NO175311B - Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus - Google Patents

Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus

Info

Publication number
NO175311B
NO175311B NO912780A NO912780A NO175311B NO 175311 B NO175311 B NO 175311B NO 912780 A NO912780 A NO 912780A NO 912780 A NO912780 A NO 912780A NO 175311 B NO175311 B NO 175311B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
raw material
mixture
subjecting
ganglioside
acetone
Prior art date
Application number
NO912780A
Other languages
English (en)
Other versions
NO912780L (no
NO175311C (no
NO912780D0 (no
Inventor
Francesco Della Valle
Lanfranco Callegaro
Silvana Lorenzi
Original Assignee
Fidia Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IT4174789A external-priority patent/IT1236594B/it
Priority claimed from IT04171690A external-priority patent/IT1243295B/it
Application filed by Fidia Spa filed Critical Fidia Spa
Publication of NO912780L publication Critical patent/NO912780L/no
Publication of NO912780D0 publication Critical patent/NO912780D0/no
Publication of NO175311B publication Critical patent/NO175311B/no
Publication of NO175311C publication Critical patent/NO175311C/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06Separation; Purification
    • C07H1/08Separation; Purification from natural products

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling av en spesifikk blanding av gangliosider, og produktet fremstilt ved en slik fremgangsmåte, oppnådd ved en fremgangsmåte som selektivt eliminerer kontaminanter assosiert med ikke-konvensjonelle, livstruende virus, uten å forandre de biologiske og farmakologiske egenskaper til blandingen med hensyn på dens virkning på det sentrale og perifere nervesystem.
Gangliosider, glykosfingolipider som inneholder sialinsyre er alle normale bestanddeler av alle cellemebraner i pattedyr og er hyppig forekommende i nervevevet (Ando S.: Neurochem. Int. 5:507, 1983). Fire gangliosider, GM^, GDla, GD^ og GT^
(nomenklatur i henhold til Svennerholm L., J. Neurochem, 10:613, 1963), utgjør 80-90% av det totale gangliosidinnhold i pattedyrhjernen. Gangliosider er spesifikt lokalisert i de ytre lag av plasmamembranen, hvilket antyder at de spiller en viktig rolle i mange biologiske virkningsmekanismer, f.eks. som en "sensor" og/eller reseptor for forskjellige molekyler, og i overforing av informasjon gjennom cellemembraner (Fishman et al.: Science 194:906, 1976). De spiller derfor en nøkkelrolle i reguleringen av neuronal utvikling og vedlikehold i det sentrale og perifere nervesystem.
Det er virkelig fyldig dokumentasjon på at gangliosider er istand til å influere gunstig funksjonell restitusjon etter en lesjon i det perifere nervesystem (PNS) og sentrale nervesystem CNS), ved engasjement av spesifikke membranmekanismer, og ved gjensidig påvirkning med neurotrofe faktorer, som vist i in vitro studier på nevronkulturef (Doherty P. et al., J. Neurochem. 44:1259, 1985; Skaper S. et al., Molecular Neurobiology,3:173, 1989).
Spesielt er det blitt rapportert at foreskriving av gangliosider in vivo fremmer nerveregenerasjon og funksjonell regenerasjon i PNS under patologiske forhold: Positive virkninger er blitt beskrevet i modeller på traumatiske neuropatier (Ceccarelli B. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 71:275, Plenum Press, New York, 1976; Gorio A. et al., Brain Res. 7:236, 1980; Gario A. et al., Neuroscience 8:417, 1983), metabolske neuropatier (Norido F. et al., Exp. Neurol. 83:221, 1984) og toksiske neuropatier (Di Gregorio F. et al., Cancer Chemoter., Pharmacol. 26:31, 1990).
Med hensyn på CNS er positive virkninger i utstrakt grad blitt rapportert, såsom restitusjon indusert ved monosialogangliosid GMii modeller på ischemi (Cuello A.C. et al., Brain Res. 376:373, 1986; Karpiak S.E. et al., CRC Critical Rev. in Neurobiology, Vol. 5, Issue 3, 1990), traumatiske lesjoner (Toffano G. et al., Brain Res. 296:233, 1984) og neurono-toksiske lesjoner (Johnson J., Dev. Brain Res., 16:171, 1984) i forskjellige neuronale systemer hos forskjellige dyrearter. Det er nylig blitt oppdaget at gangliosider kan inhibiere trans-lokasjon og aktivering av proteinkinase C, indusert ved glutamat (Vaccarino F. et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 84:8707, 1987). Denne virkning er meget viktig i lidelser med ischemisk skade, hvor det er blitt rapportert at eksitatoriske aminosyrer, såsom glutamat, spiller en avgjørende rolle idet de igangsetter en kaskade av hendelser som fører til neurondød. Denne mekanisme kunne begunstige overlevelse av neuroner i området rundt lesjonen, hindre retrograd regenerasjon og akselerere den helende vekstrespons på lokale trofiske faktorer.
Resultatene fra eksperimentell forskning er i stor grad blitt konfirmert av resultater fra klinisk anvendelse av gangliosider. I mer enn ti år har gangliosider blitt anvendt som terapeutisk middel ved nesten alle former for perifer neuro-pati, fra de som er resultat av mekanisk skade til de forårsaket av toksiske faktorer eller defekter, fra infeksiøse og inflammatoriske lidelser til metabolske dysfunksjoner. Disse legemidler har vist seg å være like effektive i mono- og polyneuropatier, i sensorisk-motoriske lidelser og i patologiske tilstander som påvirker det autonome nervesystem, såsom i mange neuropatier som påvirker hjernenervene, f.eks. Bells paralyse, trigeminal neuralgi og neuralgi forårsaket av herpes zoster. Gangliosider, og spesielt monosialogangliosidet, kan i utstrakt grad anvendes på alle patologiske tilstander som er forbundet med akutte vaskulære og traumatiske lesjoner i CNS og ved sekvele av slike patologiske tilstander (cerebral ischemi, kraniale og spinale traumer).
Deres beviste helende virkning i CNS understøtter også deres anvendelse ved kroniske neurodegenerative patologiske tilstander, såsom Parkinsons sykdom og Alzheimers sykdom. Det faktum at de er "endocider" (endogene legemidler) av natur, idet de er naturlige komponenter av nervemembraner, forklarer at de tolereres i utmerket grad og fraværet, selv ved forlenget behandling med høye doser, av bivirkninger som er så hyppige i noen konvensjonelle behandlingsmåter for perifere neuropatier.
Generelt viser egnede gangliosidblandinger, f.eks. en formule-ring av følgende type: GM^fra 18% til 24%, GDlafra 3 6% til 44%, GDlbfra 12% til 18%, G<T>lbfra 16% til 22%, eller de enkelte gangliosidfraksjoner, spesielt monosialogangliosidet GM^, biologiske virkninger, såsom de beskrevet. Disse gangliosider, som egnede blandinger eller enkle fraksjoner, spesielt monosialogangliosid GM-^, ekstraheres fra pattedyrhjerner og det er derfor nødvendig gitt deres spesielle biologiske funksjon og deres terapeutiske anvendelse tidligere beskrevet med hensyn på det perifere og sentrale nervesystem, å benytte rensefrem-gangsmåter som garanterer et endelig produkt som er absolutt rent og fritt for biologiske og kjemiske kontaminanter.
Det har lenge vært kjent at det er mulig å ekstrahere, på forskningsnivå, blandinger av gangliosider (Tettamanti et al., Biochim. e Biophys. Acta, 296:160, 1973; Trams et al., Biochim. e Biophys. Acta, 60:350, 1962; Bogoch et al., British J. Pharm., 18:625, 1962; Wiegandt et al., Angew Chem. 80:89, 1968; US patent nr. 3 436 413; og CA. 61, 9851C, 9895d) , men ingen av de ovennevnte fremgangsmåter ble utviklet med henblikk på å utvise eliminasjon og destruksjon av komponenter assosiert med ikke-konvensjonelle virus. En årsak til dette er at på den tiden var ikke slike sykdommer kjent i de pattedyrarter hvis hjerner ble benyttet til ekstraksjon. En annen årsak er at ingen reagens var tilgjengelig for den spesifikke identifikasjon av mulig farlige komponenter, mens idag har slike reagenser blitt gjort tilgjengelige, ved spesifikke fremgangsmåter utviklet på basis av nylig oppnådd kunnskap, hentet fra den vitenskapelige utvikling av molekylbiologi-teknikologi.
Noen ganger kan patologiske situasjoner oppstå hvor de patogene agens ikke kan identifiseres. En slik patologisk situasjon er kalt bovin spongiform encefalopati (BSE), først rapportert i England i 1986 (Wells G. et al., Vet. Record, 419, 1986). Dette navnet er avledet fra det svampaktige utseende til hjernevev fra affiserte dyr. Når snitt av vevet analyseres i mikroskop, sees det at hovedlesjonene omfatter utstrakte neuronale vakuoler.
Alt tilgjengelige bevismateriale peker på det faktum at BSE tilhører en gruppe av degenerative encefalopatier i sentral-nervesystemet, som uten unntak er dødelig og forårsakes av en gruppe av ikke-konvensjonelle, infeksiøse agens (Fraser et al., Vet. Record 123:472, 1988; Hope et al., Nature 336:390, 1988) . Denne gruppe inkluderer også skrapesyken (scrapie) hos sau og geiter, den kroniske avmagrende sykdom som påvirker fangede hjortedyr, infeksiøs encefalopati hos mink i mink-farmer, og to humane sykdommer; kuru og Creutzfeldt-Jacobs sykdom. De histopatologiske lesjoner forårsaket i hjernen, av disse sykdommer, er like i alle tilfelle og er sammenlignbare med de forårsaket av BSE. Mange teorier er blitt fremmet angående naturen til disse etiologiske agens, som hverken er bakterier eller virus, er ulike alle andre kjente organismer og er derfor kjent som ukonvensjonelle virus. Med bakgrunn i deres lange inkubasjonsperiode, regnet fra infeksjonsøyeblikket til utbrudd av symptomer, kalles disse virus også "sene virus"
("slow viruses").
Etter de få tilfeller observert i 1986 har sykdommen spredd seg og har nådd epidemiske størrelser i Storbritannia, idet den affiserer rundt 14 000 kveg, og øker stadig med tilnærmet 250-300 tilfelle hver uke. Det infiserte kveg viser ingen tegn til sykdommen på mange år (inkubasjonsperioden er 4-5 år), men når symptomene har kommet til syne svekkes dyrene raskt og dør.
En epidemiologisk undersøkelse av "Central Veterinary Laboratory, British Ministry of Agriculture" (Wilesmith et al., Vet. Record. 123:638, 1988) viste at infeksjonskilden var dyrefor som var tilberedt med behandlede skrotter av andre drøvtyggere, og solgt i form av pulverisert kjøtt eller ben. Siden encefalopati kan overføres til et stort område av dyrearter, synes det rimelig å anta at BSE er resultatet av infeksjon av det etiologiske agens ansvarlig for skrapesyke, overført fra sau ved hjelp av disse kontaminerte næringsmidler (Morgan KL, Vet. Record 122:445, 1988).
På basis av resultater fra denne undersøkelse forbød den britiske regjering, ved en forordning som ble satt i kraft 18. juli 1988, salg og tilførsel av dyrefor som inneholder dyreproteiner avledet fra drøvtyggere.
Den generelle oppfatning er at mange faktorer har sammen bidratt til den plutselige tilsynekomst av BSE i Storbritannia (Cherfas J. , Science, Feb. 1990, 523).
Først økte antallet av sau i Storbritannia hurtig sent i 70-årene og tidlig i 80-årene, og med dette insidensen av skrapesyke som har vært en endemisk sykdom hos sau i Europa i over 250 år (Pattison et al., Vet. Record 90:465, 1972). Samtidig, i kjølvannet av oljekrisen, forandret fabrikkene som produserte dyrefor, sine fremgangsmåter for behandling av skrotter til et lavere-temperatur system, som muligens var mindre effektivt til å ødelegge det meget motstandsdyktige skrapesykeagens. Alle unntagen én av produsentene av disse næringsmidler gikk bort fra anvendelse av oppløsningsmidler, såsom benzen, heksan og trikloretylen til å fjerne overskudds-fett fra soyabønner og benmel. Kanskje mest viktig i det hele var at det avsluttende trinn, hvor produktene ble opphetet for å fjerne oppløsningsmidlene, ble utelatt: Dette trinn krevet virkelig meget høye temperaturer.
Videre ble oppdretterne, ifølge regjeringens politikk, oppmuntret til å produsere mer melk og avvenne kalvene tidlig ved å gi dem proteinrikt for. Dette var ofte av dårlig kvalitet siden mel laget fra kjøtt og ben var billigere enn produkter laget med soyabønne og fisk, som er bedre proteinkilder. Undersøkelser for å forstå hvordan sykdommen overføres er fundamentalt for BSE-forskning. Det viktigste aspekt ved disse eksperimenter er at, ved å identifisere begrensningene av barrierene mellom artene, med hensyn på overføring av det patogene agens, er det mulig å vurdere risikoen for BSE-infeksjon hos enhver art. Fraser et al. (Vet. Record, 123:472,1988) viste at sykdommen kunne overføres fra kveg til mus. De inokkulerte ekstrakter av hjernen til kveg, som hadde dødd av BSE, inn i hjernene til mus, som deretter utviklet sykdommen. Senere overførte Barlow et al. (Vet. Record, 3. feb. 1990) sykdommen til mus ved å fore dem med infiserte hjerner. Dette var det første bevis på at BSE kunne pådras ved å spise infisert materiale. Intet annet vev fra affiserte dyr (milt, ryggmarg, lymfevev, melk, etc.) var istand til å fremskaffe sykdommen hos mus.
Det er indikasjoner på at skrapesyke kan overføres til lam av deres mødre, men så langt finnes intet opplysende bevismateriale på mulig vertikal eller horisontal overføring av det etiologiske agens til BSE hos kveg.
Agens som forårsaker subakutte infeksiøse encefalopatier er ekstremt motstandsdyktige overfor standard dekontaminerings-prosesser. Tilgjengelig data vedrørende dette aspekt stammer hovedsakelig fra studier av agens som frembringer skrapesyke og Creutzfeldt-Jacobs sykdom. Det etiologiske agens for skrapesyke er meget motstandsdyktig mot temperaturforandring. Deres evne til å forårsake infeksjoner er bare lett redusert ved eksponering til temperaturer opptil 80°C; høyere temperaturer reduserer imidlertid infeksjonsevnen markert (Hunter et al., J. Gen. Microbiol. 37:251, 1964). En liten mengde av infeksiøs "virus" persisterer noen ganger når suspensjoner med infisert materiale varmes opp til 100°C i 1 time eller til 118°C i 10 minutter.
Nylig ble det følt et behov for å fornye steriliserings-standardene for disse infeksiøse agentia under høyt damptrykk i autoklaver. De gjeldende standarder i USA, som gjelder autoklavering for dekontaminering med hensyn på Creutzfeldt-Jacobs sykdom, omfatter behandling ved 132°C i 1 time (Rosenberg et al., Annals of Neurology 19:75, 1986), og er basert på studier utført på hjernehomogenater som inneholder skrapesyke eller Creutzfeldt-Jacobs agentia (Brown et al., J. of Infectious Diseases 153:1145, 1986). I Storbritannia omfatter den gjeldende standard for autoklavering for dekontaminering av Creutzfeldt-Jacobs sykdom behandling i en autoklav ved 134-138°C i 18 minutter, basert på noen studier, inkludert en ved Kimberlin (Kimberlin et al., Journal of Neurological Sciences 59:355, 1983). Uheldigvis er det bovine spongiforme encefalopati-agens meget motstandsdyktig, til og med mot vanlig kjemisk behandling, såvel som fysikalsk. Oppløsningsmidler, såsom benzen, heksan, bensin og trikloretylen er blitt benyttet som ekstraksjonsoppløsningsmidler, men lite er kjent vedrørende deres virkning på infeksiøsiteten. Bare en liten datamengde er tilgjengelig på kjemisk inaktivering av infeksiøse agens, hovedsakelig fordi undersøkelser krever store antall dyr og lange observasjonsperioder. Konsentrasjoner på 0,3-2,5% natriumhypokloritt reduserte betydelig infeksiøsitet i det anvendte biologiske analysesystem, men eliminerte den ikke fullstendig (Walker et al., Am. J. Publ. Health 73:661, 1983). Data som angår behandling med opptil 0,25 N natriumhydroksid er meget variable; ved konsentrasjoner på over 1 N synes denne forbindelse imidlertid å være det mest effektive kjemiske middel av alle de som er undersøkt. Behandling med 6M-8M urea ble også rapportert å være meget variabelt.
Resultatene fra disse undersøkelser vedrørende dekontaminering viser således at, skjønt mesteparten av infeksiøsiteten blir hurtig ødelagt av mange av de forskjellige fysikalske og kjemiske fremgangsmåtene, eksistensen av små subpopulasjoner av motstandsdyktig infeksiøse agens, gjør sterilisering av kontaminert materiale meget vanskelig i praksis.
Da BSE var blitt identifisert som en "skrapesyke-lignende" sykdom, begynte viktige spørsmål å stilles på epidemiologiske og analytiske nivåer, de siste ble spesielt rettet mot identifisering av agens assosiert med infeksiøsitet. Alle anstrengelser foretatt så langt for å identifisere nukleinsyrer assosiert med det etiologiske agens har imidlertid vært ufruktbare. Den eneste komponent som er isolert, og som er assosiert utvetydig med den infeksiøse virkning, er et sialoglykoprotein som er kalt "scrapie prion protein" (Prp<Sc>).
Påfølgende genetiske undersøkelser, utført på dette protein, tilveiebragte overraskende informasjon. Noen DNA-søkere, syntetisert i henhold til N-terminalsekvensen til proteinet, har gjort det mulig å påvise nærvær av et kromosomalt gen i individuelt kopi, som utviser det samme restriksjonsmønster, både i hjernene på friske dyr og i hjernene på infiserte dyr. Dette gen, som er observert til og med i meget forskjellige arter, koder et protein kalt cellulært prion protein (PrP<c>), med en tilsynelatende molekylvekt på 33-35,0 kilodalton (kd), som viser spesielt klart forskjeller med hensyn på PrP<Sc>: 1) PrP<c>er påvirkelig av protease, mens<p>rP<Sc>er motstandsdyktig. Spesielt, mens PrP<c>degraderes fullstendig av enzymet proteinase K, hydrolyseres PrP<Sc>på nivået til N-terminalen for et fragment på tilnærmet 5 kd, og gir opphav til et protein som er kalt PrP27_3o«Denne form renses sammen med infeksiøsitet og er den mest forekommende komponent som er oppnådd i preparater med infeksiøst materiale.2) Både PrP<c>og PrP<Sc>er membranproteiner, men mens den første oppløses ved behandling med rensemidler, har den andre tendens til å polymerisere til amyloide fibrøse strukturer. Lignende strukturer (scrapiesyke-assosierte fibriller, SAF) er funnet i infiserte hjerner og er spesielle ved denne infek-sjonstype. Dette infeksiøse proteins motstand mot inaktivering er uvanlig: det er følsomt, f.eks. for behandlinger med konsentrerte alkaliske oppløsninger eller for eksponering til temperaturer over 120°C og kombinasjon av begge, eller kombinasjoner med forskjellig denaturerende midler. Følgelig er de eneste diagnostiske fremgangsmåter, tilgjengelige for entydig identifikasjon av disse spongiforme encefalopatiene, verifisering av nærvær av SAF i det infiserte cerebrale vev, ekstraksjon og immunokjemisk identifisering av proteinet Pr<P>27_3Q»fremgangsmåter som bare er anvendelig ved patologisk anatomi.
SAF er blitt identifisert i infiserte bovine hjerner, hvor homologen av<p>rP<Sc>ble isolert og viste reaktivitet med et serum oppnådd mot muse-SAF. Videre viste N-terminalsekvensen til de første 12 aminosyrer 100% homologi med PrP<Sc>hos sau, og en forskjell fra den hos mus, hamster og menneske ved et enkelt innskudd av glycin. Så snart det var slått fast at BSE er en "scrapie-liknende" sykdom, reiste det seg viktige spørsmål på epidemiologisk og analytisk nivå, i det siste tilfelle spesielt rettet mot identifisering av proteinet assosierbart med infeksiøsitet.
Den uventede tilstedeværelse av BSE og alle de aspekter som enda må forklares vedrørende disse nevrologiske lidelser, har forårsaket at problemet er gitt den nødvendige oppmerksomhet, spesielt av dem som er knyttet til fremstilling av produkter avledet fra bovint materiale.
Det kan faktisk ikke være tilstrekkelig å benytte råmaterialer som er sertifisert for næringsmiddelanvendelse, til å oppnå forbindelser eller blandinger av farmasøytisk interesse. Følgelig er det nødvendig å utvikle en produksjonsprosess for angjeldende produkter ved å anvende ekstraksjonsmetoder som garanterer eliminasjon av proteinet som er assosiert med infeksiøsitet og infeksiøsiteten i seg selv. Det er klart at fremgangsmåten for ekstraksjon av den infeksiøst aktive fraksjon samtidig skal bevare den biologiske virkning av de aktive prinsipp som er ønskelig som endeprodukt.
Det andre protein som er potensielt farlig for mennesker på dette preparatnivå, er de myeline basisproteiner (MBP).
Det er et protein, som hos mennesker og de fleste vertebrater, har en molekylvekt (MW) på tilnærmet 19,5 kd. Det forefinnes i tre molekylære former i humant myelin og i seks former i musemyelin, det er kodet av et enkelt gen lokalisert på kromosom 18, og det omfatter tilnærmet 30% av det totale myeline protein. Dets nøyaktige topografiske lokalisering er enda ikke sikker. Det er bare blitt observert i cytoplasma i oligodendrocytter på myeliniseringstidspunktet. Et protein som er betraktet som identisk, er tilstede i det perifere nervesystem (protein Pl), og perifert myelins evne til å induse eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) hos laboratorie-dyr skyldes dette.
Ikke hele MPB-molekylet er encefalitogent, men bare en del som varierer fra art til art: hos kanin er den encefalitogene del et aminosyrefragment 64-73, i Lewis-rotten 71-85, i marsvin 113-121, i SJL/J-mus 89-169. EAE er en typisk celleavhengig autoimmunsykdom: den er i virkeligheten overførbar fra ett dyr til et annet ved infusjon av sensitiviserte T-lymfocytter og ikke ved infusjon av serum. I dette tilfelle understøttes sykdommen av transfuserte lymfocytter og ikke av de fra resipienten. En annen celleavhengig autoimmunsykdom er allergisk eksperimentell nevritt (EAN). Også den kan induseres i alle arter av høyere vertebrater ved inokulering av råhomo-genat av perifert myelin i fullstendig Freunds adjuvans. Det er ment at antigenet som hovedsakelig er ansvarlig for denne au to immun i ser ing, er protein P2, med en MW på 12,0 kd, som er til stede i det perifere nervesystem.
En annen kontaminant som må tas i betraktning i disse preparater, er bovint genomisk DNA. Muligheten til å være i stand til å fremstille, ved rekombinant DNA-teknologi, biologisk aktive proteiner som kan anvendes som farmasøytiske midler, har nødvendiggjort analyse av endeproduktene med hensyn på nærvær av DNA-rester, som hører til cellen hvor det ønskede protein er uttrykt. Nærvær av DNA-fragmenter i farmasøytiske preparater som skal benyttes av mennesker reiser problemet med faren for en inkorporasjon av disse fragmenter i genomet, med en mulig ukontrollert overføring av genetisk informasjon. Selv om det enda ikke er mulig å oppnå gangliosider ved rekombinant DNA-teknologi, er det nødvendig å anvende denne type analyse-kontrollteknologi på ekstraksjonsprodukter som bruker råmaterialer av dyrisk opprinnelse.
Til slutt burde gangliosider, som skal anvendes in vitro- og in vivo-undersøkelser, være fri for andre forbindelser, såsom asialogangliosider og glykocerebrosider. Disse stoffer kan ha viktige immunologiske implikasjoner hvis de er til stede i høye konsentrasjoner, og kan også føre til gale eksperimentelle konklusj oner.
Den plutselige opptreden av BSE og alle de andre aspekter som fremdeles må klargjøres vedrørende disse nevrologiske lidelser, har forårsaket at problemet blir gitt nødvendig oppmerksomhet, spesielt av dem som deltar i fremstilling av produkter avledet fra bovint materiale.
Tidligere fremgangsmåter for fremstilling av gangliosider, såsom de sitert ovenfor, krevet at produktet måtte være farmasøytisk akseptabelt, fri for de biologiske kontaminanter som på den tiden var kjent for å være potensielt skadelige for helsen. Den påfølgende opptreden av ovennevnte patologi i voksent kveg har klart gjort det nødvendig å oppnå et aktivt prinsipp som, uten å miste de ovennevnte terapeutiske egenskaper, erkarakterisert vedsikkert fravær av ikke-konvensjonelle virusagens, og må kunne oppnås ved anvendelse av spesifikke fremgangsmåter som garanterer inaktivering av disse ikke-konvensjonelle virusagens, og fullstendig eliminasjon av infeksiøsitet, og ved å anvende spesifikke fremgangsmåter kunne identifisere slike agens. I virkeligheten behøver det ikke være tilstrekkelig å anvende råmateriale som er blitt sertifisert som egnet til menneskeføde, for å oppnå forbindelser eller blandinger av de samme til farmasøytiske formål. Opptreden av BSE må klart vurderes ved å ta hensyn til dens biologiske virkning in vivo, som må betraktes som et eksempel på verifisering av de forskjellige faser i prosessen, men ikke som et sammendrag av de samme. Denne analyse av biologisk virkning in vivo er nødvendig siden vitenskapsmenn ennå ikke er enige i assosiering av infeksjon med visse proteiner, såsom PrP27_3o« De"t er klart at ekstraksjons-prosessen som eliminerer infeksiøs virkning samtidig må bevare den biologiske virkning av det aktive prinsipp, siden dette er essensielt for terapeutisk anvendelse. (Ad hoc arbeidsgruppe vedrørende bioteknologi/farmasi: Validering av fjerning av virus og inaktiveringsfremgangsmåte. Commission of the EuropeanCommunities, mars 1990). Vitenskapelig forskning har frembragt, på én side, fremgangsmåter som garanterer egnede blandinger av gangliosider eller deres enkle fraksjoner, som kan oppnås i former fri for proteiner, kjemiske og biologiske kontaminanter, og på den annen side, fremgangsmåter som viser seg effektive til å ødelegge infeksiøsitet assosiert med "sene virus". Det er imidlertid ikke kjent en metode hvor det er mulig å oppnå, også i industriell målestokk, det tilsvarende ukjente resultat av et produkt, som er ønsket rent, farmakologisk aktivt og fri for infeksiøsitet assosiert med patogene agens definert som "sene virus".
Det er derfor en hensikt med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte som ikke har overnevnte ulemper.
Denne hensikt er oppnådd med den foreliggende oppfinnelse som er kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.
Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter følgende trinn: a) å utsette bovint hjernevev for lipideliminasjon med aceton for å fremstille et acetonpresipitat; b) å suspendere acetonpresipitatet i en første oppløsnings-middelblanding av metylen, metanol og natriumhydroksid; c) å filtrere første oppløsningsmiddelblanding som inneholder nevnte acetonpresipitat for å oppnå en første væskefase; d) å utsette den første væskefase for presipitering ved tilsetting av kalsiumklorid for å oppnå et første råmateriale; e) å oppløse nevnte første råmateriale i vann, kloroform og metanol og å utsette det oppløste første råmateriale for oppvarming ved en pH-verdi på tilnærmet 12 og en temperatur på 38-43°C i minst 4-8 timer; f) å utsette det oppvarmede oppløste første råmateriale til en andre adskilling i en blanding av vann, n-butanol og kloroform; g) å separere den andre adskillelsesblanding for å fjerne en organisk fase og beholde en vandig fase; h) å utsette den vandige fase for presipitering ved tilsetting av aceton og natriumklorid og sentrifugering for å
fremstille et andre råmateriale;
i) å oppløse og oppvarme det andre råmateriale i metanol;
j) å sentrifugere nevnte oppløste og oppvarmede andre
råmateriale for å fremstille en supernatant;
k) å avkjøle nevnte supernatant for å fremstille et tredje
råmateriale;
1) å oppløse det tredje råmateriale i IN natriumhydroksid i
tilnærmet 1 time;
m) å nøytralisere det oppløste tredje råmateriale;
n) å utsette det nøytraliserte oppløste tredje råmateriale for dialyse gjennom en membran med en molekylvekt "cut-off"-verdi på ca. 10 kd for å fremstille en gangliosidblanding;
o) å utsette gangliosidblandingen for tørking for å fremstille gangliosidblanding som sluttprodukt; og
p) å suspendere sluttproduktet gangsliosidblandingen i buffer og sterilisere denne for å fremstille et endelig, sterilisert gangliosidblandingsprodukt.
Fig. 1 er et skjematisk diagram av fremgangsmåten ifølge
oppfinnelsen.
Fig. 2 er et fotografi som viser resultater oppnådd ved anvendelse av anti-PrP27_3oantistoff med Western Blot-teknikken for å analysere noen prøver tatt fra intermediære trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 er et fotografi som viser resultatene fra analyse av bovint genomisk DNA i noen prøver tatt fra forskjellige trinn i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Fig. 4 er et fotografi av resultatene oppnådd ved anvendelse av anti-MBP-antistoff med Western Blot-teknikken, for å analysere noen prøver tatt fra intermediære trinn i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Fig. 5 er et fotografi av resultatene av silikagelkromatografi-analyse av gangliosidblandingen fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fig. 6 er et fotografi som viser den biologiske virkning av
gangliosidblandingen fremstilt ifølge oppfinnelsen.
Fig. 7 er et fotografi som viser resultatene fra immunokjemiske analyser med anti-PrP27_30-antistoff i prøver tatt fra intermediære trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Målet med den foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe et produkt, som erkarakterisert vedfravær av "sene viruser", oppnådd ved en fordelaktig fremgangsmåte som kan anvendes til industriell produksjon, og en fremgangsmåte hvor det nyskapende er bygget på en egnet sekvensering av dens forskjellige ekstraksjonsfaser. Denne fremgangsmåte som gjennom de forskjellige faser eliminerer infeksiøse kontaminanter assosierbare med "sene viruser", såsom bovin spongiform encefalopati, og tillater blandingens virkning, som er den terapeutiske virkning av selve produktet, å forbli uforandret. Produktet som avledes fra denne fremgangsmåte utgjøres av en bestemt blanding av gangliosider eller enkelte fraksjoner, oppnådd fra bovin hjerne eller deler av samme.
Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er, med ovenstående begrunnelser, sammensatt av de følgende hovedfaser: a) lipid eliminasjon i bovint hjernevev med aceton; b) suspensjon av et acetonpresipitat i en blanding av metylenklorid/metanol/natriumhydroksid ved en temperatur på mellom 30°C og 35°C i minst 3 h for å skille hydrofobe og hydrofile stoffer; c) oppløsning av presipitatet med vann/kloroform/metanol og natriumhydroksid (pH-verdi 12) ved oppvarming til mellom 38°C og 43°C i 4-8 h; d) oppløsning av presipitatet med IN natriumhydroksid ved værelsestemperatur i minst 1 h; og e) nøytralisering og dialyse av oppløsningen som inneholder gangliosidblandingen gjennom et membran med en MW- eller
molekylvektgrense på 10 kd.
For å illustrere og ikke begrense er det i det følgende beskrevet eksempler på preparater fremstilt fra infiserte bovine hjerner, hvor den spongiforme form av encefalopati ble påvist, eller fra proteinråmaterialer oppnådd fra uinfiserte bovine hjerner, til hvilke konstante mengder av infisert materiale fra scrapie-stammen 263K er tilsatt.
Materialer og metoder
De bovine hjerner som ble anvendt ved fremgangsmåter for ekstraksjon av gangliosidblandingen, viste, ved histologisk analyse, fibriller som typisk tilhører vevsmaterialer fra dyr med infeksjon.
Fremstillingseksempler
Eksempel 1
Et diagram av fremgangsmåten for fremstilling er vist på fig. 1.
1000 g infisert bovin hjerne, malt og suspendert i destillert vann, ble etterlatt i kontakt med 300-600 ml aceton
(vekt/volum-forhold 1:5) i tilnærmet 3 h ved værelsestemperatur under omrøring. Oppløsningen ble deretter sentrifugert med 6000 x g ved en temperatur mellom 7°C og 4°C inntil utfelling var fullstendig. Oppløsningsmiddelet ble deretter fjernet og 180-350 ml av en blanding av metylenklorid/metanol/natriumhydroksid ble satt til det våte pulver som var plassert i en egnet glassbeholder, og ble igjen etterlatt under magnetisk omrøring i minst 3 h ved en temperatur mellom 30°C og 35°C. Den ble til slutt avkjølet og deretter sentrifugert i 20 min med 6000 x g ved +10°C. Væskefasen ble filtrert gjennom en filtertrakt ved en temperatur på +24°C. En egnet mengde av kalsiumklorid og aceton ble satt til væsken, som ble etterlatt i tilnærmet 30 min under omrøring og sentrifugert med 6000 x g ved +10°C. Presipitatet (råmateriale 1) ble til slutt tørket natten over og deretter i 5 h i høyt vakuum. Restituert råmateriale 1 ble resuspendert i 10-18 ml av en blanding av vann/kloroform/metanol. pH-verdien ble justert til tilnærmet 12 med 5N NaOH. Det hele ble oppvarmet til mellom 38° og 43°C fra4til 8 h og etterlatt under omrøring. Etter å ha blitt avkjølt ble blandingen til slutt nøytralisert med 6N HC1 og den nødvendige mengde vann/n-butanol/kloroform ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 15-30 min og latt stå mellom 2 og 4 h. Til slutt ble den lavere organiske fase kastet, aceton og natriumklorid ble satt til de gjenværende vandige faser, omrørt i tilnærmet 3 0 min og sentrifugert i 20 min med 6000 x g ved +15°C (råmateriale 2).
Produktet ble tørket i høyt vakuum, resuspendert i 6-15 ml absolutt metanol og deretter holdt hett i tilnærmet 2 h med omrøring av oppløsningen fra tid til annen. Suspensjonen ble deretter hurtig sentrifugert med 6000 x g og supernatanten plassert i en fryser i tilnærmet 2 h. Den opalescerende hvite oppløsning ble deretter sentrifugert ved 0°C med 600x g og presipitatet tørket i høyt vakuum. Produktet ble samlet i IN natriumhydroksid og latt være i kontakt med oppløsningen i minst 1 h ved værelsestemperatur. Endelig ble suspensjonens pH-verdi justert til en tilnærmet pH-verdi på 9 og dialysert med en membran som har en MW-grense på 10 kd, mot et egnet volum av destillert vann. En egnet mengde natriumklorid og aceton ble tilsatt og blandingen sentrifugert ved +5°C med 6000 x g og tørket i høyt vakuum (sluttprodukt). Prøven ble tatt opp i 10 mM fosfatbuffer, pH-verdi 7,2 og sterilisert ved +121°C i
3 0 min (sterilisert sluttprodukt).
Evaluering av fremgangsmåte
Som forklart ovenfor er et viktig aspekt i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tilveiebringelse av et gangliosid-produkt som er fritt for uønskede kontaminanter, spesielt fritt for ikke-konvensjonelle virus. For å evaluere fremgangsmåten ble prøver tatt på forskjellige trinn i fremgangsmåten og testet for mulig kontaminering.
Fremgangsmåten og resultatene av biologisk/klinisk testing er som følger:
Biologisk test for scrapie ( skrapesyke):
Dyrene anvendt i disse eksperimenter var hamstere (Golden Syrian, LVG/Lak). Infeksjonstester ble utført på grupper av fire avvente hundyr som hadde mottatt intracerebral (i.c.) inokulasjon med 0,05 ml av prøvene, fortynnet ti ganger i sterilt PBS. De intracerebrale inokulasjoner ble utført av trenet personale som anvendte engangs glassprøyter med 26G, 3/8-tommers sterile nåler.
Det steriliserte sluttprodukt, konsentrert 20 ganger, ble anvendt nøyaktig som følger:
4,0 ml injisert intracerebralt i 40 dyr
3,0 ml fortynnet 1:20 og injisert, ufortynnet, intracerebralt i 50 dyr og i.p. i 22 dyr. Volumet injisert i.p. var 2,5 ml.
Dyrene ble to ganger i uken eller mer, i en periode på 12 måneder, undersøkt for utbrudd av karakteristiske nevrologiske, kliniske symptomer. Opptreden av tidlige symptomer i hvert dyr ble registrert, og dyrene ble avlivet når sykdommen var vel etablert. Deres hjerner ble delt i to halvdeler, en fiksert i 10% formalin og den andre preservert ved -70°C. Patologisk diagnose ble gitt for alle dyr som døde av mistenkelige årsaker og de som hadde vist tegn på nevrologisk sykdom. Ved slutten av observasjonstiden ble alle overlevende dyr avlivet og en patologisk vurdering av deres hjerner ble foretatt.
Infeksjonstiter ble beregnet på "endelig avslutningspunkt" i henhold til fremgangsmåten til Reed og Munch, og er uttrykt som log LD50/ml.
Følgende prøver ble testet, idet produktene ble navngitt som vist på fig. 1: Alle prøver ble resuspendert i sterilt PBS i følgende volum, beregnet slik at en homogen titer pr. volum, sammenlignet med 16,7% (vekt/volum) homogenat som utgangsmateriale, ble sikret:
Resultater av de biologisk/kliniske tester er vist i tabell l.
Tilleggsevalueringer:
Bestemmelse av skrapesyke-protein PrP er foretatt ved hjelp av polyklonale antistoffer, spesifikke for den rensede protein-analog fra musehjerne, og som kryssreagerer med skrapesyke-Prp av bovin opprinnelse. Western Blot-metoden ble anvendt for bestemmelsen. Nærvær av skrapesyke-PrP ble evaluert ved sammenligning med standarder for proteiner med forskjellige molekylvekter.
Bestemmelse av MBP-proteinet ble foretatt ved hjelp av polyklonale antistoffer spesifikke for den rensede protein-analog fra bovint cerebralt vev. Fremgangsmåten benyttet for bestemmelsene var Western Blot. Nærvær av MBP ble evaluert ved sammenligning med standarder for proteiner med forskjellige molekylvekter.
Bestemmelse av det bovine genomiske DNA ble utført ved
DOT BLOT-teknikken, på prøver tatt på forskjellige trinn i fremgangsmåten, i henhold til en fremgangsmåte kjent for fagfolk. For å vurdere prøven som valid skal nærvær av flekker ikke kunne konstateres i avsetningen av heterolog DNA. Fravær av flekker i prøvene, undersøkt ved radioautografi, viser fravær av bovint genomisk DNA.
Fig. 2 viser resultatene bestemt ved immunokjemisk analyse med anti-PrP27-3o~antist°ff av prøver tatt fra noen intermediære trinn i fremstilling og rensing av gangliosid. Nummerkodene til de analyserte prøver tilsvarer numrene i parentes, gitt i rensediagrammet på fig. 1.
Felt 1: kode 1 prøve
Felt 2: kode 2 prøve
Felt 3: kode 3 prøve
Felt 4: kode 4 prøve
Felt 5: kode 5 prøve
Felt 6: sluttprodukt
Felt 7: protein med standard molekylvekt (kd er nedover som
følger: 97,4, 66,2, 45,0, 31,0, 21,5)
Bånd merket med stjerne betegner ikke spesifikke kryss-reaksjoner som tilskrives forsterkningssystemet til analysen.
Fig. 3 viser analyse av bovint genomisk DNA ved hjelp av DOT BLOT-teknikken på prøver tatt fra forskjellige trinn i fremgangsmåten.
Skjæringspunktet av bokstaver med tall angir:
Standardkurver Undersøkte prøver
Punktene for standardkurven og de analyserte prøver er gitt i duplikat.
Fig. 4 viser resultater fra immunokjemisk analyse med anti-MBP-antistoff av prøver tatt fra noen intermediære trinn i fremstilling og rensing. Prøvekoden korresponderer med numrene angitt i rensediagrammet på fig. 1.
Felt 1: kode 1 prøve
Felt 2: kode 2 prøve
Felt 3: kode 3 prøve
Felt 4: kode 4 prøve
Felt 5: kode 5 prøve (råmateriale 1)
Felt 6: rå 2 prøve
Felt 7: kode 6 prøve
Felt 8: rå 3 kode prøve
Felt 9: sluttprodukt
Felt 10: sterilisert sluttprodukt
De forskjellige former av MBP, gjenkjent av de anvendte polyklonale antistoffer, er i parenteser.
Fig.5viser resultatene fra kromatografi på silikagel av de følgende prøver (også i henhold til fremgangsmåten skissert på fig. 1):
Felt l: sterilisert sluttprodukt
Felt 2: sluttprodukt
Felt3: standard av trisialogangliosid GTlb
Felt 4: standard av disialogangliosid GD-^-,
Felt 5: standard av disialogangliosid GDla
Felt 6: standard av monosialogangliosid GM^_
Fig.6er et fotografisk eksempel for å vise den biologiske virkning av gangliosidblandingen fremstilt i henhold til oppfinnelsen (pilene angir spiringen (sprouting)) på en perifer nerve. Fig.7viser resultater fra immunokjemisk analyse med anti-PrP27_3o~antistoff av prøver tatt fra noen intermediære trinn i rensing og fremstilling av gangliosider. Koden på de analyserte prøver korresponderer med tallene angitt i rensediagrammet på fig. 1.
Felt 1: oppløsning av råmateriale 1 som er blitt tilsatt 1,5
mikrogram/ml av PrP27_3o
Felt 2: råmateriale 2 kode prøve
Felt 3: kode 6 prøve
Felt 4: råmateriale 3 kode prøve
Felt 5: sluttprodukt
Felt 6: sterilisert sluttprodukt
Eksempel 2
Fremstilling av et klaret homogenat fra infiserte hjerner
Fire hamsterhjerner, infisert med skrapesykestamme 263 K, tilsvarende en nettovekt på 3,9 g, ble homogenisert i 10 ml destillert vann. Volumet ble deretter bragt opp til 15,5 ml for å oppnå et homogenat på 25% (vekt/volum). Suspensjonen ble sentrifugert i 40 min med 1800 x g ved 4°C: 7,5 ml av supernatanten ble gjenvunnet, delt i porsjoner og holdt ved
-70°C inntil anvendelse.
Fremstilling av provene
5 ml av det infiserte homogenat, 120 ml av metanol/metylen-klorid og 0,71 ml av 5,7 N natriumhydroksid ble satt til 10 g acetonpulver fra bovine hjerner. Denne tilsetning ble foretatt for å holde det totale volum av den vandige fase i oppløsningen konstant og for å oppnå de mest egnede arbeidsbetingelser. Den endelige titer til utgangsoppløsningen var 1% (vekt/volum). Suspensjonen ble magnetisk omrørt i 3 h ved en temperatur på 33°C. Den ble deretter avkjølt og sentrifugert i 20 min med 6000 x g ved 10°C. Væskefasen ble filtrert gjennom en Gooch-trakt (porestørrelse nr. 3) ved en temperatur på +4°C for å unngå fordampning av oppløsningsmidlene; på slutten av dette trinn ble 78 ml av væskefasen gjenvunnet. En 2 ml's porsjon ble holdt igjen for biologiske analyser. Begge porsjoner ble tilsatt et passende volum av kalsiumklorid og aceton, og etter magnetisk omrøring i tilnærmet 3 0 min ved værelsetemperatur ble prøvene sentrifugert i 10 min med 6000 x g ved 10°C. Presipitatet (råmateriale 1) ble tørket i en hette natten over og deretter i 2 h under høyt vakuum. En porsjon ble holdt ved
-70°C for å brukes til biologisk analyse.
925 mg råmateriale 1, gjenvunnet fra reaksjonsbeholderen, ble resuspendert i 18,5 ml av en blanding av kloroform/metanol/vann og 0,74 ml av homogenatet for å oppnå en titer på 1% (vekt/- volum). pH-verdien ble justert til tilnærmet 12 (vurdert med lakmuspapir) ved å tilsette 5N NaOH, og blandingen ble magnetisk omrørt ved 40°C i 6 h. Etter avkjøling til værelsestemperatur ble oppløsningen nøytralisert med 6N HC1 og en porsjon på 250 jul ble holdt igjen for å brukes til biologisk analyse.
Begge porsjoner ble behandlet med et egnet volum av n-butanol/- kloroform/vann og etter omrøring i 15 min ble de latt stå i 4 h. Til slutt ble de lavere organiske faser kastet. De gjenværende vandige faser ble tilsatt natriumklorid og aceton, og etter magnetisk omrøring ved værelsestemperatur i tilnærmet 3 0 min ble de sentrifugert i 10 min med 6000 x g ved 15°C (råmateriale 2).
Dette produkt ble tørket i høyt vakuum og den porsjon som ble satt til side for biologisk analyse ble preservert ved -70°C. Det gjenværende materiale ble resuspendert i 6,5 ml absolutt metanol og etterlatt ved 50°C i 2 h under tidvis omrøring. Suspensjonen ble raskt sentrifugert med 6000 x g og supernatanten plassert i en fryser ved -20°C i 2 h. Den kalde, hvite, opalescerende oppløsning ble deretter sentrifugert ved 0°C med 6000 x g i 5 min og presipitatet ble tørket i høyt vakuum. Utbyttet på dette punkt var 6 mg av produktet. Dette ble deretter resuspendert i 500 fil natriumhydroksid, 460 fil destillert vann og 40 fil homogenat og latt være i kontakt med denne oppløsning i 1 h ved værelsestemperatur. Til slutt ble pH-verdien i denne suspensjon justert til tilnærmet 9 (vurdert med lakmuspapir) og dialysert med en membran med en MW-grense på 10 kd i 4 h mot 20000 volumenheter destillert vann. Det endelige volum etter dialyse var 980 fil. Det ble delt i to porsjoner på henholdsvis 500 fil og 480 fil; til den første ble det satt et nødvendig volum av natriumklorid og aceton og den ble sentrifugert i 10 min med 6000 x g ved 5°C. Denne prøve ble tørket i høyt vakuum (sluttprodukt).
Den andre porsjon ble tilsatt 20 ml homogenat og 50 fil PBS 10x, og den ble sterilisert ved 121°C i 30 min (sterilisert sluttprodukt).
Evaluering av fremgangsmåten
Som beskrevet ovenfor for eksempel 1 ble prøver tatt fra de forskjellige trinn i fremgangsmåten testet for potensielt nærvær av kontaminanten.
Prøvene ble testet og resultatene er som følger:
Alle prøvene ble oppsamlet i steril PBS i følgende volumer, beregnet slik at de sikrer en homogen titer pr. volum sammenlignet med 1% (vekt/volum) homogenat som utgangsmateriale:
Tabell 2 viser resultatene oppnådd ved biologisk analyse.
Eksempel 3
Biologisk virkning av qanqliosidblandinq
En serie med eksperimenter ble utført in vitro for å verifisere om gangliosidblandingen (oppnådd i henhold til den ovennevnte fremgangsmåte) utviste noen biologisk virkning som kan forutsi terapeutisk anvendelse til å behandle patologiske tilstander i det perifere nervesystem (PNS) og i det sentrale nervesystem (CNS). Spesielt ble virkningen av gangliosider testet in vitro for å vurdere nevrittdannelsen i kulturer av nevroblastom-celler (N2A). Disse celler kan, som beskrevet i litteraturen (Denis - Donini et al., Neuronal Development, part II, 323:348 - Academic Press, NY 1980; Leon et al., Dev. Neurosci. 5:108, 1982) indusere, under visse betingelser, ekspresjon av forskjellige funksjoner som er karakteristiske for modne neuroner, for derved å tillate kvalitativ og kvantitativ analyse av biokjemiske parametre korrelert med hvert utvik-lingstrinn.
Derfor er vurderingene foretatt i denne modell (% celler med nevrittdannelse, nevrittlengde og relativ forgrening) effektive instrumenter til å undersøke mulig terapeutisk anvendelse av et legemiddel til funksjonell restitusjon av nervesystemet.
Materialer og metoder
Cellekulturer
Museceller, C 1300, klon N2A, levert av America Cell Type Collection (Bethesda, Maryland), ble sådd i en konsentrasjon på 10 000 celler pr. brønn (24-castor) i nærvær av Dulbeccos modifisert Eagle medium (DMEM) som inneholder P/G
(100 U.penicillin/ml) og 10% føtalt kalveserum (FCS fra Seromed, porsjon 4-C04).
Neste dag ble kulturmediet forandret med det samme volum friskt medium som inneholdt gangliosider (se videre). Kulturene ble holdt ved 37°C i 5% C02i en fuktet atmosfære (Haerus-inkubator). Kulturene ble deretter fiksert med 2% glutaraldehyd ved det angitte tidspunkt (24 h senere).
Fremstillin<g>av testoppløsnin<q>er av produktet
Gangliosidblandingen (3 forskjellige porsjoner, nr. 1-2-3) ble oppløst i kloroform/metanol 2:1, tørket i en nitrogenstrøm, resuspendert i DMEM + P/G + 10% FCS inntil de ønskede konsentrasjoner ble oppnådd.
Konsentrasjoner undersøkt: 1 x 10~<4>M; 5 x 10~<5>M og1x 10~<5>M.
Fire forskjellige eksperimenter ble utført som følger:
tre eksperimenter for å vurdere virkningen av gangliosid blandingen (porsjon nr. 1 og 2) ved en konsentrasjon på 1 x 10"<4>M
ett eksperiment for å vurdere dose/respons-virkningen til forskjellige konsentrasjoner (1 x 10~<4>,5x10~<5>og 1 x 10~<5>M) av gangliosidblandingen under undersøkelsen (porsjon nr. 3).
Fremgangsmåte
Mediet ble trukket opp av brønnene og substituert med 350/il DMEM + P/G + 10% FCS + produkt under utprøving (i de ovennevnte konsentrasjoner).
Kontrollkulturene ble behandlet på samme måte, uten tilsetning av gangliosidblanding. Kulturene ble deretter holdt i en inkubator i 24 h, hvoretter cellene ble fiksert med 2% glutaraldehyd og observert under et mikroskop.
Parametre
Morfologisk undersøkelse utført for å vurdere:
prosentvis (%) andel av celler med nevritter lengde av nevritter og relativ forgrening.
Resultater
Som rapportert i tabell 3 er det klart at produktene under undersøkelse er virkningsfulle (1 x 10~<4>M) til å indusere dannelse av nevritter i N2A-celler.
Virkningen av gangliosidblandingen er doseavhengig med maksimum virkning ved en dose på 1 x 10-<4>M (tabell 4).
Tabell 3
Virkning av gangliosidblanding (porsjon 1, 2) på nevrittdannelse i musenevroblastoma N2A-celler.
Alle produkter ble satt til cellene i en endelig konsentrasjon på 1 x 10~<4>M, og morfologisk evalueringer ble foretatt 24 h senere.
Statistisk vurdering av data på biologisk virkning in vitro angir at det er ingen signifikant forskjell mellom de forskjellige porsjoner av gangliosidblanding (tabell 5).
Tabell 5
Total statistisk vurdering av data oppnådd med porsjoner 1 og 2. Verdiene rapportert er gjennomsnittsverdi av ni uavhengige tester ± S.D.
Videre viser morfologisk vurdering av nevrittene at celler behandlet med gangliosidblanding viser lange, bemerkelsesverdig forgrenede nevritter (dvs. markert forgrening).
Konklusjoner
De ovennevnte observasjoner bekrefter derfor at gangliosidblandingen som ble undersøkt har en biologisk virkning, idet produktet, oppnådd ved en fremgangsmåte som garanterer dets spesielle egenskaper, virkelig kan indusere nevrittdannelse i N2A-celler. Dette faktum angir at produktet er effektivt ved tilheling av det perifere og sentrale nervesystem. Blanding av gangliosider, oppnådd som beskrevet og fri for kontaminanter assosiert med potensielt farlige, ikke-konvensjonelle virus, kan også anvendes til fremstilling av individuelle komponenter eller gangliosidblandingen, såsom monosialogangliosid GM^
I lys av de farmakologiske egenskaper beskrevet ovenfor kan gangliosidblandingen generelt anvendes som et legemiddel ved tallrike patologiske tilstander (med forskjellige etiopatogene årsaker) i både det perifere og sentrale nervesystem. Spesifikke tilstander som kan behandles er: retrobulbær optisk nevritt, paralyse av de oculomtoriske nerver, trigenimus-neuralgi, paralyse av nervus facialis og Bells paralyse, Garcins syndrom, radiculitt, traumatiske lesjoner av de perifere nerver, diabetisk og alkoholisk polynevritt, obste-tretisk paralyse, paralyttisk isjias, motorneuron-sykdommer, amyotropisk lateral sclerose, myelopatisk muskulær atrofi, progressiv bulbær paralyse, myastenia gravis og Eaton-Lambert-syndrom, muskulær dystrofi, svekkelse i synaptisk nerveover-føring i CNS og PNS, bevissthetsdefekter såsom konfusjon, konkusjon, trombose, cerebral embolisme, cerebrale og spinale traumer.
Administrering skjer vanligvis ved intramuskulær, subkutan eller intravenøs injeksjon, eller transdermalt, pulmonalt eller oralt, fortrinnsvis i passende bufrede vandige opp-løsninger. Sikker lagring av det farmasøytiske preparat kan oppnås ved å fremstille det i form av små flasker som inneholder oppløsninger av produktet, muligvis sammen med andre hjelpeingredienser, som angitt i eksemplene på farmasøytiske preparater rapportert nedenunder. For terapeutisk eller mulig også preventiv anvendelse av den ovennevnte parenterale måte varierer dosene fortrinnsvis mellom 10 mg og 100 mg/dag av aktivt stoff.
Det er klart at oppfinnelsen som er blitt beskrevet kan varieres på mange måter. Slike variasjoner skal ikke betraktes som et avvik fra ideen og rekkevidden av oppfinnelsen, og alle slike modifikasjoner som ville være selvsagte for en fagmann, skal inkluderes innenfor rekkevidden av de følgende krav.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en blanding av gangliosider,karakterisert vedat den omfatter: a) å utsette bovint hjernevev for lipideliminasjon med aceton for å fremstille et acetonpresipitat; b) å suspendere acetonpresipitatet i en første oppløsnings-middelblanding av metylen, metanol og natriumhydroksid; c) å filtrere første oppløsningsmiddelblanding som inneholder nevnte acetonpresipitat for å oppnå en første væskefase; d) å utsette den første væskefase for presipitering ved tilsetting av kalsiumklorid for å oppnå et første råmateriale; e) å oppløse nevnte første råmateriale i vann, kloroform og metanol og å utsette det oppløste første råmateriale for oppvarming ved en pH-verdi på tilnærmet 12 og en temperatur på 38-43°C i minst 4-8 timer; f) å utsette det oppvarmede oppløste første råmateriale til en andre adskilling i en blanding av vann, n-butanol og kloroform; g) å separere den andre adskillelsesblanding for å fjerne en organisk fase og beholde en vandig fase; h) å utsette den vandige fase for presipitering ved tilsetting av aceton og natriumklorid og sentrifugering for å fremstille et andre råmateriale; i) å oppløse og oppvarme det andre råmateriale i metanol; j) å sentrifugere nevnte oppløste og oppvarmede andre råmateriale for å fremstille en supernatant; k) å avkjøle nevnte supernatant for å fremstille et tredje råmateriale;
1) å oppløse det tredje råmateriale i IN natriumhydroksid i tilnærmet 1 time; m) å nøytralisere det oppløste tredje råmateriale; n) å utsette det nøytraliserte oppløste tredje råmateriale for dialyse gjennom en membran med en molekylvekt "cut-off"-verdi på ca. 10 kd for å fremstille en gangliosidblanding; o) å utsette gangliosidblandingen for tørking for å fremstille gangliosidblanding som sluttprodukt; og p) å suspendere sluttproduktet gangsliosidblandingen i buffer og sterilisere denne for å fremstille et endelig, sterilisert gangliosidblandingsprodukt.
NO912780A 1989-11-17 1991-07-16 Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus NO175311C (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT4174789A IT1236594B (it) 1989-11-17 1989-11-17 Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi
IT04171690A IT1243295B (it) 1990-10-18 1990-10-18 Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali
PCT/EP1990/001960 WO1991007417A1 (en) 1989-11-17 1990-11-16 Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO912780L NO912780L (no) 1991-07-16
NO912780D0 NO912780D0 (no) 1991-07-16
NO175311B true NO175311B (no) 1994-06-20
NO175311C NO175311C (no) 1994-09-28

Family

ID=26329145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO912780A NO175311C (no) 1989-11-17 1991-07-16 Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5521164A (no)
EP (1) EP0454818B1 (no)
JP (1) JP3140458B2 (no)
KR (1) KR0177820B1 (no)
CN (1) CN1027895C (no)
AT (1) ATE169926T1 (no)
AU (1) AU649635B2 (no)
CA (1) CA2045142C (no)
DE (1) DE69032578T2 (no)
ES (1) ES2119747T3 (no)
FI (1) FI97138C (no)
HK (1) HK1013294A1 (no)
HU (2) HU210145B (no)
IE (1) IE904135A1 (no)
IL (1) IL96346A (no)
IN (1) IN171530B (no)
NO (1) NO175311C (no)
NZ (1) NZ236059A (no)
PE (1) PE25491A1 (no)
PT (1) PT95917B (no)
WO (1) WO1991007417A1 (no)
YU (1) YU218790A (no)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1235161B (it) * 1988-12-02 1992-06-22 Fidia Farmaceutici Derivati di lisogangliosidi
JPH05508396A (ja) * 1991-05-16 1993-11-25 フィディーア・ソシエタ・ペル・アチオニ 非従来型ウイルスによる汚染を含有しないグリコスフィンゴ脂質混合物の生産及び精製方法
IT1260149B (it) * 1992-04-17 1996-03-28 Fidia Spa Metodo per la preparazione e purificazione di miscele di fosfolipidi prive di contaminanti da virus non convenzionali
US6458761B2 (en) 1999-11-24 2002-10-01 Lore Maria Klett-Loch Synthetic, statistic thymic peptide combination and its use as a preparation with immunological and/or endocrinological effect
EP1295612B1 (en) * 2000-02-24 2006-12-06 Menicon Co., Ltd. Use of a treating solution for inactivating prions
EP1435972B1 (en) 2001-08-29 2016-03-09 Seneb Biosciences Inc. Novel synthetic ganglioside derivatives and compositions thereof
EP1603932B1 (en) 2003-03-06 2012-10-03 Seneb Biosciences Inc. Methods and compositions for the enzymatic synthesis of gangliosides
US7066261B2 (en) * 2004-01-08 2006-06-27 Halliburton Energy Services, Inc. Perforating system and method
WO2010062197A1 (en) * 2008-11-25 2010-06-03 Eduard Nekrasov Dairy product and process
US20120035120A1 (en) 2009-03-25 2012-02-09 Seneb Biosciences, Inc. Glycolipids as treatment for disease
CN101838295B (zh) * 2010-04-14 2015-02-25 李桂凤 一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺
US8710385B2 (en) 2012-05-07 2014-04-29 Robert Butch Sickels Reliability fire pressure switch
CN105111253B (zh) * 2015-09-18 2018-01-12 重庆寰瑞生物技术有限公司 一种提取分离神经节苷脂的方法
CN109320566B (zh) * 2018-08-14 2022-03-15 四川兴杰象药业有限公司 一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3346413A (en) * 1964-10-12 1967-10-10 Hooker Chemical Corp Method and apparatus for coating wire and solvent recovery
ES528692A0 (es) * 1984-01-04 1985-07-01 Bioiberica Procedimiento para la obtencion de un complejo glicoesfingolipidico
JPS60181019A (ja) * 1984-02-28 1985-09-14 Mitsui Toatsu Chem Inc ガングリオシドの抽出方法
IT1177863B (it) * 1984-07-03 1987-08-26 Fidia Farmaceutici Una miscela gangliosidica come agente terapeutico capare di eliminare il dolore nele neuropatie periferiche
JPS61180719A (ja) * 1985-02-06 1986-08-13 Mitsui Toatsu Chem Inc ガングリオシドの取得方法
US4710490A (en) * 1985-10-01 1987-12-01 Angio Medical Corporation Compositions containing ganglioside molecules with enhanced angiogenic activity
IT1223408B (it) * 1987-12-09 1990-09-19 Crinos Industria Farmaco Procedimento per la preparazione di monosialoganglioside

Also Published As

Publication number Publication date
HU210145B (en) 1995-02-28
PT95917B (pt) 1998-04-30
ES2119747T3 (es) 1998-10-16
AU6727590A (en) 1991-06-13
DE69032578D1 (de) 1998-09-24
IL96346A (en) 1997-06-10
IN171530B (no) 1992-11-07
NO912780L (no) 1991-07-16
PT95917A (pt) 1991-09-13
CN1027895C (zh) 1995-03-15
JPH04503076A (ja) 1992-06-04
NO175311C (no) 1994-09-28
AU649635B2 (en) 1994-06-02
HUT58754A (en) 1992-03-30
FI97138C (fi) 1996-10-25
IE904135A1 (en) 1991-05-22
YU218790A (sh) 1993-10-20
NO912780D0 (no) 1991-07-16
WO1991007417A1 (en) 1991-05-30
ATE169926T1 (de) 1998-09-15
CA2045142A1 (en) 1991-05-18
US5521164A (en) 1996-05-28
NZ236059A (en) 1993-03-26
DE69032578T2 (de) 1999-04-29
PE25491A1 (es) 1991-09-12
JP3140458B2 (ja) 2001-03-05
EP0454818B1 (en) 1998-08-19
KR0177820B1 (ko) 1999-04-01
CA2045142C (en) 2000-07-18
EP0454818A1 (en) 1991-11-06
CN1053067A (zh) 1991-07-17
FI97138B (fi) 1996-07-15
HK1013294A1 (en) 1999-08-20
HU912391D0 (en) 1991-12-30
FI913454A0 (fi) 1991-07-17
IL96346A0 (en) 1991-08-16
KR920701225A (ko) 1992-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO175311B (no) Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av en blanding av glykosfingolipider fri for kontaminasjon av ikke-konvensjonelle virus
Rigney et al. Pathogenicity of Aeromonas hydrophila in red leg disease in frogs
US5330975A (en) Bacterial toxin neutralizer
EP0638083B1 (en) Method for the preparation and purification of phospholipid mixtures free from contamination by unconventional viruses
Bessler et al. Protein I and protein II from the outer membrane of Escherichia coli are mouse B-lymphocyte mitogens
EP0539380B1 (en) Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses
AU2002257295B2 (en) Destruction of prions using vibriolysin or variants thereof
CA2087158A1 (en) Method for the preparation and purification of a mixture of glycosphingolipids free from contamination by non-conventional viruses
RU2132688C1 (ru) Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей
Sutanto et al. The Potential of Snail Seromucous and Chitosan as Bioimunomodulator for Tuberculosis Therapy
IT9041716A1 (it) Metodo per la preparazione e purificazione di una miscela di glicosfingolipidi priva di contaminanti da virus non convenzionali
RU2797514C1 (ru) Фармакологическая субстанция мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов, выделенных из различных тканей и биологических жидкостей животных
WO2021090911A1 (ja) タンパク質凝集塊を含有する細胞を選択的に死滅させる方法、そのキット、タンパク質ミスフォールディング病治療薬及び血液製剤からのタンパク質凝集塊除去製剤
EA010739B1 (ru) Средство, нормализующее функции головного мозга, и способ его получения
CN118045161A (zh) 林蛙抗菌肽浓缩液在制备抗支原体的药物中的应用
GB2601226A (en) Method for the preparation of water soluble eggshell membrane derived peptides
Minor The challenge for the public health system
Minor The Challenge for the Public Health System
Anders Pathology: Human Prion Diseases
Lupi Prions
CN109288823A (zh) 白皮杉醇在制备治疗朊病毒引起疾病药物中的用途
Prusiner et al. Prions causing transmissible neurodegenerative diseases
Lee Toll-Like Receptors and Neuroinflammation
Hakenbeck et al. Pneumolysin Is the Main Inducer of

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees