CN105111253B - 一种提取分离神经节苷脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域，公开了一种提取分离神经节苷脂的方法。本发明所述方法将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热搅拌提取，然后提取液经搅拌降温，过滤获得沉淀物I；沉淀物I加热溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在搅拌条件下进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得沉淀物II；沉淀物II用有机溶剂II加热搅拌洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂。本发明提供了一整套全新提取工艺，整个工艺采用低毒溶剂体系来实现从哺乳动物神经组织中提取和分离神经节苷脂。该方法对操作人员健康隐患和环保隐患小，整个过程不含水，溶剂可完全回收套用，不涉及废液的产生、环保处理及排放；同时，该方法神经节苷脂的收率和纯度较高。

Description

一种提取分离神经节苷脂的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体的说是涉及一种提取分离神经节苷脂的方法。

背景技术

神经节苷脂是最复杂的鞘糖脂，微量地存在于脊椎动物几乎所有的组织中，但在哺乳动物的大脑和脊髓组织中含量最高，约含0.3％左右(Robert W.Ledeen,Robert K.Yu，Methods in Enzymology.1982,83:139-191)。哺乳动物脑和脊髓组织中主要的神经节苷脂为GM1、GD1b、GD1a和GT1b等。神经节苷脂分子的生理功能主要包括：1)作为膜脂质双层和细胞糖萼的组分；2)维持膜表面负电荷；3)参与细胞识别与信号传递；4)保护缺血(氧)性神经损害等(唐向东，生命的化学，1995，15(2)，32-34)。神经节苷脂呈乳白色粉末状，无味，具吸湿性，可溶于水，在水溶液中呈高度规律性的球形聚合体，也可溶于甲醇-水溶液和甲醇-氯仿溶液，微溶于甲醇，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯及乙醇，平均分子量为1800Da左右。

伴随神经节苷脂生理功能及药用价值的不断研究与应用，从机体组织中提取分离神经节苷脂的方法也不断获得研究和发展。如J.Folch,M.Lees,and G.H.Sloane Stanley,J Biol Chem,1957,226(1):497–509；Suzuki K.J Neurochem.1965,12(7):629-638；Tettamanti G,Bonali F,Marchesini S,Zambotti V,Biochim Biophys Acta.1973,19；296(1):160-170；Phillips F,Privett O S,Lipids,1979,14(6):590-595；SvennerholmL,Fredman P,Biochim Biophys Acta.1980,617(1):97-109；Ledeen R W,Yu R K,MethodsEnzymol,1982,83:139-191；Byrne MC,Sbaschnig-Agler M,Aquino DA,Sclafani JR,Ledeen RW,Anal Biochem,1985,148(1):163-73；Wang WQ,Gustafson A,Acta ChemScand,1995,49(12):929-36；Lydic TA,Busik JV,Reid GE,J Lipid Res,2014,55(8):1797-1809等文献系统描述了从神经组织中提取分离神经节苷脂的方法及发展，这些方法都是基于J.Folch提出的以氯仿-甲醇混合溶剂为组织脂类物质提取溶剂，然后再通过增加水份比例的分配分离法使神经节苷脂与其他脂类物质分离以获得神经节苷脂的经典方法的修正与完善。Díaz RS,Monreal J,Regueiro P,Lucas M,J Neurosci Res.1992,31(1):136-145等文献提出以四氢呋喃为溶剂进行组织脂类物质的提取，然后通过增加乙醚进行两相分配分离获得神经节苷脂。Heitmann D,Lissel M,Kempken R,Müthing J,BiomedChromatogr.1996,10(5):245-250等文献描述了以正丙醇-水(40:10,v/v)和甲基异丁基酮-甲醇-水(40:80:30,v/v/v)混合溶剂体系为提取溶剂替代氯仿-甲醇-水提取溶剂进行组织中神经节苷脂的提取，以期希望规避氯仿溶剂的使用。Schwarz A,Terstappen GC,Futerman AH,Anal Biochem.1997,254(2):221-225；Terstappen GC,Futerman AH,Schwarz A,Methods Enzymol,2000,312:187-196等文献描述用一种叫C14EO6的非离子去垢剂形成胶束进行神经节苷脂的提取分离。国内文献涉及从神经组织中提取分离神经节苷脂的描述几乎都是沿用J.Folch的氯仿/甲醇混合溶剂提取及分配分离法。(朱正美等，上海第一医学院学报,1983,03:234-236；夏霞娟等，生物化学杂志,1985,02:13-17；夏霞娟等，生物化学与生物物理进展,1985,05:27-31；夏霞娟等，上海第一医学院学报,1985,06:467-470；欧阳启楣等，大连医学院学报,1987,01:8-12；崔肇春等，生物化学与生物物理进展,1990,03:206-209；张新波等，生物化学与生物物理进展,1990,03:243-244；陈荣等，安庆师范学院学报(自然科学版),1992,01:1-9；张新波等，生物化学与生物物理进展,1992,06:477-478；潘颖等，生物化学杂志,1994,04:387-391；潘颖等，生物化学与生物物理进展,1994,04:353-356+380；黄如彬等，生物化学与生物物理进展,1994,05:444-446+476；高剑峰等；氨基酸和生物资源,1996,04:5-8；王江雁等，生物化学与生物物理进展,1997,01:75-78；侯卫红等，白血病,1997,01:12-15；李钦选等，新乡医学院学报,1997,01:46-49)

自FIDIA公司在20世纪80年代首先把牛脑来源的混合神经节苷脂开发为临床周围神经系统疾病用药以来，先后有FIDIA公司的混合神经节苷脂单唾液酸四己糖神经节苷脂钠上市销售，其后国内齐鲁药业的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠“申捷”也在国内首先上市销售，神经节苷脂的药用研究及开发利用日趋成为热点。FIDIASPA公司于20世纪70年代开始陆续公开制备神经节苷脂的方法(公开号FR2320760A1、JPS5234912A、GR61663A1、JPS62187412A、IN171530A1、US2003153517A1)，其系列方法中对于从牛脑或猪脑中进行神经节苷脂提取与分离的方法都是沿用J.Folch提出的以氯仿-甲醇混合溶剂为主的提取液从组织中进行脂类物质的提取，然后用分配分离法获得神经节苷脂的方法。同时，其他的诸多机构公开的相关的从组织中进行神经节苷脂提取与分离方法亦是如此(公开号EP0150712A2、CA2002155A1、EP0319890A1、EP0409473A2、US5532141A、CN1158295C、CN101108868A、CN101838295A、CN102731584A、CN103524572A)。略有不同的是，日本国MITSUI TOATSU CHEMICALS公司在1985年曾公开了一种提取分离制备神经节苷脂的方法(公开号JPS60181019A)，该方法以甲醇为溶剂替代J Folch经典方法的氯仿-甲醇-水溶剂体系进行加热提取和降温冷却获得脂类物质，然后再把脂类提取物溶解在氯仿-甲醇溶剂体系中参照J Folch经典方法进行分配分离获得神经节苷脂，以期减少氯仿和甲醇溶剂的用量。

其他机构也陆续公开了一些与J.Folch经典方法相当不同的方法。中科院上海生理所在1999年公开了一种以酒精-石油醚混合溶剂提取动物脑组织获得含神经节苷脂的提取物制备保健食品的方法(公开号CN1046734C)。吴浩青于2007年公开了一种用“有机溶液-缓冲溶液”混合萃取体系进行动物组织神经节苷脂成分提取的方法(公开号CN101003553A)，其中有机溶剂包括氯仿、甲醇、四氢呋喃、乙醚。上海绿谷公司2004年公开了一种在不高于室温条件下用含水酒精提取动物鲜脑组织中神经节苷脂的方法(公开号CN1535974A)。鲁南制药集团2008年公开了一种基于鲜脑组织原料用甲醇溶液在低温(2～8℃)条件下提取神经节苷脂成分的方法(公开号CN101177439A)，2011年又公开了一种基于鲜脑组织用无水乙醇提取神经节苷脂的方法(公开号CN102093440A)。湖北利诺生物药业公司2014年公开了一种用甲醇-碱水混合溶剂提取经酸处理过的鲜脑组织获得神经节苷脂成分的方法(公开号CN104151372A)。长春英联生物技术公司于2008年公开了一种应用CO₂超临界萃取法进行脑组织神经节苷脂成分的提取方法(公开号CN101270137A)。北京赛生药业于2010年公开了一种用含非离子型去垢剂的水溶液作为提取溶剂提取鲜脑组织中神经节苷脂的方法(公开号CN101899074A)。

综上可知，自J.Folch最先提出分配分离法来提取脑和其他神经组织中的脂类及分离神经节苷脂以来，至今无论在小规模的实验研究领域，或大规模的生产制备领域，大多数机构都是在继续沿用J Folch的经典方法，或稍加改进。分配分离法主要是利用神经节苷脂可从氯仿-甲醇相中分配到上层水相中的基本原理进行分离。该法易于操作，很易于从神经组织中获得和富集高含量的神经节苷脂成分。但不容置疑的是，特别是在涉及神经节苷脂规模生产制备领域，基于J.Folch经典方法的分配分离法却面临了几个不可忽视的重要缺陷：1)二类有毒溶剂氯仿等的大量使用所形成的操作人员健康隐患和环保隐患问题；2)氯仿-甲醇混合溶剂体系的大量使用所导致的溶剂回收、利用、含有机溶剂废液环保处理等高成本问题；3)在高含量其他脂类杂质存在条件下，在分层过程中神经节苷脂成分，特别是GM1，仍有相当部分存留在氯仿层中，导致神经节苷脂的收率偏低等。

神经节苷脂及其各神经节苷脂单体化合物，如单唾液酸四己糖神经节苷脂，在医药领域的应用越来越显著，鉴于当前的技术状况，从动物神经组织分离获得各类神经节苷脂成分仍旧是首选的，经济的来源。应此，始终保持着对一种环保健康、操作易行、成本低廉、收率和纯度高的适于规模生产的神经节苷脂提取分离方法的迫切需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取分离神经节苷脂的方法，使得所述方法能够提高神经节苷脂的纯度和收率，并且环保安全、操作简便，所用溶剂可回收套用，不产生废液。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种提取分离神经节苷脂的方法，包括：

步骤1、将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热搅拌回流提取，然后提取液经搅拌降温，过滤获得含有神经节苷脂成分的沉淀物I；所述醇溶剂为C₁～C₃直链醇中的一种或两种以上以任意比例混合的混合物；

步骤2、沉淀物I加热溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在搅拌条件下进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得富集神经节苷脂成分的沉淀物II；所述有机溶剂I为C₁～C₃直链醇和氯代烷烃中的一种或两种以上任意比例混合物；

步骤3、沉淀物II用有机溶剂II加热搅拌洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂，所述有机溶剂II为C₁～C₄羧酸酯和C₁～C₃直链醇中的一种或两种以上任意比例的混合物。

针对现有提取分离神经节苷脂的工艺普遍基于J.Folch的分配分离法的原理带来的纯度低、收率低、危害人体健康、产生废液等诸多缺陷，本发明提供了一整套提取工艺，整个工艺采用低毒溶剂体系来实现从哺乳动物神经组织中提取和分离神经节苷脂。本发明方法所用有机溶剂主要为低级醇(C₁～C₃直链醇)和低级酯(C₁～C₄羧酸酯)等，属于低毒性溶剂，操作人员健康隐患和环保隐患小；该方法过程不含水，溶剂可完全回收套用，不涉及废液的产生、环保处理及排放；同时，该方法神经节苷脂的收率和纯度较高。

神经节苷脂的某单体化合物或者混合的神经节苷脂在低级醇中微溶甚而不溶，但经过本发明特殊的溶剂搭配，使得微量存在于神经组织中的神经节苷脂成分，用优选1-50倍神经组织质量，更优选为10～15倍神经组织质量的醇溶剂，在加热和搅拌提取的条件下，在神经组织中含量丰富的天然助溶剂，如胆固醇成分及磷脂成分的助溶作用下，可以几乎完全地被溶解并转移至提取的低级醇溶剂中。

本发明的方法中，所述C₁～C₃直链醇优选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇，这些溶剂均能很好地实现从干燥的神经组织中充分提取神经节苷脂成分的效果。如未特别说明，本发明中所述C₁～C₃直链醇均采用此优选方案。考虑溶剂中生产过程的安全性和终产品在使用中的安全性，所述醇溶剂优选乙醇。除此之外，在本发明的一些具体实施例中，所述醇溶剂可以为甲醇、正丙醇、甲醇和乙醇的混合物、甲醇和正丙醇的混合物等，对于所述醇溶剂选择两种以上时，各直链醇之间的体积比优选1:1。

本发明的方法所用的动物组织原料为哺乳动物神经组织，基于哺乳动物神经组织中神经节苷脂的富集特征，以及哺乳动物神经组织中各类成分的组成及含量的相似性，本发明所描述的方法针对哺乳动物神经组织有普遍的适用效果。本发明所涉及的哺乳动物神经组织优选为除人以外的哺乳动物脑和/或脊髓组织，考虑原料获得的方便和经济性，更优选为猪、牛、羊等动物的脑和/或脊髓组织，考虑尽量规避原料病毒污染的可能性，进一步优选猪的脑和/或脊髓组织。此外，本发明所述哺乳动物神经组织水分含量不高于5％，可经直接加热或脱水处理来干燥，这样保证了本发明整个工艺过程不含水溶液的使用，该特征即是确保工艺结果完全实现的重要条件保障，同时也方便了整个工艺过程中所使用的各类溶剂的完全回收和再次使用。

在本发明的步骤1中，在加热和搅拌条件下获得的醇提取液，伴随温度的降低，被溶解的极性脂类成分(包括神经节苷脂成分)亦能在醇溶剂中沉淀析出，可通过过滤分离即方便地获得含神经节苷脂成分的沉淀物I，而滤过的醇溶剂可通过蒸发浓缩等方法获得完全回收及再次使用，作为优选，所述步骤1为：

将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热至30～100℃，以10～200转/分速率搅拌回流提取0.5～5h，然后提取液以5～50转/分速率搅拌0.5～5h降温至-20～20℃，过滤获得含有神经节苷脂成分的沉淀物I。

更优选地，步骤1为：

将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热至60～80℃，以50～80转/分速率搅拌提取3h，然后提取液以20～40转/分速率搅拌降2h温至-5～5℃，过滤获得含有神经节苷脂成分的沉淀物I。

通过醇溶剂提取及沉淀所获得的沉淀物I，主要成分为胆固醇和磷脂类物质，同时也含有神经节苷脂等糖脂类成分。本发明选择C₁～C₃直链醇和氯代烷烃中的一种或两种以上任意比例混合物的有机溶剂I来溶解沉淀物I，本发明根据神经节苷脂类物质与胆固醇和磷脂类物质在极性及电荷性方面的差异，选择特定有机溶剂体系(有机溶剂I)，在优选加入活性炭、氧化铝、硅胶、非极性大孔吸附树脂中的一种或两种以上任意比例的混合物作为吸附剂进行杂质吸附后，绝大多数的神经节苷脂成分，如胆固醇、磷脂等，可被吸附剂充分吸附，而神经节苷脂成分仍旧保留于有机溶剂I中，可通过过滤分离即方便地获得富集神经节苷脂成分的溶剂，该溶剂经蒸发浓缩等方法可获得神经节苷脂浓缩液，再经丙酮低温沉淀，过滤收集固体，干燥即得富集神经节苷脂的沉淀物II。

其中，所述的有机溶剂I的用量优选为沉淀I质量的1～50倍；更优选为10～15倍；所述的杂质吸附剂用量优选为沉淀I质量的0.5～5倍，更优选为1.5～3倍；所述的杂质吸附剂进一步优选非极性大孔吸附树脂；所述氯代烷烃优选自二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、三氯乙烷、氯苯中的一种或两种以上任意比例的混合物。

作为较为优选地方案，所述有机溶剂I为一种C₁～C₃直链醇和一种氯代烷烃配合使用，两者体积比参照(5-95):(95-5)，体积比进一步优选95:5、50:50或5:95，最优选为乙醇-二氯甲烷，体积比为95:5。除此之外，本发明在一些具体实施例中还可以选择如下搭配：

乙醇/二氯甲烷，50:50，v/v；

甲醇/三氯甲烷，5:95，v/v；或

甲醇/三氯甲烷，50:50，v/v；

作为优选，本发明步骤2为：

沉淀物I加热至20～60℃溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在10～200转/分速率下搅拌0.5～5h进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得富集神经节苷脂成分的沉淀物II。

更优选地，步骤2为：

沉淀物I加热至40～50℃溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在80～120转/分速率下搅拌2h进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得富集神经节苷脂成分的沉淀物II。

经过杂质吸附剂处理所得到的沉淀物II主要成分为神经节苷脂成分和部门未充分吸附去除的胆固醇和磷脂类成分，沉淀物II充分表现了神经节苷脂成分应有的在有机溶剂中的溶解特性，即微溶于甲醇，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯及乙醇，考虑到整体提取率和纯度，本发明继续施用C₁～C₃直链醇和C₁～C₄羧酸酯中的一种或二种以上任意比例的混合物为溶剂进行加热搅拌溶解操作，沉淀物II中残留的胆固醇和磷脂类成分可被溶解至溶剂中，而神经节苷脂成分却几乎不被溶解并实现高程度的富集和纯化，获得高纯度的神经节苷脂沉淀。

其中，C₁～C₄羧酸酯优选自甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯。

作为较优选的方案，本发明有机溶剂II优选单独采用C₁～C₄羧酸酯中的一种或两种以上任意比例混合物，更优选采用一种C₁～C₄羧酸酯，最优选为乙酸丁酯。在使用量方面，所述的有机溶剂II的用量优选为沉淀II质量的1～50倍；更优选为10～15倍。

除此之外，在本发明的一些具体实施例中，所述有机溶剂II还可以选择甲酸甲酯、乙酸乙酯、甲酸甲酯和乙酸乙酯的混合物、乙酸乙酯和乙酸丁酯的混合物等，对于所述有机溶剂II选择两种以上羧酸酯时，各羧酸酯之间的体积比优选50:50。

作为优选，本发明步骤3为：

沉淀物II用有机溶剂II加热20～80℃，以10～200转/分速率搅拌0.5～5h洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂。

更优选地，步骤3为：

沉淀物II用有机溶剂II加热50～60℃，以80～120转/分速率搅拌2h洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂。

按照本发明方法从神经组织中提取分离所获得的神经节苷脂成分的收率不低于80％，神经节苷脂纯度不低于90％。相比基于J.Folch方法的分配分离法不到60％的收率以及60％左右的纯度的效果，本发明方法更加具有显著优势。

由以上技术方案可知，本发明的方法与现有普遍使用基于J.Folch方法的分配分离法比较具有以下显著优点：

1)本方法工艺主要使用不含水的低级醇和低级羧酸酯等低毒性溶剂，循环套用，无废液产生和排放，规避了“分配分离法”等传统工艺中二类有毒溶剂氯仿等的大量使用所形成的操作人员健康隐患和环保隐患问题，也规避了“分配分离法”等传统工艺中“氯仿-甲醇-水”溶剂体系使用后的大量废水处理和排放问题；

2)本方法工艺实现了神经节苷脂成分的充分提取和充分保留，所获得的神经节苷脂收率不低于80％，纯度不低于90％，远远高于传统工艺所获得的收率和纯度。规模生产条件下的成本优势也相当显著。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种提取分离神经节苷脂的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，为了保证对比的一致性，除去应用的工艺步骤差别外，其余条件均相同，例如所采用的神经组织来源一致等。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种提取分离神经节苷脂的方法进行详细说明。

对比例1：基于J.Folch方法的分配分离法制备神经节苷脂

取冻存检疫免疫合格猪脑1000kg(含水量80％)，解冻，粉碎匀浆，投料至15m³提取罐中，按加入物料10倍体积混合溶剂(氯仿：甲醇：水，4：8：3，v：v：v)计，再投料氯仿2700L(4050kg)，甲醇5400L(4320kg)，纯水1100L；室温搅拌2小时，在加入1650L纯水形成混合溶剂分层比例(氯仿：甲醇：水，4：8：5.6，v：v：v)，室温静置分层12小时，形成下层氯仿层和上层“甲醇-水”混合液层，脑渣位于氯仿层中。

放液取出下层氯仿层，滤去脑渣，氯仿滤液置另一个6m³提取罐中，得氯仿滤液2300L，再加入甲醇1150L(920kg)和纯水760kg搅拌混合，室温静置分层12小时，再次形成下层氯仿层和上层“甲醇-水”混合液层。

放出下层氯仿层置球形浓缩罐进行氯仿回收，上层“甲醇-水”混合液层合并至第一次用15m³提取罐中，加入NaOH调碱至pH值10-11，60～80℃，保温皂化5小时，得皂化液8500L。

取D101大孔吸附树脂50kg，用纯水充分漂洗后装柱，以适当流速上样树脂柱，以检出流出液不含神经节苷脂为准，上样结束后再用500L纯水充分冲洗树脂柱，收集透过液9200L，环保处理。用500L热甲醇充分洗脱树脂柱，收集甲醇洗脱液，浓缩，丙酮沉淀，过滤，干燥，得神经节苷脂。

称重，神经苷脂2.56kg，收率为，经HPLC氨基柱法(郑永彪等，药物分析杂志,2004,24(2):135-135)测定，神经节苷脂纯度为62％，即含神经节苷脂约1.59kg，根据文献(Robert W.Ledeen,Robert K.Yu，Methods in Enzymology.1982,83:139-191)数据推算，每1000kg鲜脑组织中神经节苷脂含量约为2.9kg，则此工艺所得神经节苷脂的收率为54.8％。

实施例1：本发明提取分离神经节苷脂的方法

取冻存检疫免疫合格猪脑1000kg(含水量80％)，解冻，粉碎匀浆，喷雾干燥，得猪脑粉213kg(含水量2.6％)。

猪脑粉投料至6m³提取罐中，再分两次投料无水乙醇3000L进行加热搅拌回流提取。第一次投料2000L，搅拌回流提取2小时，第二次投料1000L，搅拌回流提取1小时。

滤得乙醇提取液约3000L置6m³结晶罐中，搅拌降温至0℃，继续搅拌保温2小时，过滤，得沉淀物I 45kg，滤得乙醇滤液蒸馏回收套用。

沉淀物I投料至2m³提取罐中，并同时投料乙醇-二氯甲烷(95：5/,v/v)混合溶剂675L，加热至50℃搅拌溶解沉淀物I，再投料D101大孔吸附树脂67.5kg，继续保温50℃，搅拌2小时，滤得溶液浓缩至100L左右，丙酮沉淀，过滤，干燥，得富集神经节苷脂成分的沉淀物II 9.5kg。

沉淀物II投料至1m³提取罐中，并同时投料乙酸丁酯150L，加热至70℃搅拌洗涤沉淀物II 2小时，滤得沉淀为获得充分富集与纯化的神经节苷脂沉淀，滤得乙酸丁酯溶液浓缩回收套用。

称重，神经节苷脂2.79kg，收率为，经HPLC氨基柱法(郑永彪等，药物分析杂志,2004,24(2):135-135)测定，神经节苷脂纯度为91％，即含神经节苷脂约2.54kg，神经节苷脂收率为87.6％。

实施例2：不同方法工艺数据比较

汇总对比例1和实施例1中的相关数据加以对比，结果见表1和表2.

表1 不同工艺溶剂消耗对比表

表2 不同工艺产品收率对比表

结合表1和表2结果可知，本发明除不采用具有高毒的溶剂外，单从溶剂的使用量上也相比现有的方法也大幅减少，更加环保安全。同时从GM1收率、神经节苷脂收率和纯度方面对比，本发明工艺能够显著提高这些技术效果。

实施例3：不同所述醇溶剂进行沉淀物I的提取

取冻存检疫免疫合格猪脑1000kg(含水量80％)，解冻，粉碎匀浆，喷雾干燥，得猪脑粉207kg(含水量2.5％)。

分别取猪脑粉40kg，共五份，分别依照表3所示不同条件投料至2m³提取罐中进行加热搅拌回流提取神经节苷脂。各组滤得提取液置2m³结晶罐中，搅拌降温至0℃，继续搅拌保温2小时，过滤干燥，得沉淀物I，滤得滤液蒸馏回收，沉淀物I重量及其神经节苷脂含量如表4所示。同时，各组在提取过程中分别于1、2、3、4、5小时取样提取液测定神经节苷脂浓度，结果如表5所示。其中提取液及沉淀物I中神经节苷脂含量(纯度)测定依照唾液酸检测法进行(Svennerholm L,Biochim Biophys Acta.1957,24(3):604-611；)

表3 不同醇溶剂提取神经节苷脂工艺条件

表4 不同醇溶剂组提取过程中提取液神经节苷脂浓度测定

表5 不同醇溶剂组提取神经节苷脂结果

通过本实施例进行的不同醇溶剂组的实施结果可知，本发明权利要求所列的用于提取神经组织中神经节苷脂成分的醇溶剂都能很好地实现步骤1提取效果，提取收率都在90％以上，神经节苷脂含量(纯度)也处于5.3-6.0％范围内，各组之间的差异在于不同醇溶剂获得最佳提取效果所需提取时间不同。

实施例4：含神经节苷脂成分的沉淀物I用不同有机溶剂I进行杂质吸附

取冻存检疫免疫合格猪脑1000kg(含水量80％)，解冻，粉碎匀浆，喷雾干燥，得猪脑粉197kg(含水量1.6％)。

猪脑粉投料至6m³提取罐中，再分两次投料无水乙醇3000L进行加热搅拌回流提取。第一次投料2000L，搅拌回流提取2小时，第二次投料1000L，搅拌回流提取1小时。

滤得乙醇提取液约3000L置6m³结晶罐中，搅拌降温至0℃，继续搅拌保温2小时，过滤干燥，得沉淀物I 50.5kg，滤得乙醇滤液蒸馏回收套用。

分别取沉淀物I 10kg，共五份，分别依照表6所示不同条件投料至0.5m³提取罐中进行杂质吸附，滤得溶液浓缩至20L左右，丙酮沉淀，过滤干燥，所得富集神经节苷脂成分的沉淀物II重量及其神经节苷脂含量如表7所示。

表6 不同有机溶剂组进行沉淀物I杂质吸附的工艺条件

表7 不同有机溶剂组进行沉淀物I杂质吸附的结果

通过本实施例进行的不同有机溶剂I组实施结果可知，本发明权利要求所列的用于杂质吸附的有机溶剂I和吸附剂都能很好地实现杂质吸附效果，提取收率都在75～90％范围内，含量在18-28％。

实施例5：富集神经节苷脂成分的沉淀物II用不同有机溶剂II进行纯化

取冻存检疫免疫合格猪脑1000kg(含水量80％)，解冻，粉碎匀浆，喷雾干燥，得猪脑粉208kg(含水量2.5％)。

猪脑粉投料至6m³提取罐中，再分两次投料无水乙醇3000L进行加热搅拌回流提取。第一次投料2000L，搅拌回流提取2小时，第二次投料1000L，搅拌回流提取1小时。

滤得乙醇提取液约3000L置6m³结晶罐中，搅拌降温至0℃，继续搅拌保温2小时，过滤干燥，得沉淀物I 47.5kg，滤得乙醇滤液蒸馏回收套用。

沉淀物I投料至2m³提取罐中，并同时投料乙醇-二氯甲烷(95：5/,v/v)混合溶剂675L，加热至50℃搅拌溶解沉淀物I，再投料D101大孔吸附树脂67.5kg，继续保温50℃，搅拌2小时，滤得溶液浓缩至100L左右，丙酮沉淀，过滤干燥，得富集神经节苷脂成分的沉淀物II10.2kg。

分别取沉淀物II 2kg，共五份，分别依照表8所示不同条件投料至0.2m³提取罐中进行洗涤，滤得沉淀干燥后为纯化的神经节苷脂产品，产品重量及其神经节苷脂含量如表8所示。

表8 不同有机溶剂组进行沉淀物II洗涤纯化的工艺条件

表9 不同有机溶剂组进行沉淀物II洗涤纯化的的结果

通过本实施例进行的不同有机溶剂II组实施结果可知，本发明权利要求所列的用于洗涤纯化的有机溶剂II能很好地实现洗涤和纯化神经节苷脂的效果，提取收率都在80％以上，神经节苷脂的纯度都在90％以上。

结合实施例3-5的试验结果可以得知，本发明所提供的在各个提取阶段使用的溶剂以及杂质吸附剂等均能够实现同等程度的有益效果，再结合实施例2中的和现有方法的对比结果，本发明所提供的整体技术方案均能够很好地达到预期技术效果，优于现有方法。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种提取分离神经节苷脂的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热搅拌回流提取，然后提取液经搅拌降温，过滤获得含有神经节苷脂成分的沉淀物I；所述醇溶剂为C₁～C₃直链醇和异丙醇中的一种或两种以上以任意比例混合的混合物；

步骤2、沉淀物I加热溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在搅拌条件下进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得富集神经节苷脂成分的沉淀物II；所述有机溶剂I为C₁～C₃直链醇、异丙醇、氯代烷烃和氯苯中的一种或两种以上任意比例的混合物；

步骤3、沉淀物II用有机溶剂II加热搅拌洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂，所述有机溶剂II为C₁～C₄羧酸酯、C₁～C₃直链醇和异丙醇中的一种或两种以上任意比例的混合物；

所述C₁～C₄羧酸酯选自甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯中的一种或两种以上任意比例的混合物。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述C₁～C₃直链醇选自甲醇、乙醇、正丙醇。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述醇溶剂用量为神经组织质量的1～50倍。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述氯代烷烃选自二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、三氯乙烷中的一种或两种以上任意比例的混合物。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的有机溶剂I的用量为沉淀I质量的1～50倍。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述的有机溶剂II的用量为沉淀II质量的1～50倍。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述哺乳动物神经组织为水分含量不高于5％的除人以外哺乳动物的脑和/或脊髓组织。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述进行杂质吸附为采用活性炭、氧化铝、硅胶、非极性大孔吸附树脂中的一种或两种以上任意比例的混合物进行杂质吸附。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

将哺乳动物神经组织置于醇溶剂中加热至30～100℃，以10～200转/分速率搅拌回流提取0.5～5h，然后提取液以5～50转/分速率搅拌降温至-20～20℃，过滤获得含有神经节苷脂成分的沉淀物I。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：

沉淀物I加热至20～60℃溶解于有机溶剂I中，并维持加热温度在10～200转/分速率下搅拌0.5～5h进行杂质吸附，过滤所得溶液经浓缩后用丙酮低温沉淀，过滤获得富集神经节苷脂成分的沉淀物II。

11.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3为：

沉淀物II用有机溶剂II加热20～80℃，以10～200转/分速率搅拌0.5～5h洗涤，滤得沉淀为神经节苷脂。