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一种神经节苷脂提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种神经节苷脂提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：(1)以猪脑为原料，将猪脑加入质量浓度为60％～65％的乙醇水溶液中，在转速1000-1500转/min下搅拌30-60min，得到脑浆液；(2)在25-30kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，搅拌转速为500-700转/min，加毕，继续搅拌20-90min，得到混合溶液；(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至40-50℃的敞口容器中并搅拌，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为2-5：1的氯仿/甲醇提取三次，合并提取液，在30-40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。

Description

一种神经节苷脂提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物提取领域，具体的说，涉及一种神经节苷脂提取物及其制备方法。
背景技术
神经节苷脂是一种含有N-乙酰神经氨酸的膜糖脂，具有增强人脑功能的发育和增强记忆的功能，神经节苷脂也是神经系统中的信息调节因子，它在治疗和生物的保护方面，具有明显的疗效和作用。
神经节苷脂对神经再生有重大促进作用。加拿大金爵集团脑科学研究室首席科学家GatteWalker博士进一步研究发现，神经生长因子(NGF)和神经节苷脂是脑神经再生发育必需物质，神经节苷脂介导NGF数十倍增强其活性，形成新的丰富的神经网络，修复并促使脑神经再次发育。
神经节苷脂能够介导神经生长因子NGF促进脑神经细胞再生，表现出良好的生物效应。
NGF和神经节苷脂目前无论在试验中，还是临床实践里都显示出对神经系统促进恢复效果，已成为研究的热点。如这两种药物协同作用能得到充分应用，必将能为中枢神经疾病患者带来更大希望。
专利申请01126341.5公开了一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法，该方法采用一种或多种与神经节苷脂的极性相匹配的极性溶剂，采用反相萃取的方法去除提取物中的杂质。
专利申请200610011529.9公开了一种脑苷肌肽溶液的制备方法，其中包括神经节苷脂的制备：以非牛源动物脑组织为原料，以氯仿/甲醇混合溶剂从动物脑组织中制备含神经节苷脂的提取物溶液，其中氯仿/甲醇混合溶剂的体积比为氯仿：甲醇＝(1～2)：1。
上述方法制备神经节苷脂均存在收率低、神经节苷脂纯度不高的缺陷。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种神经节苷脂提取物的制备方法；
本发明的另一目的在于提供所述制备方法制备得到的神经节苷脂提取物。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种神经节苷脂提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以猪脑为原料，将猪脑加入质量浓度为60％～65％的乙醇水溶液中，在转速1000-1500转/min下搅拌30-60min，得到脑浆液；
(2)在25-30kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，搅拌转速为500-700转/min，加毕，继续搅拌20-90min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至40-50℃的敞口容器中并搅拌，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为2-5：1的氯仿/甲醇提取三次，合并提取液，在30-40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(1)所述乙醇水溶液质量为猪脑质量的30-50倍。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(1)所述猪脑在加入乙醇水溶液前，先剥离脑膜血管，并用水清洗处理。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(2)脑浆液加入时间控制为5-10min。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(2)液氮质量为脑浆液质量的40-60倍。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(3)的搅拌速度为800-1000转/min。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(4)中丙酮质量为猪脑质量的2-3倍。
根据本发明的优选实施方案，其中，步骤(4)中每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的2-5倍。
另一方面，本发明还提供了所述制备方法制备得到的神经节苷脂提取物。
综上所述，本发明提供了一种神经节苷脂提取物及其制备方法。本发明的方法具有如下优点：
本发明方法制备得到的提取物中神经节苷脂纯度高，且避免使用制备柱，使得收率得到较大幅度提高。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
实施例1
(1)以市售新鲜猪脑为原料，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为60％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的40倍，在转速1300转/min下搅拌40min，得到脑浆液；
(2)在25kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的50倍，控制加入速度，使得脑浆液在8min左右加完，其中搅拌转速为600转/min，加毕，继续搅拌50min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至45℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为900转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为3：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的3倍，合并提取液，在30℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
实施例2
(1)以市售新鲜猪脑为原料，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为65％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的35倍，在转速1300转/min下搅拌45min，得到脑浆液；
(2)在25kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的50倍，控制加入速度，使得脑浆液在8min左右加完，其中搅拌转速为500转/min，加毕，继续搅拌40min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至45℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为800转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为3：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的2倍，合并提取液，在30-40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
实施例3
(1)以市售新鲜猪脑为原料，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为60％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的30倍，在转速1100转/min下搅拌30min，得到脑浆液；
(2)在25kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的40倍，控制加入速度，使得脑浆液在6min左右加完，其中搅拌转速为600转/min，加毕，继续搅拌20min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至40℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为900转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为3：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的3倍，合并提取液，在35℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
实施例4
(1)以市售新鲜猪脑为原料，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为63％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的45倍，在转速1500转/min下搅拌60min，得到脑浆液；
(2)在30kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的50倍，控制加入速度，使得脑浆液在10min左右加完，其中搅拌转速为700转/min，加毕，继续搅拌50min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至50℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为900转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为2：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的2倍，合并提取液，在40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
实施例5
(1)以市售新鲜猪脑为原料，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为64％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的50倍，在转速1400转/min下搅拌40min，得到脑浆液；
(2)在25kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的60倍，控制加入速度，使得脑浆液在8min左右加完，其中搅拌转速为600转/min，加毕，继续搅拌90min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至43℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为900转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的3倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为4：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的3倍，合并提取液，在30-40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
实施例6
(1)以市售新鲜猪脑为原料，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为65％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的40倍，在转速1000转/min下搅拌40min，得到脑浆液；
(2)在25kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的50倍，控制加入速度，使得脑浆液在5min左右加完，其中搅拌转速为600转/min，加毕，继续搅拌50min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至45℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为1000转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为5：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的3倍，合并提取液，在30-40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
对比例1
(1)取与实施例1同源的新鲜猪脑，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为60％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的40倍，在转速1300转/min下搅拌40min，得到脑浆液；
(2)不使用超声波处理，直接将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的50倍，控制加入速度，使得脑浆液在8min左右加完，其中搅拌转速为600转/min，加毕，继续搅拌50min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至45℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为900转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为3：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的3倍，合并提取液，在30℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
对比例2
(1)取与实施例1同源的新鲜猪脑，将猪脑除去血膜后用水洗净，加入质量浓度为60％的乙醇水溶液中，乙醇水溶液质量为猪脑质量的40倍，在转速1300转/min下搅拌40min，得到脑浆液；
(2)在25kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下迅速加入到液氮中，液氮质量为脑浆液质量的50倍，其中搅拌转速为600转/min，加毕，继续搅拌50min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至45℃左右的敞口容器中并搅拌，搅拌速度约为900转/min，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，丙酮质量为猪脑质量的2倍，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为3：1的氯仿/甲醇提取三次，每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的3倍，合并提取液，在30℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
对比例3
取与实施例1同源的新鲜猪脑，将猪脑除去血膜后用水洗净，匀浆处理，匀浆液加入质量倍数为4倍的冰丙酮，-10℃放置，离心，收集沉淀，沉淀用丙酮洗涤3次，烘干，得到丙酮粉。
将丙酮粉加入质量倍数为6倍的氯仿/甲醇混合溶液(氯仿、甲醇体积比为2：1)，室温搅拌，离心，收集上清液；重复抽提3次以上，合并上清液，提取总脂后蒸发浓缩。
提取的总脂在5％氯仿/甲醇混合液(1：1，V/V)中进行Folch分配，使神经节苷脂从有机相转入水相，收集上层液，下层液重复分配3次，合并上层液蒸发浓缩除去甲醇，用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤，收集透过液即得脑提取物溶液，浓缩至干得到神经节苷脂提取物。
测试例1
采用文献Svennerholm.L.MethodsinEngymology(VI)453.1963对上述实施例和试验例产品进行神经节苷脂含量的测定，结果如下：

Claims (9)

1.一种神经节苷脂提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以猪脑为原料，将猪脑加入质量浓度为60％～65％的乙醇水溶液中，在转速1000-1500转/min下搅拌30-60min，得到脑浆液；
(2)在25-30kHz的超声波处理下，将步骤(1)得到的脑浆液在搅拌下加入到液氮中，搅拌转速为500-700转/min，加毕，继续搅拌20-90min，得到混合溶液；
(3)将步骤(3)的混合溶液置于加热至40-50℃的敞口容器中并搅拌，使得混合溶液挥发完全，得到残余物；
(4)将步骤(3)得到的残余物加入丙酮中，搅拌匀浆后过滤，滤饼用体积比为2-5：1的氯仿/甲醇提取三次，合并提取液，在30-40℃下减压浓缩至干，得到所述神经节苷脂提取物。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述乙醇水溶液质量为猪脑质量的30-50倍。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述猪脑在加入乙醇水溶液前，先剥离脑膜血管，并用水清洗处理。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)脑浆液加入时间控制为5-10min。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)液氮质量为脑浆液质量的40-60倍。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)的搅拌速度为800-1000转/min。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中丙酮质量为猪脑质量的2-3倍。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中每次氯仿/甲醇质量为猪脑质量的2-5倍。
9.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的神经节苷脂提取物。
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