CN109320566B - 一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，包括以下步骤：(1)以新鲜猪脑组织为原料，将其置于乙醇水溶液与氯化钠的混合体系中经加热搅拌回流处理，得到粗提取液；(2)将步骤(1)所得粗提取液进行超声波搅拌处理；(3)将步骤(2)所得物于超临界CO2流体下进行萃取；(4)将步骤(3)萃取所得物加入丙酮中进行低温沉淀，过滤所得沉淀物，用无水乙醇冲洗干净，经减压干燥即得神经节苷脂。本发明提供的制备方法不使用毒性有机溶剂、制备工艺简单、提取纯化时间短、生产成本低，且制备所得神经节苷脂的收率和纯度高。

Description

一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及神经节苷脂的分离和纯化方法，具体涉及一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法。
背景技术
神经节苷脂(GLS)是存在于细胞膜表面的一类含有唾液酸的酸性鞘糖脂，在神经系统中含量最为丰富。根据所含唾液酸的数目以及唾液酸连接的部位不同，神经节苷脂可分为很多种，包括单唾液酸神经节苷脂GM和双唾液酸神经节苷脂GD等。作为细胞膜的重要组成成分，GLS可以作为某些生物活性物质的特异性受体，起介导或调节这些生物活性物质的作用。GLS还能够广泛参与正常细胞的生长、分化、调节以及信息传递过程，尤其在神经元的成熟和损伤神经的再生过程中，其作用备受人们关注。目前大量研究发现，神经节苷脂对早老年性痴呆、帕金森综合症、脑及脊髓神经意外损伤、癫痫、脑瘫、缺血缺氧性脑病等有良好的治疗作用，可有效促进受损伤神经的功能恢复。
药用神经节苷脂的制备可以从哺乳动物脑中提取，具有积极的工业价值。有资料显示猪脑组织提取的神经节苷脂与人源性神经节苷脂在结构和组成，特别是唾液酸的类型等方面完全一致。因此，从动物脑组织作为原料提取神经节苷脂，不会存在免疫原性和异常毒性反应。为了获得纯度高、质量好的神经节苷脂，多年来研究人员对其提取制备方法进行了大量研究。
从上世纪60年代开始，人们就开始建立了采用有机溶剂抽提和利用柱层析纯化的方法来制备药用神经节苷脂，比较常用的提取方法有氯仿/甲醇提取法、四氢呋喃提取法和异丙醇/正丁醇提取法等，再经过分离后进行纯化，纯化方法主要有柱层析法、毛细管电泳法和高速逆流色谱法。由于神经节苷脂在动物组织中的含量很低，特殊的化学结构及性质决定了它的提取难度大，需要经过多次抽提和反复利用不同层析方法进行纯化，其工艺流程复杂，生产成本高。且制备方法中涉及的有机溶剂毒性大、用量大、对操作人员的危害大，其生产过程耗时久、周期长、收率低，极大地妨碍了神经节苷脂的工业化推广和应用。
为了实现对神经节苷脂的工业化生产和降低毒性有机溶剂的使用，专利文献CN105111253 B中公开了一种绿色提取分离神经节苷脂的方法，其是采用热的醇溶剂进行提取，然后降温得到含有神经节苷脂成分的沉淀物I，再经有机溶剂I溶解除杂，经丙酮沉淀后得到沉淀物II，最后通过有机溶剂II溶解，再沉淀过滤得到最终产品。其工艺过程采用低毒溶剂体系提取，得到的神经节苷脂纯度和收率较高，但是其制备工艺复杂、成本高。专利文献CN 105440089 A中公开了一种神经节苷脂提取物的制备方法，其是以猪脑为原料，将其溶于60～65％的乙醇水溶液中搅拌，得到脑浆液，再在液氮保护下对脑浆液进行超声波处理，得到混合液，混合液经加热搅拌除杂，所得残余物通过丙酮沉淀，滤饼再用氯仿/甲醇提取三次，提取液合并后减压浓缩，得到神经节苷脂提取物。其制备方法在提取过程中进行了简化，缩短了提取纯化的时间，使得生产成本更低，但是其产品的纯度不高、收率较低，且其纯化过程仍需要采用大量的毒性有机溶剂处理，对人体危害较大，无法实现绿色生产。
现有的神经节苷脂的提取纯化制备方法，要么是大量采用高毒性有机溶剂，对人体和环境危害较大；要么是提取纯化步骤复杂，提取工艺时间长、生产成本高；要么制备所得产品的收率和纯度较低，工业应用前景受到限制。因此，亟待开发一种新的神经节苷脂的提取纯化方法，以解决上述技术问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，以实现降低毒性有机溶剂的使用率、简化制备工艺、缩短提取纯化的时间、降低生产成本，并能很好保证制备所得神经节苷脂的收率和纯度高。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，包括以下步骤：
(1)以新鲜猪脑组织为原料，将其置于乙醇水溶液与氯化钠的混合体系中经加热搅拌回流处理，得到含有神经节苷脂的粗提取液；所述氯化钠占混合体系的总质量浓度为1～3％；
(2)将步骤(1)所得粗提取液进行超声波搅拌处理，超声波功率为40～50kHz，超声处理的时间为10～15min；
(3)将步骤(2)处理后所得物于超临界CO2流体下进行萃取，所述萃取的温度为50～60℃，压力为30～50MPa，处理时间为20～25min；
(4)将步骤(3)萃取所得物加入丙酮中进行低温沉淀，过滤所得沉淀物，用无水乙醇冲洗干净，经减压干燥即得神经节苷脂。
本发明提供的上述神经节苷脂的制备方法，完全不采用毒性有机溶剂进行提取，且无需要反复的纯化步骤，提取过程中的杂质含量少。其中步骤(1)的回流提取是必要的，采用乙醇与氯化钠的混合液进行回流提取时，起到了高效提取神经节苷脂的作用，能够直接从猪脑组织中提取出丰富的神经节苷脂粗提取液，使得神经节苷脂的收率高，并能够一定程度上减少粗提液中的磷脂含量；由于粗提液中含有中性脂和中性鞘糖脂，本发明的步骤(2)和步骤(3)依次经过超声波搅拌处理和超临界萃取，超声波搅拌能够很好去除粗提液中的水溶性中性脂，而同时具有亲水基团和疏水基团的磷脂则很难彻底去除，采用超临界萃取能够将步骤(2)中含量较少的磷脂进行完全去除，获得的神经节苷脂纯度高，质量好。
作为优选的，步骤(1)中所述加热的温度为65～68℃，处理时间为10～15min。该反应条件下，能够最大化保证提取的效率，充分发挥提取液中钠盐的作用，通过混合体系中氯化钠分子的热传导效应，大大加快了提取的速率，很好避免了在长时间提取下大量的杂质进入粗提取液，导致的后续提取纯化效率低，需要反复进行提取和纯化的问题。
作为优选的，步骤(1)中所述猪脑组织与混合液的质量比为1:10～12，采用该范围比例的提取液与原料，是充分考虑原料的用量与提取液的消耗和提取时间，在最佳比例下进行提取，保证了提取效率以及提取所得最终产物的收率。
作为优选的，所述加热搅拌回流处理的搅拌速度为120-150r/min。在该搅拌速度范围内，提取渗透效率更适宜，提取过程更平稳，猪脑组织中的神经节苷脂大量被提取液提取出来。
作为优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为50～55％。采用该提取液浓度下，提取效率最高。
作为优选的，步骤(2)中的超声波搅拌速度为300-350r/min。将超声搅拌速度提高，能够更好地去除步骤(1)中的杂质。
作为优选的，步骤(4)中所述丙酮的质量为新鲜猪脑组织重量的1.5-3倍。
作为优选的，所述低温沉淀的温度为5～10℃，沉淀反应时间为15～20min。
作为优选的，步骤(4)中用无水乙醇冲洗一至两遍。
作为优选的，所述减压干燥的压力为-0.01～-0.05MPa，温度为40～60℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明完全不使用氯仿、甲醇等毒性有机溶剂，对操作人员危害小，实现了绿色生产；
(2)本发明制备得到的神经节苷脂纯度高、收率高，且提取效率高，只需1～2h即可完成对猪脑髓中神经节苷脂的提取分离纯化；
(3)本发明制备工艺简单、无需经过复杂的提取操作和反复纯化处理，减少了提取液的使用量和使用次数，生产成本更低。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，包括以下步骤：
(1)取10kg新鲜猪脑组织为原料，将其置于乙醇水溶液与氯化钠组成的混合体系(总重100kg)中，先加入49.5kg的乙醇和49.5kg的水配置成质量浓度为50％的乙醇水溶液，然后向其中加入1kg氯化钠(质量浓度1％)；将上述混合体系于65℃下，以搅拌速度为120r/min进行回流处理15min，得到含有神经节苷脂的粗提取液；
(2)将步骤(1)所得粗提取液进行超声波搅拌处理，超声波功率为40kHz，超声波搅拌速度为300r/min，超声处理的时间为10min；
(3)将步骤(2)处理后所得物于超临界CO2流体下进行萃取，所述萃取的温度为50℃，压力为30MPa，萃取时间为20min；超临界CO2流体的制备过程为：将钢瓶中的CO2(纯度≥99％)经过滤器过滤后进入加压泵加压至30MPa，出口CO2经换热器预热后进入缓冲罐，CO2在缓冲罐中稳压升温至所需压力和温度，再经换热器加热至恒定温度，形成超临界状态，进入萃取罐，与罐中的物料接触萃取；
(4)将步骤(3)萃取所得物加入15kg丙酮中，于5℃下进行沉淀反应15min，过滤所得沉淀物，用无水乙醇冲洗一遍，然后于压力-0.01MPa、温度40℃下进行干燥处理，即得神经节苷脂。
对终产物进行称重，得总神经节苷脂578g，按专利文献CN105440089A的方法进行测定，得神经节苷脂的纯度为97.3％，即含纯神经节苷脂约562g，神经节苷脂收率为5.62％。
实施例2
一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，包括以下步骤：
(1)取50kg新鲜猪脑组织为原料，将其置于乙醇水溶液与氯化钠组成的混合体系(总重550kg)中，先加入285.5kg的乙醇和263.5kg的水配置成质量浓度为52％的乙醇水溶液，然后向其中加入1kg氯化钠(质量浓度2％)；将上述混合体系于67℃下，以搅拌速度为140r/min进行回流处理12min，得到含有神经节苷脂的粗提取液；
(2)将步骤(1)所得粗提取液进行超声波搅拌处理，超声波功率为47kHz，超声波搅拌速度为320r/min，超声处理的时间为12min；
(3)将步骤(2)处理后所得物于超临界CO2流体下进行萃取，所述萃取的温度为55℃，压力为40MPa，萃取时间为22min；超临界CO2流体的制备过程为：将钢瓶中的CO2(纯度≥99％)经过滤器过滤后进入加压泵加压至40MPa，出口CO2经换热器预热后进入缓冲罐，CO2在缓冲罐中稳压升温至所需压力和温度，再经换热器加热至恒定温度，形成超临界状态，进入萃取罐，与罐中的物料接触萃取；
(4)将步骤(3)萃取所得物加入100kg丙酮中，于7℃下进行沉淀反应18min，过滤所得沉淀物，用无水乙醇冲洗一遍，然后于压力-0.03MPa、温度50℃下进行干燥处理，即得神经节苷脂。
对终产物进行称重，得总神经节苷脂2.97kg，按专利文献CN105440089A的方法进行测定，得神经节苷脂的纯度为97.8％，即含纯神经节苷脂约2.9kg，神经节苷脂收率为5.8％。
实施例3
一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，包括以下步骤：
(1)取500g新鲜猪脑组织为原料，将其置于乙醇水溶液与氯化钠组成的混合体系(总重6kg)中，先加入3.2kg乙醇和2.62kg水配置成质量浓度为55％的乙醇水溶液，然后向其中加入0.18kg氯化钠(质量浓度3％)；将上述混合体系于68℃下，以搅拌速度为150r/min进行回流处理10min，得到含有神经节苷脂的粗提取液；
(2)将步骤(1)所得粗提取液进行超声波搅拌处理，超声波功率为50kHz，超声波搅拌速度为350r/min，超声处理的时间为15min；
(3)将步骤(2)处理后所得物于超临界CO2流体下进行萃取，所述萃取的温度为60℃，压力为50MPa，萃取时间为25min；超临界CO2流体的制备过程为：将钢瓶中的CO2(纯度≥99％)经过滤器过滤后进入加压泵加压至50MPa，出口CO2经换热器预热后进入缓冲罐，CO2在缓冲罐中稳压升温至所需压力和温度，再经换热器加热至恒定温度，形成超临界状态，进入萃取罐，与罐中的物料接触萃取；
(4)将步骤(3)萃取所得物加入1.5kg丙酮中，于10℃下进行沉淀反应20min，过滤所得沉淀物，用无水乙醇冲洗一遍，然后于压力-0.05MPa、温度60℃下进行干燥处理，即得神经节苷脂。
对终产物进行称重，得总神经节苷脂30g，按专利文献CN105440089A的方法进行测定，得神经节苷脂的纯度为98.0％，即含纯神经节苷脂约29.4g，神经节苷脂收率为5.88％。

Claims (6)

1.一种从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）以新鲜猪脑组织为原料，将其置于乙醇水溶液与氯化钠的混合体系中经加热至温度为65~68 ℃下搅拌回流处理10~15 min，搅拌速度为120-150 r/min，得到含有神经节苷脂的粗提取液；所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为50~55 %；所述氯化钠占混合体系的总质量浓度为1~3 %，所述猪脑组织与混合体系的质量比为1:10~12；
（2）将步骤（1）所得粗提取液进行超声波搅拌处理，超声波功率为40~50 kHz，超声处理的时间为10~15 min；
（3）将步骤（2）处理后所得物于超临界CO2流体下进行萃取，所述萃取的温度为50~60℃，压力为30~50 MPa，萃取时间为20~25 min；
（4）将步骤（3）萃取所得物加入丙酮中进行低温沉淀，所述低温沉淀的温度为5~10 ℃，过滤所得沉淀物，用无水乙醇冲洗干净，经减压干燥即得神经节苷脂。
2.根据权利要求1所述的从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，其特征在于，步骤（2）中的超声波搅拌速度为300-350 r/min。
3.根据权利要求1所述的从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述丙酮的质量为新鲜猪脑组织重量的1.5-3倍。
4.根据权利要求1所述的从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，其特征在于，所述低温沉淀的时间为15~20 min。
5.根据权利要求1所述的从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，其特征在于，步骤（4）中用无水乙醇冲洗一至两遍。
6.根据权利要求1所述的从猪脑髓中提取神经节苷脂的分离纯化制备方法，其特征在于，所述减压干燥的压力为-0.01~-0.05 MPa，干燥温度为40~60 ℃。
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