CN102304189B

CN102304189B - 一种提取抗氧化绿豆多糖的方法

Info

Publication number: CN102304189B
Application number: CN 201110203090
Authority: CN
Inventors: 钟葵; 周素梅; 林伟静; 曾志红; 王燕
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-07-20
Also published as: CN102304189A

Abstract

本发明公开了一种提取抗氧化绿豆多糖的方法。本发明提供了一种绿豆皮中提取多糖的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)将绿豆皮与水混匀，得到的混合物；2)将步骤1)得到的混合物在微波反应器中反应、离心取上清液，即得到多糖。本发明的实验证明，本发明以绿豆皮为原料，通过原料预处理、微波辅助提取、浓缩、醇沉、复溶、二次醇沉及冷冻干燥等技术制备绿豆多糖，得率显著提高；多糖纯度为65％-70％，且具有良好的抗氧化功能。

Description

一种提取抗氧化绿豆多糖的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提取抗氧化绿豆多糖的方法。

背景技术

绿豆是我国传统的杂粮作物，具有很好的食用及药用价值，有“食中佳品，济世之食谷”之说。传统中医认为，绿豆具有清热解毒、消炎、利水润肤等功效，现代营养医学研究亦证实绿豆在抑菌、降脂、抗肿瘤以及解除重金属(铅等)中毒方面有显著作用。绿豆皮是绿豆的种皮，又俗称豆衣，古代医书上称有“清风热，去目翳，化斑疹，消肿胀”之功效，而通常认为绿豆的清热功能是由绿豆皮发挥的。现代营养分析表明，绿豆皮主要由膳食纤维构成，其含量高达60％-70％，其中绝大部分是不可溶性膳食纤维；此外，还含有一些具有天然抗氧化物质，如多酚、黄酮、单宁、皂甙等。绿豆皮是常见绿豆制品加工，如绿豆芽、绿豆淀粉、绿豆仁等生产中的副产物，除少量作为中药材外，大部分是作为低附加值的饲料或废弃物，资源未得到充分利用。

多糖(Polysaceharides)是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生物机能密切相关。近年来，大量研究揭示，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖、抗凝血等作用，且与药物相比，对机体的毒副作用小，因此成为当今食品及营养医学领域的研究热点。绿豆皮中富含的膳食纤维绝大部分是多糖类物质，此类多糖的含量如何以及是否具有上述功能活性，目前仍缺乏可靠的研究报道。目前有个别关于绿豆皮中多糖提取工艺的文献报道，采用高温(95℃)水提取或超声辅助提取。有关绿豆皮中多糖提取的专利未见申请。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种绿豆皮中提取多糖的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将绿豆皮与水混匀，得到混合物；

2)将步骤1)得到的混合物在微波反应器中反应、离心取上清液，即得到多糖。

步骤1)中，所述绿豆皮和水的配比为1g∶15mL-20mL，所述绿豆皮和水的配比具体为1g∶15mL、18mL或20mL；

步骤2)中，所述微波反应器的微波功率为500W-900W，所述微波反应器的微波功率具体为500W、700W或900W；所述反应时间为50s-90s，所述反应时间具体为50s、70s或90s；

所述离心的温度为23℃-28℃，所述离心的温度具体为23℃、25℃或28℃，所述离心的转速为4200rpm-5000rpm，所述离心半径为16cm，所述离心的时间为15min-25min；

所述离心的转速具体为4200rpm、4500rpm、5000rpm，所述离心的时间具体为15min、20min、25min。

在步骤1)前还包括如下步骤：

A、将绿豆皮干燥、粉碎，得到粉碎产物；

B、将步骤A得到的粉碎产物用80％(体积百分含量)乙醇水溶液浸泡，过滤、收集滤渣；

C、将步骤B得到的滤渣依次分别用95％(体积百分含量)乙醇水溶液、无水乙醇、丙酮和乙二醚洗涤、干燥，得到脱除小分子糖及色素的绿豆皮；

在步骤2)的离心取上清液后还包括如下步骤D)：

将所述上清液浓缩得到浓缩产物、所述浓缩产物进行乙醇沉淀得到沉淀产物、所述沉淀产物进行干燥，得到干燥产物即为多糖。

步骤A)中，所述干燥的温度为60℃-80℃，所述干燥的温度具体为60℃、70℃或80℃，所述干燥采用烘干的方式，所述粉碎为粉碎至40-80目大小，所述粉碎具体为粉碎至40目、60目或80目大小；

步骤B)中，所述浸泡的时间为4-8h，所述浸泡的时间具体为4h、6h或8h，所述浸泡的温度为23℃-28℃，所述浸泡的温度具体为23℃、25℃或28℃；

步骤C)中，所述干燥的温度为23℃-28℃，所述干燥的温度具体为23℃、25℃或28℃，所述干燥的时间为20h-28h，，所述干燥的时间具体为20h、24h或28h；

步骤D)中，所述浓缩采用真空旋转蒸发浓缩，所述浓缩的温度为55℃-60℃，所述浓缩的温度具体为55℃或60℃，所述浓缩为至所述上清液体积的1/6；

所述乙醇沉淀包括如下步骤：

a、将所述浓缩产物与三倍体积无水乙醇混匀，静置、离心收集一次沉淀产物；

b、将步骤a得到的一次沉淀产物用水溶解、离心收集上清液；

c、将步骤b得到的上清液与三倍体积无水乙醇混匀，静置、离心收集沉淀产物；所述干燥包括如下步骤：

d、将步骤c得到的所述沉淀产物用无水乙醇洗涤、离心取沉淀；

e、将步骤d得到的沉淀于大气压力为0.1Kpa、温度为-45℃--60℃下干燥，得到多糖。

步骤a和步骤c中，所述静置的温度均为2℃-6℃，所述静置的时间均为10h-16h；

所述静置的温度均具体为2℃、4℃或6℃，所述静置的时间均具体为10h、12h或16h；

步骤a、b、c、d中，所述离心的温度为23℃-28℃，所述离心的温度具体为23℃、25℃或28℃，所述离心的转速为4200rpm-5000rpm，所述离心半径为16cm，所述离心的时间为15min-25min；

所述离心的转速具体为4200rpm、4500rpm或5000rpm，所述离心的时间具体为15min、20min或25min；

步骤e中，所述干燥时间为24h-48h，所述干燥时间具体为24h、30h或48h，所述干燥的温度为-45℃、-50℃或-60℃。

由上述方法得到的多糖也是本发明保护的范围。

上述得到的多糖在制备具有抗氧化功能产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述抗氧化功能为清除自由基，所述自由基为DPPH自由基。

上述应用中，所述产品可为保健品、药物或化妆品等。

本发明的实验证明，本发明以绿豆皮为原料，通过原料预处理、微波辅助提取、浓缩、醇沉、复溶、二次醇沉及冷冻干燥等技术制备绿豆多糖，所采用提取方法为微波辅助提取，不仅有利于多糖成分的较充分溶出，得率显著提高；而且微波穿透式内外加热，热量传导快速均匀，只需几十秒或几分钟即可完成，极大节省了提取时间。本发明方法得到的绿豆多糖最终产品得率6.81％～7.00％，多糖纯度为65％～70％，且具有良好的抗氧化功能。本发明利用绿豆皮这一富含植物多糖的副产物资源，采取目前工业应用上较为成熟的微波萃取技术，获得高附加值的功能性绿豆皮多糖。相关技术与产品将带动绿豆加工业的综合利用与增值转化，符合当前我国农产品加工业发展要求，未来产业化前景良好。

附图说明

图1为绿豆皮多糖提取流程图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

绿豆皮从景七绿豆淀粉加工企业购买；微波提取装置为家用微波炉。

实施例1、绿豆皮多糖的制备

多糖提取的流程图如图1所示。

一、多糖提取

1)绿豆皮预处理

将绿豆皮于60℃下烘干，粉碎至40目；80％(体积百分含量)乙醇水溶液浸泡6h，浸泡的温度为23℃，除去滤液；滤渣分别用95％(体积百分含量)乙醇水溶液、无水乙醇、丙酮和乙二醚洗涤，室温(23℃)下干燥24h，得到脱除小分子糖及色素的较纯净绿豆皮。

2)微波提取

取预处理后的绿豆皮5g与90mL(1g∶18mL)蒸馏水混合均匀，置于微波反应器中，在微波功率700W下反应70s，得到微波提取料液。

3)离心

将冷却至室温的微波提取料液离心(23℃，5000rpm，离心半径为16cm，15min)、收集上清液；滤渣用蒸馏水清洗两遍，与上清液合并，得到提取液；

4)浓缩

提取液采用真空旋转蒸发浓缩，温度为55.0℃，至溶液体积浓缩至10mL左右停止(即浓缩至上清液体积的1/6)，得到浓缩液。

5)乙醇沉淀

a、在搅拌状态下，向浓缩液中缓慢加入三倍体积无水乙醇，4℃下静置12h；23℃，5000rpm转速下离心20min，收集一次沉淀产物；

b、将一次沉淀产物用10mL水重新溶解，混合均匀；于5000rpm条件下离心20min，收集上清液；用三倍乙醇复溶，4℃下静置12h；23℃，5000rpm条件下离心20min，收集沉淀产物。

6)干燥

将所得沉淀产物用10mL无水乙醇洗涤离心，重复该操作2次；洗涤后多糖沉淀于真空冷冻条件下干燥(-60℃，0.1KPa)24h，至物料水分含量降至10％以下；得到最终多糖产品。

实验设置三次重复，结果取平均值。

二、多糖组分分析

产品中，水分含量检验采用(GB/T 21305-2007)；总氮含量检测采用凯氏定氮法(GB/T 50095-2003)；多糖含量检验采用苯酚-硫酸法；糖醛酸含量检验采用硫酸-咔唑法。

①苯酚-硫酸法标准曲线绘制

配制100μg/mL葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司)标准液。分别取1、2、3、4、5、6、7、8和9mL的100μg/mL葡萄糖标准液，与去离子水混合定容至10mL，得不同浓度葡萄糖标准溶液。各取1mL不同浓度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL)的葡萄糖标准溶液，加入1.0mL 6％苯酚溶液，混合均匀后再加入5.0mL浓硫酸进行反应。反应混合液静置10min后于25～30℃水浴中放置25min。待溶液颜色稳定后，以试剂空白为对照，于490nm下测定吸光值。以吸光值A为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，得到苯酚-硫酸法标准曲线。

②硫酸-咔唑标准曲线绘制

准确称量50mg咔唑(试剂纯度，公司)，用95％乙醇定容至50mL，配制成浓度为0.1％的咔唑溶液。称取干燥的半乳糖醛酸10mg溶解于100mL去离子水中，配制成0.1mg/mL标准溶液。准确量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL该标准溶液并加去离子水补至1.0mL。冰水浴中向各不同浓度的标准溶液中加6mL浓硫酸溶液，漩涡混合均匀后，于85℃热水浴中保温20min。各标准溶液冷却至室温后，分别加入0.2mL咔唑溶液，室温下保持2h，于530nm下测定其吸光数值。以吸光度A为横坐标，半乳糖醛酸浓度为纵坐标，得到硫酸-咔唑法标准曲线。

③多糖得率计算

取一定量的最终多糖样品，按适当比例加水稀释，按标准曲线制作的实验步骤测定吸光值，再由苯酚-硫酸法标准曲线方程计算总糖含量。多糖得率的计算公式如下：

产品得率(％)＝绿豆多糖质量/绿豆皮原料质量×100％，

实验设3次重复，结果取平均数。

结果表明，上述方法提取得到的绿豆多糖为均匀浅棕色粉末，3次重复实验得到的多糖质量平均为0.348g，3次重复实验的产品得率平均为6.98％。

多糖组分分析结果表明，采用如上方法所得绿豆多糖产品，水分含量为7.24％，粗蛋白含量为11.35％，总糖含量66.25％(体现了多糖纯度，但用总糖含量可能更为准确些)，糖醛酸含量12.54％。

实施例2、绿豆多糖的制备

多糖提取的流程图如图1所示。

一、多糖提取

1)绿豆皮预处理

将绿豆皮于70℃下烘干，粉碎至60目；80％乙醇浸泡4h(25℃)，除去滤液；滤渣分别用95％乙醇、无水乙醇、丙酮和乙二醚洗涤，室温(25℃)下干燥20h，得到脱除小分子糖及色素的较纯净绿豆皮。

2)微波提取

取预处理后的绿豆皮5g与75mL(1g∶15mL)蒸馏水混合均匀，置于微波反应器中，在微波功率500W下反应50s，得到微波提取料液。

3)离心

将冷却至室温的微波提取料液离心(25℃，4500rpm，25min)、收集上清液；滤渣用蒸馏水清洗两遍，与上清液合并，得到提取液；

4)浓缩

提取液采用真空旋转蒸发浓缩，温度为60.0℃，至溶液体积浓缩至10mL左右停止(即浓缩至上清液体积的1/6)，得到浓缩液。

5)乙醇沉淀

a、在搅拌状态下，向浓缩液中缓慢加入三倍体积无水乙醇，2℃下静置16h；25℃，4500rpm转速下离心25min，收集沉淀物；

b、将沉淀物用10mL水重新溶解，混合均匀；25℃，于4500rpm条件下离心25min，收集上清液；用三倍乙醇复溶，2℃下静置16h；4500rpm条件下离心25min，收集沉淀。

6)干燥

将所得沉淀用10mL无水乙醇洗涤离心，重复该操作2次；洗涤后多糖沉淀于真空冷冻条件下干燥(-45℃，0.1KPa)30h，至物料水分含量降至10％以下；得到最终多糖产品。

实验设置三次重复，结果取平均值。

二、多糖组分分析

方法：同实施例1中所述一致。

实验设3次重复，结果取平均数。

结果表明，上述方法提取得到的绿豆多糖为均匀浅棕色粉末，3次重复实验得到的多糖质量平均为0.33g，3次重复实验的产品得率平均为6.82％。

多糖组分分析结果表明，采用如上方法所得绿豆多糖产品，水分含量为7.36％，粗蛋白含量为11.94％，总糖含量65.73％，糖醛酸含量13.07％。

实施例3、绿豆多糖的制备

多糖提取的流程图如图1所示。

一、多糖提取

1)绿豆皮预处理

将绿豆皮于80℃下烘干，粉碎至80目；28℃，80％乙醇浸泡8h，除去滤液；滤渣分别用95％乙醇、无水乙醇、丙酮和乙二醚洗涤，室温(28℃)下干燥28h，得到脱除小分子糖及色素的较纯净绿豆皮。

2)微波提取

取预处理后的绿豆皮5g与100mL(1g∶20mL)蒸馏水混合均匀，置于微波反应器中，在微波功率900W下反应90s，得到微波提取料液。

3)离心

将冷却至室温的微波提取料液离心(28℃，4200rpm，20min)、收集上清液；滤渣用蒸馏水清洗两遍，与上清液合并，得到提取液；

4)浓缩

5)乙醇沉淀

a、在搅拌状态下，向浓缩液中缓慢加入三倍体积无水乙醇，6℃下静置10h；28℃，4200rpm转速下离心15min，收集沉淀物；

b、将沉淀物用10mL水重新溶解，混合均匀；于4200rpm条件下离心25min，收集上清液；用三倍乙醇复溶，6℃下静置10h；4200rpm条件下离心15min，收集沉淀。

6)干燥

将所得沉淀用10mL无水乙醇洗涤离心，重复该操作2次；洗涤后多糖沉淀于真空冷冻条件下(-50℃，0.1KPa)干燥48h，至物料水分含量降至10％以下；得到最终多糖产品。

实验设置三次重复，结果取平均值。

二、多糖组分分析

方法：同实施例1中所述一致。

实验设3次重复，结果取平均数。

结果表明，上述方法提取得到的绿豆多糖为均匀浅棕色粉末，3次重复实验得到的多糖质量平均为0.34g，3次重复实验的产品得率平均为6.72％。

多糖组分分析结果表明，采用如上方法所得绿豆多糖产品，水分含量为7.24％，粗蛋白含量为11.35％，总糖含量67.45％，糖醛酸含量12.54％。

现有从绿豆皮中多糖提取工艺，采用95℃热水、1∶20料水比下搅拌提取3h，之后采用同样的后处理方式，得到绿豆多糖产品得率为4.10％，较本发明的微波法低41.3％；总糖含量为64.46％，与本发明的微波法相近。

实施例4、绿豆多糖的体外抗氧化活性实验

分别用实施例1、2和3得到的绿豆多糖进行DPPH清除效果实验。

方法：准确称取一定量绿豆多糖溶于蒸馏水中，得到50、100、150、200和250μg/mL浓度的样品溶液。依次添加0.1mM DPPH-95％乙醇水溶液1.5mL，样品溶液1.5mL，震荡后于室温下放置30min，517nm测定吸光度。DPPH自由基清除效果计算公式如下：

SA = (1 - \frac{A_{1} - A_{2}}{A_{3}}) \times 100 %

式中SA-清除自由基的能力，％；A₁-DPPH+样品；A₂-95％乙醇水溶液+样品；A₃-DPPH+蒸馏水。

实施例1、2和3中所得绿豆多糖的DPPH清除效果结果如表1所示。

表1绿豆多糖DPPH自由基清除率单位：％

通过表1实施例1、2和3数据的平均值，以DPPH自由基清除效果为横坐标，绿豆多糖浓度为纵坐标作图，得到方程Y＝0.261x+18.38。通过该方程，计算得到绿豆多糖DPPH自由基清除效果的IC₅₀值(IC₅₀值是DPPH自由基清除效果达到50％时绿豆多糖所需浓度)为123.67μg/mL。

IC₅₀值可以体现良好的抗氧化功能，是抗氧化功能评价的一个常用指标，该值没有一个界限值，通常越小表明抗氧化功能越好，一般达到ug级认为抗氧化功能好，从上述看出，本方法提取的多糖的有良好的抗氧化功能。

Claims

1.一种绿豆皮中提取多糖的方法，包括如下步骤：

1）将绿豆皮与水混匀，得到混合物；

2）将步骤1）得到的混合物在微波反应器中反应、离心取上清液，即得到多糖；

步骤1）中，所述绿豆皮和水的配比为1g：15mL-20mL；

步骤2）中，所述微波反应器的微波功率为500W-900W；所述反应时间为50s-90s。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述绿豆皮和水的配比为1g：15mL、1g：18mL或1g：20mL；

步骤2）中，所述微波反应器的微波功率为500W、700W或900W；所述反应时间为50s、70s或90s；

所述离心的温度为23℃-28℃，所述离心的转速为4200rpm-5000rpm，所述离心半径为16cm，所述离心的时间为15min-25min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述离心的温度为23℃、25℃或28℃，所述离心的转速为4200rpm、4500rpm、5000rpm，所述离心的时间为15min、20min、25min。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

在步骤1）前还包括如下步骤：

A、将绿豆皮干燥、粉碎，得到粉碎产物；

B、将步骤A得到的粉碎产物用80%体积百分含量的乙醇水溶液浸泡，过滤、收集滤渣；

C、将步骤B得到的滤渣依次分别用95%体积百分含量的乙醇水溶液、无水乙醇、丙酮和乙二醚洗涤、干燥，得到脱除小分子糖及色素的绿豆皮；

在步骤2）的离心取上清液后还包括如下步骤D）：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤A）中，所述干燥的温度为60℃-80℃，所述干燥采用烘干的方式，所述粉碎为粉碎至40-80目大小；

步骤B）中，所述浸泡的时间为4h-8h，所述浸泡的温度为23℃-28℃；

步骤C）中，所述干燥的温度为23℃-28℃，所述干燥的时间为20h-28h；

步骤D）中，所述浓缩采用真空旋转蒸发浓缩，所述浓缩的温度为55℃-60℃，所述浓缩为至所述上清液体积的1/6；

所述乙醇沉淀包括如下步骤：

c、将步骤b得到的上清液与三倍体积无水乙醇混匀，静置、离心收集沉淀产物；

所述干燥包括如下步骤：

e、将步骤d得到的沉淀于大气压力为0.1Kpa、温度为-45℃～-60℃下干燥，得到多糖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤A）中，所述干燥的温度为60℃、70℃或80℃，所述粉碎为粉碎至40目、60目或80目大小；

步骤B）中，所述浸泡的时间为4h、6h或8h，所述浸泡的温度具体为23℃、25℃或28℃；

步骤C）中，所述干燥的温度为23℃、25℃或28℃，所述干燥的时间为20h、24h或28h；

步骤D）中，所述浓缩的温度为55℃或60℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤a、b、c、d中，所述离心的温度为23℃-28℃，所述离心的转速为4200rpm-5000rpm，所述离心半径为16cm，所述离心的时间为15min-25min；

步骤e中，所述干燥时间为24h-48h，所述干燥的温度为-45℃、-50℃或-60℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

步骤a和步骤c中，所述静置的温度均为2℃、4℃或6℃，所述静置的时间均为10h、12h或16h；

步骤a、b、c、d中，所述离心的温度为23℃、25℃或28℃，所述离心的转速为4200rpm、4500rpm或5000rpm，所述离心的时间为15min、20min或25min；

步骤e中，所述干燥时间为24h、30h或48h。

9.由权利要求1-8中任一所述方法得到的多糖。

10.权利要求9中所述多糖在制备具有抗氧化功能产品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：

所述抗氧化功能为清除自由基；所述自由基为DPPH自由基。