CN107459586B - 一种大腹皮多糖及低聚糖的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大腹皮多糖及低聚糖的制备方法及应用，将闪式提取技术与生物酶提技术应用于大腹皮多糖及低聚糖的提取大大提高了大腹皮多糖及低聚糖的提取效率和药材利用率；将多种填料纯化技术联合应用于有大腹皮多糖及低聚糖制备，得到纯度较高的大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖，有效解决了大腹皮多糖及低聚糖的一体化高效制备问题；本发明制备的大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ可有效用于制备增强免疫的药物或保健品，大腹皮低聚糖有效用于制备抗氧化的药物、保健品或食品添加剂及化妆品。

Description

一种大腹皮多糖及低聚糖的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种大腹皮多糖及低聚糖的制备方法及应用。
背景技术
大腹皮为棕榈科植物棋榔Areru catechu L.的干燥果皮，冬季至次春采收未成熟的來实，煮后干燥，纵剖两瓣，剥取果皮，习称“大腹皮”；春末至秋初采收成熟果实，煮后干燥，剥取果皮，打松，晒干，习称“大腹毛”，具有行气宽中，行水消肿的功效，临床用于湿阻气滞，脘腹胀闷，大便不爽，水肿胀满，脚气浮肿，小便不利。目前对其研究主要集中在生物碱类成分，而对大腹皮中的多糖及低聚糖的未见公开报道，尤其是对大腹皮多糖增强机体免疫的活性及低聚糖的抗氧化活性未见有公开报道，并且如何解决一体化制备大腹皮多糖及低聚糖亦未见公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种大腹皮多糖及低聚糖的制备方法，可有效解决腹皮多糖及低聚糖的制备问题和大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用及大腹皮低聚糖在制备具有抗氧化功效的药物、保健品或食品添加剂及化妆品中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种大腹皮多糖及低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取大腹皮，加入大腹皮7.2-13.7倍重量的石油醚(30～60℃)浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量8.9-19.6倍量的体积浓度为77％-85％乙醇，56℃超声提取1.6h-3.7h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.13-1.25的浸膏，依次通过硅藻土柱、氧化铝柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱、纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量7.3-18.6倍的水，60℃浸泡37min-62min，冷却至25℃，加酸调pH至4.2-5.8，摇匀，水浴加热至42℃-57℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的8-15倍，混匀，酶解3.6h-14.8h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量8.2-21.3倍的水，55℃浸泡30min-45min，冷却至30℃，加酸调pH至2.8-4.3，摇匀，水浴加热至47℃-58℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的9-18倍，混匀，酶解4.5h-8.3h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的5.3-12.2倍，5600r/m离心10min-31min，取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％-100％的乙醇，使浓缩液中含醇量为78％-84％(v/v)，静置8h-18h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的氧化铝为中性氧化铝，大孔吸附树脂为HPD-300或ADS-17型大孔吸附树脂，离子交换树脂为732凝胶型阳离子交换树脂，纤维素为纤维素DEAE-32；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.45％-3.36％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的15-28倍量的42℃-48℃的去离子水，溶解，42℃-48℃活化10min-30min,即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.68％-3.82％的果胶酶，加入果胶酶重量的18-35倍量的40℃-50℃的去离子水，溶解，47℃-50℃活化10min-30min，即得活化的果胶酶溶液；本发明实现了大腹皮为原料制备大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖，并将大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ有效用于制备增强免疫的药物或保健品中的应用，将大腹皮低聚糖有效用于制备抗氧化药物、保健品或食品添加剂及化妆品中的应用问题。
本发明制备方法简单，所用原料绿色环保，应用效果好，以大腹皮为原料同时制备大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖，开发了大腹皮的应用范围，大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ可有效用于制备增强免疫的药物或保健品中的应用，大腹皮低聚糖可有效用于制备抗氧化的药物、保健品或食品添加剂及化妆品，具有较好的经济效益和社会效益，是中药上的巨大创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体情况作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出：
实施例1
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取大腹皮，加入大腹皮7.2倍重量的石油醚(30～60℃)浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量8.9倍量的体积浓度为77％乙醇，56℃超声提取1.6h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.13的浸膏，依次通过硅藻土柱、中性氧化铝柱、HPD-300型大孔吸附树脂柱、732凝胶型阳离子交换树脂柱、DEAE-32纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量7.3倍的水，60℃浸泡37min，冷却至25℃，加酸调pH至4.2，摇匀，水浴加热至42℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的8倍，混匀，酶解3.6h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量8.2倍的水，55℃浸泡30min，冷却至30℃，加酸调pH至2.8，摇匀，水浴加热至47℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的9倍，混匀，酶解4.5h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的5.3倍，5600r/m离心10min，取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液中含醇量为78％(v/v)，静置8h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.45％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的15倍量的42℃的去离子水，溶解，42℃活化10min，即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.68％的果胶酶，加入果胶酶重量的18倍量的40℃的去离子水，溶解，47℃活化10min，即得活化的果胶酶溶液。
实施例2
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取大腹皮，加入大腹皮13.7倍重量的石油醚(30～60℃)浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量19.6倍量的体积浓度为85％乙醇，56℃超声提取3.7h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.25的浸膏，依次通过硅藻土柱、中性氧化铝柱、ADS-17型大孔吸附树脂柱、732凝胶型阳离子交换树脂柱、DEAE-32纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量18.6倍的水，60℃浸泡62min，冷却至25℃，加酸调pH至5.8，摇匀，水浴加热至57℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的15倍，混匀，酶解14.8h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量21.3倍的水，55℃浸泡45min，冷却至30℃，加酸调pH至4.3，摇匀，水浴加热至58℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的8倍，混匀，酶解8.3h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的12.2倍，5600r/m离心31min，取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为100％的乙醇，使浓缩液中含醇量为84％(v/v)，静置18h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的3.36％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的28倍量的48℃的去离子水，溶解，48℃活化30min，即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的3.82％的果胶酶，加入果胶酶重量的35倍量的50℃的去离子水，溶解，50℃活化30min，即得活化的果胶酶溶液。
实施例3
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取大腹皮，加入大腹皮10.5倍重量的石油醚(30～60℃)浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量14.3倍量的体积浓度为81％乙醇，56℃超声提取2.7h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.19的浸膏，依次通过硅藻土柱、中性氧化铝柱、HPD-300型大孔吸附树脂柱、732凝胶型阳离子交换树脂柱、DEAE-32纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量12.9倍的水，60℃浸泡50min，冷却至25℃，加酸调pH至5.0，摇匀，水浴加热至50℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的12倍，混匀，酶解9.2h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量14.7倍的水，55℃浸泡38min，冷却至30℃，加酸调pH至3.6，摇匀，水浴加热至53℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的13.5倍，混匀，酶解6.4h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的8.8倍，5600r/m离心20min,取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为97％的乙醇，使浓缩液中含醇量为81％(v/v)，静置13h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的1.91％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的22倍量的45℃的去离子水，溶解，45℃活化20min,即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的2.25％的果胶酶，加入果胶酶重量的26倍量的45℃的去离子水，溶解，49℃活化20min，即得活化的果胶酶溶液。
实施例4
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
(1)取大腹皮，加入大腹皮7.2倍重量的石油醚(30～60℃)浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量19.6倍量的体积浓度为81％乙醇，56℃超声提取1.6h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.25的浸膏，依次通过硅藻土柱、中性氧化铝柱、ADS-17型大孔吸附树脂柱、732凝胶型阳离子交换树脂柱、DEAE-32纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量12.9倍的水，60℃浸泡62min，冷却至25℃，加酸调pH至4.2，摇匀，水浴加热至42℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的15倍，混匀，酶解9.2h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量14.7倍的水，55℃浸泡38min，冷却至30℃，加酸调pH至2.8，摇匀，水浴加热至58℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的13.5倍，混匀，酶解8.3h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的5.3倍，5600r/m离心20min,取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为97％的乙醇，使浓缩液中含醇量为78％(v/v)，静置18h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.45％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的15倍量的45℃的去离子水，溶解，48℃活化10min,即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的3.82％的果胶酶，加入果胶酶重量的18倍量的45℃的去离子水，溶解，47℃活化30min，即得活化的果胶酶溶液。
上述制备的大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ经蒽酮-硫酸法(常规测定方法，是公知技术)测定，其糖含量均不低于95.8％，大腹皮低聚糖含量不低于87.8％；经HPGPC法(公知技术)测定，大腹皮多糖Ⅰ的分子量在30000-45000之间，大腹皮多糖Ⅱ的分子量在55000-75000之间，大腹皮低聚糖的分子量均在300-2000之间。
上述仅是给出的几个实施例，在研制中，发明人经反复多次实验，均取得了相同或相似的结果，方法有效可行，原料丰富，具有较好的实际应用价值，并对大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖进行了反复的试验，均取得了满意的技术效果，有关试验资料如下：
大腹皮多糖的免疫活性实验
一.试验材料
1.试验动物：18.5～23g昆明种清洁剂小鼠，雌雄各半。由郑州大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK(豫)2005-0001；使用许可证号：SCXK(豫)2005-0012)。
2.实验试药：本发明方法制备的大腹皮多糖Ⅰ含量为96.7％、大腹皮多糖Ⅱ含量为97.1％，瑞士染液，香菇多糖(湖北广仁药业有限公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，枸橼酸钠，氯化钙，氯化钠，酒石酸钾钠，氯化钾，葡萄糖，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，酚红。
二.试验方法
1.大腹皮多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠80只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为8组。分别灌服小、中、大剂量的大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于7天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。于第7天灌胃给药后2h，注射5％鸡红细胞4h后，脱颈椎处死小鼠，腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部；然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干；显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
Figure BDA0001396330370000061
Figure BDA0001396330370000062
表1腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
Figure BDA0001396330370000063
Figure BDA0001396330370000064
Figure BDA0001396330370000071
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表1可以看出，与空白对照组比，大腹皮多糖Ⅰ大、中、小剂量组及大腹皮多糖Ⅱ大、中剂量组及香菇多糖组均能显著提高吞噬百分率及吞噬指数(P＜0.01)，其中大腹皮多糖Ⅰ中、大剂量组及大腹皮多糖Ⅱ中剂量组作用较强，与香菇多糖组相当；大腹皮多糖。
2.大腹皮多糖对正常小鼠溶血素形成的影响
取小鼠80只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为8组。分别灌服小、中、大剂量的大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37℃孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-2201型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。
3.大腹皮多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠80只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为8组。分别灌服小、中、大剂量的大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。同时，给药第1天各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组两个小鼠脾脏为一例；匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。
表2溶血素、溶血空斑形成结果
Figure BDA0001396330370000072
Figure BDA0001396330370000081
**表示与空白组比P＜0.01，*表示与空白组比P＜0.05
从表2可以看出，与空白对照组比，大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ大、小剂量组溶血空斑均显著升高(P＜0.05)，中剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血空斑均极显著升高(P＜0.01)。其中尤以大腹皮多糖Ⅰ中剂量组作用为最优。
4.大腹皮多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠90只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为9组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共8组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)，模型组建立完成后，分别灌服大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ小、中、大剂量的水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药7天。于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用移液枪吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀；吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cm×2cm。将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中，37℃孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。
表3腹腔巨噬细胞吞噬功能结果
Figure BDA0001396330370000082
Figure BDA0001396330370000083
Figure BDA0001396330370000091
**表示与模型组比P＜0.01
从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比，大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ大、中、小剂量组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P＜0.01)。
5.大腹皮多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
取小鼠90只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为9组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共8组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ小、中、大剂量水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。最后1次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清；以生理盐水1∶100稀释后，取1ml稀释液与5％鸡红细胞混悬液0.5ml、10％补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀；37℃孵育30min，冰水中终止反应，另设不加补体的空白管作对照；吸取各管上清液于UV-2201型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况，结果见表4。
6.大腹皮多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
取小鼠90只，体重18.5～23g，雌雄各半，随机均匀分为9组。除空白对照组外，其余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共8组(剂量为8mg/ml；第1、2、3天连续腹腔注射)；模型组建立完成后，各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫；并开始分别灌服大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ小、中、大剂量水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)，每天给药1次，连续给药7天。于最后1次给药后2h，脱颈椎处死并解剖小鼠，取出脾脏，同组中两个小鼠脾脏为一例，匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5×106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2％鸡红细胞混悬液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37℃孵育1h，离心，取上清液于UV-2201型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况，结果见表4。
表4溶血素、溶血空斑形成结果
Figure BDA0001396330370000101
Figure BDA0001396330370000102
**表示与模型组比P＜0.01
从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑均显著降低(P＜0.01)，说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ大、中、小剂量组及香菇多糖组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以0.2g/kg剂量组大腹皮多糖Ⅰ为最佳。
大腹皮低聚糖抗氧化活性实验
一、实验材料
(1)实验动物 选用40只普通级昆明种小鼠，鼠龄2个月，体重18.5～23g，雌雄各半。由郑州大学医学院动物实验中心提供(合格证号：SCXK(豫)2005-0001；使用许可证号：SCXK(豫)2005-0012)。
(2)实验试药丙二醛(MDA)测定试剂盒，生化试剂，南京建成生物工程研究所；超氧化物岐化酶(SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽酶(GSH-PX)测试盒，南京建成生物工程研究所；本发明制备的大腹皮低聚糖含量为89.1％。
二、实验方法
(1)动物的喂养与取样 取体重18.5～23g的昆明种小鼠40只,适应性饲养1周后,随机分成4组,每组10只。分别为空白组、大腹皮低聚糖低剂量组(100mg/kg)、大腹皮低聚糖中剂量组(200mg/kg)、大腹皮低聚糖高剂量组(400mg/kg)，连续15天口服给药(空白对照组给等量纯净水)，每天小鼠给药体积为0.2mL/10g。末次给药后24h，处死动物，分别取小鼠血清及制备10％肝组织匀浆，待测。
制备10％小鼠肝组织匀浆：取肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，称0.5g，放入5mL-10mL的小烧杯内，取总量(总量为4.5mL)2/3的生理盐水于烧杯中，用眼科剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入匀浆管中，用剩余1/3的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中，进行匀浆，使组织匀浆化,将匀浆液离心(3000r/min，10min)，取适量上清液进行以下测定。
血清制备：摘眼球取出血样，37℃水浴30min加速血液凝固。血液凝固后用竹签沿试管四周轻轻剥离血块使血清尽快自行析出，然后2500r/min离心10min，用吸管吸出上层血清备用。
(2)检测方法
蛋白质含量测定：采用考马斯亮兰法。蛋白质分子具有-NH3 +基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3 +基团结合，致使溶液变蓝，通过测定吸收度可计算出样品中蛋白质的含量。具体操作详见试剂盒说明书。
SOD测定：采用黄嘌呤氧化酶法。血清中SOD活力以每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU)，即U/mL；组织中SOD活力以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐，即U/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
GSH-Px测定：采用二硫对硝基苯甲酸法测定，具体操作详见试剂和说明书，血清单位为U/mL，组织单位为U/mgprot。
MDA测定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，过氧化脂质降解产物中MDA可与TBA缩合，形成的红色产物在523nm处有最大吸收峰，因底物为TBA，所以此法称TBA法。血清单位为nmol/mL，组织单位为nmol/mgprot。具体操作详见试剂盒说明书。
表5大腹皮低聚糖对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、MDA的影响
Figure BDA0001396330370000111
Figure BDA0001396330370000112
*表示与空白组相比P＜0.05，**表示与空白组比P＜0.01
从表5可以看出，与空白组比较，大、中剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性提高极显著(P＜0.01)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)；小剂量组肝组织中SOD活性极显著提高(P＜0.01)，GSH-Px活性显著提高(P＜0.05)，MDA水平降低极显著(P＜0.01)。
表6大腹皮低聚糖对小鼠血清中SOD、GSH-Px的影响
Figure BDA0001396330370000113
Figure BDA0001396330370000114
*表示与空白组相比P＜0.05，**表示与空白组比P＜0.01
从表6可见，与空白组相比，大腹皮低聚糖大剂量组的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性极显著提高(P＜0.01)，中剂量组的小鼠血清中GSH-Px活性极显著提高(P＜0.01)、SOD活性显著提高(P＜0.05)，小剂量组小鼠血清中SOD和GSH-Px活性亦均有显著性提高(P＜0.05)。
从上述资料可以看出，本发明制备的大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ具有很好的增强机体免疫力的作用，完全具备开发为增强免疫力药物或保健品的潜力及实际推广价值；大腹皮低聚具有较好的抗氧化作用，可作为抗氧化的药物、保健品或食品添加剂开发，由于其抗氧化活性，也可加入美白化妆品中应用。开发研究大腹皮多糖及低聚糖不仅拓宽中药大腹皮应用的新前景，更是紧随时代步伐对中医药的创造性贡献，具有实际的应用价值和巨大经济及社会效益，是中药上创新。

Claims (4)

1.一种大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用，大腹皮低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品或食品添加剂及化妆品中的应用，所述大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖是通过以下方法制备得到：
(1)取大腹皮，加入大腹皮7.2-13.7倍重量的沸程30～60℃的石油醚浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量8.9-19.6倍量的体积浓度为77％-85％乙醇，56℃超声提取1.6h-3.7h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.13-1.25的浸膏，依次通过硅藻土柱、氧化铝柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱、纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量7.3-18.6倍的水，60℃浸泡37min-62min，冷却至25℃，加酸调pH至4.2-5.8，摇匀，水浴加热至42℃-57℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的8-15倍，混匀，酶解3.6h-14.8h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量8.2-21.3倍的水，55℃浸泡30min-45min，冷却至30℃，加酸调pH至2.8-4.3，摇匀，水浴加热至47℃-58℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的9-18倍，混匀，酶解4.5h-8.3h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的5.3-12.2倍，5600r/m离心10min-31min，取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％-100％的乙醇，使浓缩液含醇量以体积浓度计为78％-84％，静置8h-18h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的氧化铝为中性氧化铝，大孔吸附树脂为HPD-300或ADS-17型大孔吸附树脂，离子交换树脂为732凝胶型阳离子交换树脂，纤维素为纤维素DEAE-32；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.45％-3.36％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的15-28倍量的42℃-48℃的去离子水，溶解，42℃-48℃活化10min-30min，即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.68％-3.82％的果胶酶，加入果胶酶重量的18-35倍量的40℃-50℃的去离子水，溶解，47℃-50℃活化10min-30min，即得活化的果胶酶溶液。
2.根据权利要求1所述的大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用，大腹皮低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品或食品添加剂及化妆品中的应用，其特征在于，所述大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖是通过以下方法制备得到：
(1)取大腹皮，加入大腹皮7.2倍重量的沸程30～60℃的石油醚浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量8.9倍量的体积浓度为77％乙醇，56℃超声提取1.6h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.13的浸膏，依次通过硅藻土柱、氧化铝柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱、纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量7.3倍的水，60℃浸泡37min，冷却至25℃，加酸调pH至4.2，摇匀，水浴加热至42℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的8倍，混匀，酶解3.6h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量8.2倍的水，55℃浸泡30min，冷却至30℃，加酸调pH至2.8，摇匀，水浴加热至47℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的9倍，混匀，酶解4.5h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的5.3倍，5600r/m离心10min，取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为95％的乙醇，使浓缩液含醇量以体积浓度计为78％，静置8h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的氧化铝为中性氧化铝，大孔吸附树脂为HPD-300型大孔吸附树脂，离子交换树脂为732凝胶型阳离子交换树脂，纤维素为纤维素DEAE-32；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.45％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的15倍量的42℃的去离子水，溶解，42℃活化10min，即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.68％的果胶酶，加入果胶酶重量的18倍量的40℃的去离子水，溶解，47℃活化10min，即得活化的果胶酶溶液。
3.根据权利要求1所述的大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用，大腹皮低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品或食品添加剂及化妆品中的应用，其特征在于，所述大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖是通过以下方法制备得到：
(1)取大腹皮，加入大腹皮10.5倍重量的沸程30～60℃的石油醚浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量14.3倍量的体积浓度为81％乙醇，56℃超声提取2.7h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.19的浸膏，依次通过硅藻土柱、氧化铝柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱、纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量12.9倍的水，60℃浸泡50min，冷却至25℃，加酸调pH至5.0，摇匀，水浴加热至50℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的12倍，混匀，酶解9.2h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量14.7倍的水，55℃浸泡38min，冷却至30℃，加酸调pH至3.6，摇匀，水浴加热至53℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的13.5倍，混匀，酶解6.4h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的8.8倍，5600r/m离心20min,取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为97％的乙醇，使浓缩液含醇量以体积浓度计为81％，静置13h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的氧化铝为中性氧化铝，大孔吸附树脂为HPD-300型大孔吸附树脂，离子交换树脂为732凝胶型阳离子交换树脂，纤维素为纤维素DEAE-32；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的1.91％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的22倍量的45℃的去离子水，溶解，45℃活化20min,即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的2.25％的果胶酶，加入果胶酶重量的26倍量的45℃的去离子水，溶解，49℃活化20min，即得活化的果胶酶溶液。
4.根据权利要求1所述的大腹皮多糖Ⅰ及大腹皮多糖Ⅱ在制备增强免疫力的药物或保健品中的应用，大腹皮低聚糖在制备抗氧化的药物、保健品或食品添加剂及化妆品中的应用，其特征在于，所述大腹皮多糖Ⅰ、大腹皮多糖Ⅱ及大腹皮低聚糖是通过以下方法制备得到：
(1)取大腹皮，加入大腹皮7.2倍重量的沸程30～60℃的石油醚浸泡15min，置于闪式提取器中提取2.9min，过滤，药渣45℃减压干燥，加大腹皮重量19.6倍量的体积浓度为81％乙醇，56℃超声提取1.6h，过滤，药渣55℃减压挥尽溶剂作为大腹皮药渣A备用，滤液48℃减压回收溶剂，50℃减压浓缩成40℃时比重为1.25的浸膏，依次通过硅藻土柱、氧化铝柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱、纤维素柱，得洗脱液，最后将所得洗脱液减压浓缩，冷冻干燥即得大腹皮低聚糖；
(2)在步骤(1)中的大腹皮药渣A中加大腹皮药渣A重量12.9倍的水，60℃浸泡62min，冷却至25℃，加酸调pH至4.2，摇匀，水浴加热至42℃，加入活化的纤维素酶溶液，加入纤维素酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的15倍，混匀，酶解9.2h，过滤，得滤液Ⅰ及大腹皮药渣B，备用；取大腹皮药渣B加大腹皮药渣A重量14.7倍的水，55℃浸泡38min，冷却至30℃，加酸调pH至2.8，摇匀，水浴加热至58℃，加入活化的果胶酶溶液，加入果胶酶溶液的量为大腹皮药渣A重量的13.5倍，混匀，酶解8.3h，过滤，得滤液Ⅱ；将滤液Ⅰ与滤液Ⅱ混合均匀，灭酶后放至室温，sevage法脱蛋白，得大腹皮多糖溶液，大腹皮多糖溶液减压回收溶剂至大腹皮药渣A重量的5.3倍，5600r/m离心20min,取上清液即得大腹皮多糖浓缩液，将大腹皮多糖浓缩液在搅拌下加入体积浓度为97％的乙醇，使浓缩液含醇量以体积浓度计为78％，静置18h，滤去上部液体，得底部沉淀物，冷冻干燥得大腹皮多糖，加大腹皮多糖21倍重量的水溶解，过丙烯葡聚糖Sephacryl S-300HR凝胶柱，得到2个组分的洗脱液，分别冷冻干燥，得大腹皮多糖Ⅰ和大腹皮多糖Ⅱ；所述的氧化铝为中性氧化铝，大孔吸附树脂为ADS-17型大孔吸附树脂，离子交换树脂为732凝胶型阳离子交换树脂，纤维素为纤维素DEAE-32；所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或硝酸中的一种或几种的混合；所述纤维素酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的0.45％的纤维素酶，加入纤维素酶重量的15倍量的45℃的去离子水，溶解，48℃活化10min,即得活化的纤维素酶溶液；所述果胶酶溶液的制备方法为：称取大腹皮重量的3.82％的果胶酶，加入果胶酶重量的18倍量的45℃的去离子水，溶解，47℃活化30min，即得活化的果胶酶溶液。
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