fil. Det ble delt i to porsjoner på henholdsvis 500 fil og 480 fil; til den første ble det satt et nødvendig volum av natriumklorid og aceton og den ble sentrifugert i 10 min med 6000 x g ved 5°C. Denne prøve ble tørket i høyt vakuum (sluttprodukt).
Den andre porsjon ble tilsatt 20 ml homogenat og 50 fil PBS 10x, og den ble sterilisert ved 121°C i 30 min (sterilisert sluttprodukt).
Evaluering av fremgangsmåten
Som beskrevet ovenfor for eksempel 1 ble prøver tatt fra de forskjellige trinn i fremgangsmåten testet for potensielt nærvær av kontaminanten.
Prøvene ble testet og resultatene er som følger:
Alle prøvene ble oppsamlet i steril PBS i følgende volumer, beregnet slik at de sikrer en homogen titer pr. volum sammenlignet med 1% (vekt/volum) homogenat som utgangsmateriale:
Tabell 2 viser resultatene oppnådd ved biologisk analyse.
Eksempel 3
Biologisk virkning av qanqliosidblandinq
En serie med eksperimenter ble utført in vitro for å verifisere om gangliosidblandingen (oppnådd i henhold til den ovennevnte fremgangsmåte) utviste noen biologisk virkning som kan forutsi terapeutisk anvendelse til å behandle patologiske tilstander i det perifere nervesystem (PNS) og i det sentrale nervesystem (CNS). Spesielt ble virkningen av gangliosider testet in vitro for å vurdere nevrittdannelsen i kulturer av nevroblastom-celler (N2A). Disse celler kan, som beskrevet i litteraturen (Denis - Donini et al., Neuronal Development, part II, 323:348 - Academic Press, NY 1980; Leon et al., Dev. Neurosci. 5:108, 1982) indusere, under visse betingelser, ekspresjon av forskjellige funksjoner som er karakteristiske for modne neuroner, for derved å tillate kvalitativ og kvantitativ analyse av biokjemiske parametre korrelert med hvert utvik-lingstrinn.
Derfor er vurderingene foretatt i denne modell (% celler med nevrittdannelse, nevrittlengde og relativ forgrening) effektive instrumenter til å undersøke mulig terapeutisk anvendelse av et legemiddel til funksjonell restitusjon av nervesystemet.
Materialer og metoder
Cellekulturer
Museceller, C 1300, klon N2A, levert av America Cell Type Collection (Bethesda, Maryland), ble sådd i en konsentrasjon på 10 000 celler pr. brønn (24-castor) i nærvær av Dulbeccos modifisert Eagle medium (DMEM) som inneholder P/G
(100 U.penicillin/ml) og 10% føtalt kalveserum (FCS fra Seromed, porsjon 4-C04).
Neste dag ble kulturmediet forandret med det samme volum friskt medium som inneholdt gangliosider (se videre). Kulturene ble holdt ved 37°C i 5% C02i en fuktet atmosfære (Haerus-inkubator). Kulturene ble deretter fiksert med 2% glutaraldehyd ved det angitte tidspunkt (24 h senere).
Fremstillin<g>av testoppløsnin<q>er av produktet
Gangliosidblandingen (3 forskjellige porsjoner, nr. 1-2-3) ble oppløst i kloroform/metanol 2:1, tørket i en nitrogenstrøm, resuspendert i DMEM + P/G + 10% FCS inntil de ønskede konsentrasjoner ble oppnådd.
Konsentrasjoner undersøkt: 1 x 10~<4>M; 5 x 10~<5>M og1x 10~<5>M.
Fire forskjellige eksperimenter ble utført som følger:
tre eksperimenter for å vurdere virkningen av gangliosid
blandingen (porsjon nr. 1 og 2) ved en konsentrasjon på 1 x 10"<4>M
ett eksperiment for å vurdere dose/respons-virkningen til forskjellige konsentrasjoner (1 x 10~<4>,5x10~<5>og 1 x 10~<5>M) av gangliosidblandingen under undersøkelsen (porsjon nr. 3).
Fremgangsmåte
Mediet ble trukket opp av brønnene og substituert med 350/il DMEM + P/G + 10% FCS + produkt under utprøving (i de ovennevnte konsentrasjoner).
Kontrollkulturene ble behandlet på samme måte, uten tilsetning av gangliosidblanding. Kulturene ble deretter holdt i en inkubator i 24 h, hvoretter cellene ble fiksert med 2% glutaraldehyd og observert under et mikroskop.
Parametre
Morfologisk undersøkelse utført for å vurdere:
prosentvis (%) andel av celler med nevritter lengde av nevritter og relativ forgrening.
Resultater
Som rapportert i tabell 3 er det klart at produktene under undersøkelse er virkningsfulle (1 x 10~<4>M) til å indusere dannelse av nevritter i N2A-celler.
Virkningen av gangliosidblandingen er doseavhengig med maksimum virkning ved en dose på 1 x 10-<4>M (tabell 4).
Tabell 3
Virkning av gangliosidblanding (porsjon 1, 2) på nevrittdannelse i musenevroblastoma N2A-celler.
Alle produkter ble satt til cellene i en endelig konsentrasjon på 1 x 10~<4>M, og morfologisk evalueringer ble foretatt 24 h senere.
Statistisk vurdering av data på biologisk virkning in vitro angir at det er ingen signifikant forskjell mellom de forskjellige porsjoner av gangliosidblanding (tabell 5).
Tabell 5
Total statistisk vurdering av data oppnådd med porsjoner 1 og 2. Verdiene rapportert er gjennomsnittsverdi av ni uavhengige tester ± S.D.
Videre viser morfologisk vurdering av nevrittene at celler behandlet med gangliosidblanding viser lange, bemerkelsesverdig forgrenede nevritter (dvs. markert forgrening).
Konklusjoner
De ovennevnte observasjoner bekrefter derfor at gangliosidblandingen som ble undersøkt har en biologisk virkning, idet produktet, oppnådd ved en fremgangsmåte som garanterer dets spesielle egenskaper, virkelig kan indusere nevrittdannelse i N2A-celler. Dette faktum angir at produktet er effektivt ved tilheling av det perifere og sentrale nervesystem. Blanding av gangliosider, oppnådd som beskrevet og fri for kontaminanter assosiert med potensielt farlige, ikke-konvensjonelle virus, kan også anvendes til fremstilling av individuelle komponenter eller gangliosidblandingen, såsom monosialogangliosid GM^
I lys av de farmakologiske egenskaper beskrevet ovenfor kan gangliosidblandingen generelt anvendes som et legemiddel ved tallrike patologiske tilstander (med forskjellige etiopatogene årsaker) i både det perifere og sentrale nervesystem. Spesifikke tilstander som kan behandles er: retrobulbær optisk nevritt, paralyse av de oculomtoriske nerver, trigenimus-neuralgi, paralyse av nervus facialis og Bells paralyse, Garcins syndrom, radiculitt, traumatiske lesjoner av de perifere nerver, diabetisk og alkoholisk polynevritt, obste-tretisk paralyse, paralyttisk isjias, motorneuron-sykdommer, amyotropisk lateral sclerose, myelopatisk muskulær atrofi, progressiv bulbær paralyse, myastenia gravis og Eaton-Lambert-syndrom, muskulær dystrofi, svekkelse i synaptisk nerveover-føring i CNS og PNS, bevissthetsdefekter såsom konfusjon, konkusjon, trombose, cerebral embolisme, cerebrale og spinale traumer.
Administrering skjer vanligvis ved intramuskulær, subkutan eller intravenøs injeksjon, eller transdermalt, pulmonalt eller oralt, fortrinnsvis i passende bufrede vandige opp-løsninger. Sikker lagring av det farmasøytiske preparat kan oppnås ved å fremstille det i form av små flasker som inneholder oppløsninger av produktet, muligvis sammen med andre hjelpeingredienser, som angitt i eksemplene på farmasøytiske preparater rapportert nedenunder. For terapeutisk eller mulig også preventiv anvendelse av den ovennevnte parenterale måte varierer dosene fortrinnsvis mellom 10 mg og 100 mg/dag av aktivt stoff.
Det er klart at oppfinnelsen som er blitt beskrevet kan varieres på mange måter. Slike variasjoner skal ikke betraktes som et avvik fra ideen og rekkevidden av oppfinnelsen, og alle slike modifikasjoner som ville være selvsagte for en fagmann, skal inkluderes innenfor rekkevidden av de følgende krav.
Claims (1)
1. Fremgangsmåte til fremstilling av en blanding av gangliosider,karakterisert vedat den omfatter: a) å utsette bovint hjernevev for lipideliminasjon med aceton for å fremstille et acetonpresipitat; b) å suspendere acetonpresipitatet i en første oppløsnings-middelblanding av metylen, metanol og natriumhydroksid; c) å filtrere første oppløsningsmiddelblanding som inneholder nevnte acetonpresipitat for å oppnå en første væskefase; d) å utsette den første væskefase for presipitering ved tilsetting av kalsiumklorid for å oppnå et første råmateriale; e) å oppløse nevnte første råmateriale i vann, kloroform og metanol og å utsette det oppløste første råmateriale for oppvarming ved en pH-verdi på tilnærmet 12 og en temperatur på 38-43°C i minst 4-8 timer; f) å utsette det oppvarmede oppløste første råmateriale til en andre adskilling i en blanding av vann, n-butanol og kloroform; g) å separere den andre adskillelsesblanding for å fjerne en organisk fase og beholde en vandig fase; h) å utsette den vandige fase for presipitering ved tilsetting av aceton og natriumklorid og sentrifugering for å fremstille et andre råmateriale; i) å oppløse og oppvarme det andre råmateriale i metanol; j) å sentrifugere nevnte oppløste og oppvarmede andre råmateriale for å fremstille en supernatant; k) å avkjøle nevnte supernatant for å fremstille et tredje råmateriale;
1) å oppløse det tredje råmateriale i IN natriumhydroksid i tilnærmet 1 time; m) å nøytralisere det oppløste tredje råmateriale; n) å utsette det nøytraliserte oppløste tredje råmateriale for dialyse gjennom en membran med en molekylvekt "cut-off"-verdi på ca. 10 kd for å fremstille en gangliosidblanding; o) å utsette gangliosidblandingen for tørking for å fremstille gangliosidblanding som sluttprodukt; og p) å suspendere sluttproduktet gangsliosidblandingen i buffer og sterilisere denne for å fremstille et endelig, sterilisert gangliosidblandingsprodukt.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT4174789A IT1236594B (it) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi |
IT04171690A IT1243295B (it) | 1990-10-18 | 1990-10-18 | Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali |
PCT/EP1990/001960 WO1991007417A1 (en) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO912780L NO912780L (no) | 1991-07-16 |
NO912780D0 NO912780D0 (no) | 1991-07-16 |
NO175311B true NO175311B (no) | 1994-06-20 |
NO175311C NO175311C (no) | 1994-09-28 |
Family
ID=26329145
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO912780A NO175311C (no) | 1989-11-17 | 1991-07-16 | Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5521164A (no) |
EP (1) | EP0454818B1 (no) |
JP (1) | JP3140458B2 (no) |
KR (1) | KR0177820B1 (no) |
CN (1) | CN1027895C (no) |
AT (1) | ATE169926T1 (no) |
AU (1) | AU649635B2 (no) |
CA (1) | CA2045142C (no) |
DE (1) | DE69032578T2 (no) |
ES (1) | ES2119747T3 (no) |
FI (1) | FI97138C (no) |
HK (1) | HK1013294A1 (no) |
HU (2) | HU210145B (no) |
IE (1) | IE904135A1 (no) |
IL (1) | IL96346A (no) |
IN (1) | IN171530B (no) |
NO (1) | NO175311C (no) |
NZ (1) | NZ236059A (no) |
PE (1) | PE25491A1 (no) |
PT (1) | PT95917B (no) |
WO (1) | WO1991007417A1 (no) |
YU (1) | YU218790A (no) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1235161B (it) * | 1988-12-02 | 1992-06-22 | Fidia Farmaceutici | Derivati di lisogangliosidi |
JPH05508396A (ja) * | 1991-05-16 | 1993-11-25 | フィディーア・ソシエタ・ペル・アチオニ | 非従来型ウイルスによる汚染を含有しないグリコスフィンゴ脂質混合物の生産及び精製方法 |
IT1260149B (it) * | 1992-04-17 | 1996-03-28 | Fidia Spa | Metodo per la preparazione e purificazione di miscele di fosfolipidi prive di contaminanti da virus non convenzionali |
US6458761B2 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-01 | Lore Maria Klett-Loch | Synthetic, statistic thymic peptide combination and its use as a preparation with immunological and/or endocrinological effect |
EP1295612B1 (en) * | 2000-02-24 | 2006-12-06 | Menicon Co., Ltd. | Use of a treating solution for inactivating prions |
EP1435972B1 (en) | 2001-08-29 | 2016-03-09 | Seneb Biosciences Inc. | Novel synthetic ganglioside derivatives and compositions thereof |
EP1603932B1 (en) | 2003-03-06 | 2012-10-03 | Seneb Biosciences Inc. | Methods and compositions for the enzymatic synthesis of gangliosides |
US7066261B2 (en) * | 2004-01-08 | 2006-06-27 | Halliburton Energy Services, Inc. | Perforating system and method |
WO2010062197A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-03 | Eduard Nekrasov | Dairy product and process |
US20120035120A1 (en) | 2009-03-25 | 2012-02-09 | Seneb Biosciences, Inc. | Glycolipids as treatment for disease |
CN101838295B (zh) * | 2010-04-14 | 2015-02-25 | 李桂凤 | 一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺 |
US8710385B2 (en) | 2012-05-07 | 2014-04-29 | Robert Butch Sickels | Reliability fire pressure switch |
CN105111253B (zh) * | 2015-09-18 | 2018-01-12 | 重庆寰瑞生物技术有限公司 | 一种提取分离神经节苷脂的方法 |
CN109320566B (zh) * | 2018-08-14 | 2022-03-15 | 四川兴杰象药业有限公司 | 一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3346413A (en) * | 1964-10-12 | 1967-10-10 | Hooker Chemical Corp | Method and apparatus for coating wire and solvent recovery |
ES528692A0 (es) * | 1984-01-04 | 1985-07-01 | Bioiberica | Procedimiento para la obtencion de un complejo glicoesfingolipidico |
JPS60181019A (ja) * | 1984-02-28 | 1985-09-14 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ガングリオシドの抽出方法 |
IT1177863B (it) * | 1984-07-03 | 1987-08-26 | Fidia Farmaceutici | Una miscela gangliosidica come agente terapeutico capare di eliminare il dolore nele neuropatie periferiche |
JPS61180719A (ja) * | 1985-02-06 | 1986-08-13 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ガングリオシドの取得方法 |
US4710490A (en) * | 1985-10-01 | 1987-12-01 | Angio Medical Corporation | Compositions containing ganglioside molecules with enhanced angiogenic activity |
IT1223408B (it) * | 1987-12-09 | 1990-09-19 | Crinos Industria Farmaco | Procedimento per la preparazione di monosialoganglioside |
-
1990
- 1990-11-13 NZ NZ236059A patent/NZ236059A/xx unknown
- 1990-11-13 IN IN952/CAL/90A patent/IN171530B/en unknown
- 1990-11-14 IL IL96346A patent/IL96346A/xx active IP Right Grant
- 1990-11-15 PE PE1990177644A patent/PE25491A1/es not_active Application Discontinuation
- 1990-11-16 PT PT95917A patent/PT95917B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 AU AU67275/90A patent/AU649635B2/en not_active Ceased
- 1990-11-16 AT AT90916737T patent/ATE169926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 ES ES90916737T patent/ES2119747T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-16 YU YU218790A patent/YU218790A/sh unknown
- 1990-11-16 CA CA002045142A patent/CA2045142C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 DE DE69032578T patent/DE69032578T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-16 KR KR1019910700744A patent/KR0177820B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 HU HU912391A patent/HU210145B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 HU HU912391A patent/HUT58754A/hu unknown
- 1990-11-16 IE IE413590A patent/IE904135A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-16 WO PCT/EP1990/001960 patent/WO1991007417A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-16 EP EP90916737A patent/EP0454818B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-16 JP JP02515353A patent/JP3140458B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-17 CN CN90109855A patent/CN1027895C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-07-16 NO NO912780A patent/NO175311C/no not_active IP Right Cessation
- 1991-07-17 FI FI913454A patent/FI97138C/fi active
-
1993
- 1993-09-03 US US08/116,268 patent/US5521164A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-22 HK HK98114612A patent/HK1013294A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO175311B (no) | Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus | |
Rigney et al. | Pathogenicity of Aeromonas hydrophila in red leg disease in frogs | |
US5330975A (en) | Bacterial toxin neutralizer | |
EP0638083B1 (en) | Method for the preparation and purification of phospholipid mixtures free from contamination by unconventional viruses | |
Bessler et al. | Protein I and protein II from the outer membrane of Escherichia coli are mouse B-lymphocyte mitogens | |
EP0539380B1 (en) | Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses | |
AU2002257295B2 (en) | Destruction of prions using vibriolysin or variants thereof | |
CA2087158A1 (en) | Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses | |
RU2132688C1 (ru) | Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей | |
Sutanto et al. | The Potential of Snail Seromucous and Chitosan as Bioimunomodulator for Tuberculosis Therapy | |
IT9041716A1 (it) | Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali | |
RU2797514C1 (ru) | Фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов, выделенных из различных тканей и биологических жидкостей животных | |
WO2021090911A1 (ja) | タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法、そのキット、タンパク質ミスフォールディング病治療薬及び血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤 | |
EA010739B1 (ru) | Средство, нормализующее функции головного мозга, и способ его получения | |
CN118045161A (zh) | 林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体的药物中的应用 | |
GB2601226A (en) | Method for the preparation of water soluble eggshell membrane derived peptides | |
Minor | The challenge for the public health system | |
Minor | The Challenge for the Public Health System | |
Anders | Pathology: Human Prion Diseases | |
Lupi | Prions | |
CN109288823A (zh) | 白皮杉醇在制备治疗朊病毒引起疾病药物中的用途 | |
Prusiner et al. | Prions causing transmissible neurodegenerative diseases | |
Lee | Toll-Like Receptors and Neuroinflammation | |
Hakenbeck et al. | Pneumolysin Is the Main Inducer of |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |