CN107474150B - 一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法及应用，以醇浸后鹧鸪菜为原料，加入水，超声提取，离心，留取上清液，减压浓缩、醇沉，沉淀物用Sevag法脱蛋白；然后，通过透析去除鹧鸪菜多糖中所含的海人草酸，醇沉、离心，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥得鹧鸪菜多糖；本发明制备的鹧鸪菜多糖具有良好的抗氧化活性，本发明能有效、充分利用鹧鸪菜资源，方法简单易行。

Description

一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法及应用

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法及应用。

背景技术

鹧鸪菜Caloglossa leprieurii属红藻门仙菜目红叶藻科，具有驱虫杀虫、健脾化痰、消积、安神等功效，能治疗小儿因虫积或食积而至的腹胀腹痛、消化不良，是一种药食二用的海藻。国内外对鹧鸪菜化学成分的报道较少，主要分离出海人草酸、甾醇、溴代倍半萜烯、糖苷铵、甘露醇等活性成分。

多糖具有调节机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用，尤其是海藻硫酸酯多糖具有良好的抗病毒、清除自由基、抗蛋白非糖基化等功效，在保健品、食品添加剂、药品等领域具有广泛的潜在应用价值。目前，未见有关海藻鹧鸪菜多糖的提取报道。

研究鹧鸪菜化学成分，一般需要首先用醇浸泡鹧鸪菜，然后对醇溶液进一步处理，而鹧鸪菜残渣虽含有丰富多糖，但常被作为废物丢弃。为了综合开发利用鹧鸪菜资源，提高资该源利用率，以醇浸后鹧鸪菜为原料，开发鹧鸪菜多糖提取技术具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作便捷、原料利用率高的鹧鸪菜多糖的超声辅助提取方法，且所得鹧鸪菜多糖具有良好的抗氧化性能。该发明提取工艺适用于醇浸后鹧鸪菜，也适用于未经过醇浸的鹧鸪菜。具体技术方案如下：

一种鹧鸪菜多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)捣碎：用组织捣碎机将预处理过的鹧鸪菜捣碎；

2)提取：在1)捣碎鹧鸪菜中加入蒸馏水，固液比为1g:20-60mL，超声功率为100-500w，在20-70℃条件下，超声提取2-48min，提取1-3次；

3)离心浓缩：离心分离2)所得混合物，将上清液用旋转蒸发仪在50-60℃时浓缩，直至浓缩液体积为浓缩前体积的1/6-1/5；

4)脱蛋白：在3)浓缩液中加入sevag试剂，萃取分离出上清液；

5)透析：将4)上清液用透析袋透析；

6)浓缩：将5)透析后溶液用旋转蒸发仪在50-60℃时浓缩，直至浓缩液体积为浓缩前体积的1/15-1/10；

7)醇沉：于搅拌条件下，向6)浓缩液中加入浓缩液体积4-5倍的乙醇，降温至0-4℃，静置10-15小时；

8)离心：将7)醇沉静置后的混合物离心，收集沉淀物；

9)润洗干燥：依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤8)沉淀物，于50-60℃烘干即得到鹧鸪菜多糖；

优选地，步骤1)中鹧鸪菜预处理方法是先将干燥的鹧鸪菜切分成1-2cm,按照1g鹧鸪菜加入10-15mL 95％工业酒精的比例投料，室温浸泡60天，过滤，滤液留存；按相同固液比，滤渣继续用80％工业酒精在50℃提取2小时，重复提取1次，过滤，滤液留存，滤渣干燥后即为本发明原料；上述滤液用于研究鹧鸪菜化学成分，不在本发明涉及范围；所用组织捣碎机为实验室用型。

优选地，步骤2)中超声波参数设置为每超声2秒停3秒，超声提取时间指实际超声运行时间，比如本发明中超声提取时间4min表示：设置超声时间为10min，其中超声处理样品时间总计是4min，停歇总计6min；

优选地，步骤2)中本发明所述的鹧鸪菜多糖的提取方法中，最优选的技术特征是：提取时，鹧鸪菜与蒸馏水固液比1:50，超声功率350w，在60℃超声提取28min，提取2次。

优选地，步骤4)中所述sevag试剂组成是体积比为4:1的氯仿与正丁醇，脱除次数要通过紫外光谱中200-400nm处吸光度确定；浓缩液与sevag试剂的体积比为5-4:1。

优选地，步骤5)中透析使用的透析袋规格是8000-14000截留分子量，透析2小时，换水继续透析，重复2-3次。

优选地，步骤3)和步骤8)中离心的转速为8000-10000rpm，离心15-20min。

优选地，步骤9)中所用有机溶剂的量为沉淀物重量的1-2倍。

此外，本发明还提供了用上述方法提取的鹧鸪菜多糖。

本发明的优点和有益效果：

1、本发明首次提供了从海藻鹧鸪菜Caloglossa leprieurii提取多糖的方法，尤其是以醇浸后鹧鸪菜为原料，提高了鹧鸪菜利用率，同时，醇浸液可用于鹧鸪菜活性成分研发，一举多得，为充分开发利用鹧鸪菜资源奠定了基础。

2、本发明采用超声波辅助法提取鹧鸪菜多糖，操作简单，提取时间短，并且该方法可用于没有经过醇浸的鹧鸪菜作为原料提取多糖。

3、本发明所得的鹧鸪菜多糖具有良好的抗氧化活性。鹧鸪菜多糖浓度为400μg/mL时，其清除DPPH自由基的清除率为38.3％，略高于同条件下80μg/mL V_C清除DPPH自由基的清除率(34.6％)。

附图说明

图1是脱蛋白后鹧鸪菜多糖的紫外吸收光谱图。

图2是经透析的脱蛋白后鹧鸪菜多糖的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例以及说明书附图1-2对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本实施例中超声提取鹧鸪菜多糖的方法，按以下步骤操作：

按固液比1:20-60(g:mL),将用组织捣碎机捣碎的预处理过的鹧鸪菜中加入蒸馏水，在超声波中进行超声处理，超声功率100-500w，提取温度20-70℃，处理时间4-48min，离心分离，上清液为鹧鸪菜多糖提取液，沉淀物为鹧鸪菜残渣，留取上清液，得第一次提取多糖液，沉淀物按相同固液比加水，再重复上述操作，可得到第二次、第三次多糖提取液，合并、定容，即得到超声提取鹧鸪菜的多糖提取液。通过计算得到鹧鸪菜多糖的提取率。

采用苯酚-硫酸法测量按上述步骤所得鹧鸪菜多糖提取液中多糖的含量(李宏睿等,山药多糖提取工艺的优化及抗氧化活性的测定,安徽农业科学,2011,39(6):3322-3324)。以葡萄糖为标准品，在490nm比色测定多糖提取液的吸光度，以吸光度(A)与多糖质量浓度(c)进行线性回归，得回归方程为：A＝1.9679c+0.0523，r＝0.9921。

鹧鸪菜多糖提取率按下面公式计算：

多糖提取率(％)＝[提取液中多糖浓度(g/mL)×提取液体积(mL)/原料质量(g)]×100％

实施例2：

本实施例是超声提取鹧鸪菜多糖的提取条件的优化实验。

(1)超声提取鹧鸪菜多糖的单因素实验

①超声功率对鹧鸪菜多糖提取率的影响

提取的方法步骤同实施例1，固液比、温度、超声时间分别是1g:30mL、20℃和4min，超声功率设置为100、200、300、400和500w，提取次数为1次，所得多糖提取率见表1：

表1

由表1可以看出，超声功率在300w时，鹧鸪菜多糖的提取率较高，选250w、300w、350w为正交实验考察的水平。

②固液比对鹧鸪菜多糖提取率的影响

提取的方法步骤同实施例1，超声功率、温度、超声时间分别是300w、20℃和4min，固液比设置为1:20、1:30、1:40、1:50和1:60(g:mL)，提取次数为1次，所得鹧鸪菜多糖提取率见表2：

表2

由表2可以看出，固液比为1:50时，鹧鸪菜多糖的提取率较高，选1:40、1:45、1:50为正交实验考察的水平。

③超声时间比对鹧鸪菜多糖提取率的影响

提取的方法步骤同实施例1，超声功率、温度、固液比分别是300w、20℃和1:50(g:mL)，超声时间设置为2、4、8、12、16、20、24、32、40和48min，提取次数为1次，所得鹧鸪菜多糖提取率见表3：

表3

由表3可以看出，超声时间为32min时，鹧鸪菜多糖的提取率较高，选择24、28和32min为正交考察的水平。

④提取次数对鹧鸪菜多糖提取率的影响

提取的方法步骤同实施例1，超声功率、温度、固液比、超声时间分别是300w、20℃、1:50(g:mL)和32min，提取次数为1次、2次和3次，所得鹧鸪菜多糖提取率见表4：

表4

由表4可以看出，提取次数为2次时，鹧鸪菜提取效率较高，选择1次、2次和3次为正交实验考察的水平。

⑤提取温度对鹧鸪菜多糖提取率的影响

提取的方法步骤同实施例1，超声功率、固液比、超声时间分别是300w、1:50(g:mL)和32min，提取次数为2次，提取温度设置为20、30、40、50、60和70℃，所得鹧鸪菜多糖提取率见5：

表5

由表5可以看出，提取温度在60℃时，鹧鸪菜多糖的提取率较高，60℃为最佳提取温度。

(2)超声提取鹧鸪菜多糖条件优化的正交实验

根据单因素实验结果，确定优化超声提取鹧鸪菜多糖正交实验的因素为固液比(A)、超声时间(B)、超声功率(C)和提取次数(D)，提取温度确定为60℃，每个因素各选择3个水平，按正交设计表L₉(3⁴)进行实验，因素水平表见表6.

表6

以鹧鸪菜多糖的提取率为评价指标，确定最适宜的提取条件，正交实验结果见表7。

表7

由表7的结果可以看出，影响鹧鸪菜多糖提取率的因素主次顺序为D>B>C>A，综合各因素的K值和R值并结合软件分析，得到超声提取鹧鸪菜多糖的最佳提取工艺条件是A3B2C3D2，即固液比1:50(g:mL)，超声时间28min，超声功率350w，提取温度60℃，提取次数2次，在此条件下，鹧鸪菜多糖提取率为14.51％。

实施例3：

1)按照实施例2的最佳工艺条件得到鹧鸪菜多糖提取液；

2)将1)所得提取液用旋转蒸发仪在60℃时浓缩，直至浓缩液体积为浓缩前体积的1/6；

3)在2)浓缩液中加入sevag试剂，萃取分离出上清液，脱除8次，取样，测定样品1的紫外吸收光谱，见图1；

4)将3)除蛋白后的溶液置于透析袋中，透析3次，得到去除海人草酸的鹧鸪菜多糖提取液，取样，测定样品2的紫外可见吸收光谱，见图2；

从图1可以看出，除蛋白后的鹧鸪菜多糖提取液在300-350nm之间，有一个明显的宽峰；而图2在此波长范围内，没有任何吸收峰，说明经过透析处理，可以有效去除脱蛋白后鹧鸪菜多糖中所含的海人草酸。

实施例4：

1)将实施例3得到的透析后鹧鸪菜多糖提取液用旋转蒸发仪在60℃时浓缩，直至浓缩液体积为浓缩前体积的1/10；

2)于搅拌条件下，向1)浓缩液中加入浓缩液体积5倍的乙醇，降温至0-4℃，静置15小时，后于10000rpm离心15min，收集沉淀物；

3)依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2)所得的沉淀物，于60℃烘干即得到鹧鸪菜多糖；

4)将3)得到的多糖进行抗氧化评价，采用DPPH法(邱松山等,无花果多糖提取工艺及抗氧化活性研究,食品与机械,2011,27(1):40-42)测定3)得到的鹧鸪菜多糖对DPPH自由基的清除作用。

具体评价方法如下：在10mL具塞试管中加入2mL 40μg/mL DPPH乙醇溶液，加入一定量的鹧鸪菜多糖溶液或VC溶液，用50％乙醇定容到5mL，摇匀，置于37℃水浴锅中，避光反应30min，以乙醇为参比，空白对照以乙醇代替样品。反应结束后立即用紫外分光光度计测514nm处吸光度A值，鹧鸪菜多糖及VC对DPPH的清除率按照下面公式进行计算：

DPPH清除率/％＝[1-(A_i-A_j)]×100％/A₀

其中：A₀是空白对照的吸光度；A_i是加样品液后吸光度；A_j是样品液本底吸收。

结果发现，当VC质量浓度为80μg/mL时，V_C清除DPPH自由基的清除率为34.6％，而相同条件下，鹧鸪菜多糖浓度为400μg/mL时，其清除DPPH自由基的清除率(38.3％)略高于80μg/mL VC；说明本发明方法提取的鹧鸪菜多糖具有良好的抗氧化活性。

以上详细描述了本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）捣碎：用组织捣碎机将预处理过的鹧鸪菜捣碎；鹧鸪菜预处理方法是先将干燥的鹧鸪菜切分成1-2cm, 按照1g鹧鸪菜加入10-15 mL 95%工业酒精的比例投料，室温浸泡60天，过滤，滤液留存；按相同固液比，滤渣继续用80%工业酒精在50℃提取2小时，重复提取1次，过滤，滤液留存，滤渣干燥后即为本发明原料；

2）提取：在步骤1）捣碎鹧鸪菜中加入蒸馏水，固液比为1g:20 mL -1g:60mL，超声功率为100-500w，在20-70℃条件下，超声提取2-48min，提取1-3次；

3）离心浓缩：离心分离步骤2）所得混合物，将上清液用旋转蒸发仪在50-60℃时浓缩，直至浓缩液体积为浓缩前体积的1/6-1/5；

4）脱蛋白：在步骤3）浓缩液中加入sevag试剂，萃取分离出上清液；

5）透析：将步骤4）上清液用透析袋透析；

6）浓缩：将步骤5）透析后溶液用旋转蒸发仪在50-60℃时浓缩，直至浓缩液体积为浓缩前体积的1/15-1/10；

7）醇沉：于搅拌条件下，向步骤6）浓缩液中加入浓缩液体积4-5倍的乙醇，降温至0-4℃，静置10-15小时；

8）离心：将步骤7）醇沉静置后的混合物离心，收集沉淀物；

9）润洗干燥：依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤步骤8）沉淀物，于50-60℃烘干即得到鹧鸪菜多糖。

2.根据权利要求1所述的一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于步骤2）中超声波参数设置为每超声2秒停3秒，超声提取时间指实际超声运行时间，超声提取时间4min表示：设置超声时间为10min，其中超声处理样品时间总计是4min，停歇总计6min。

3.根据权利要求1所述的一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于步骤2）中提取时，鹧鸪菜与蒸馏水固液比1:50，超声功率350w，在60℃超声提取28min，提取2次。

4.根据权利要求1所述的一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于步骤4）中所述sevag试剂组成是体积比为4:1的氯仿与正丁醇，脱除次数要通过紫外光谱中200-400nm处吸光度确定；浓缩液与sevag试剂的体积比为5:1-4:1。

5.根据权利要求1所述的一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于步骤5）中透析使用的透析袋规格是8000-14000截留分子量，透析2小时，换水继续透析，重复2-3次。

6.根据权利要求1所述的一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于步骤3）和步骤8）中离心的转速为8000-10000rpm，离心15-20min。

7.根据权利要求1所述的一种鹧鸪菜多糖的超声提取方法，其特征在于步骤9）中所用有机溶剂的量为沉淀物重量的1-2倍。

8.一种鹧鸪菜多糖，采用权利要求1-7任意一项所述提取的方法取得。