CN101508730B - 一种豆类植物凝集素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种豆类植物凝集素的提取方法，属植物有用成分提取技术领域。为水提法，在40～60℃温度下提取，按以下步骤：豆类种子粉碎到40～100目→加入浸泡液在40～60℃温度下提取60～180分钟并打捞豆皮→粗分去除豆渣→离心分离得含植物凝集素的上清液→对上清液进一步进行分离纯化→浓缩或干燥得植物凝集素。可于提取的全过程或部分过程中施加超声波或微波，或交替施加超声波和微波进行辅助提取。本发明完全抛弃了传统的低温浸泡低温处理方法，实践证明是一种简单高效和短时间的提取植物凝集素的方法。通过有关检测，所得植物凝集素能满足常规的实验及药用需要。本发明克服了现有技术产品有较多化学试剂成分遗留和提取时间长的缺点。
Description
技术领域
本发明属植物有用成分的提取技术领域，具体涉及豆类植物凝集素的提取。
背景技术
凝集素PHA是一种非免疫源性的蛋白质或糖蛋白，在动物、植物及微生物(如细菌、病毒)中广泛存在。豆科植物的凝集素由2个或4个单体组成，每个单体的分子量为25～30KD，有一个结合糖位点。在上千种已发现的凝集素中，属于豆科植物的凝集素就有600多种。凝集素含量在豆类中也有很大差别。例如芸豆的蛋白质含量在17-23％，在蛋白质中又含有2.4-5％的PHA，为含凝集素最高的种类之一。
凝集素不仅具有凝集诸如血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用，而且参与了生物体内的一些重要生理和药理过程，因此是研究生物体内细胞癌变、受精、分化及分子识别等生命过程极其有用的工具，同时在临床医学检验上有着重要地位，而且是抗肿瘤药物(如干扰素、白细胞介素-2等)生产所需的促有丝分裂原。近年来还报道某些凝集素对艾滋病毒等也有抑制作用，并应用于试验性治疗。在体外细胞培养中，植物凝集素可以使淋巴细胞增殖；在整体实验中，植物凝集素可以提高机体的免疫能力。因此，无论从基础研究和运用角度来说，对植物凝集素的需求都是很大的。
对于植物凝集素的提取，有采用乙醚和丙酮及乙醇的提取法，也有采用磷酸缓冲液PBS浸泡的提取法。现有技术的缺点是：前者有较多的化学试剂成分遗留，后者需要在-10℃到+10℃低温长时间的浸泡、浸提和低温冷冻离心分离、提取时间大于48小时。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术产品有较多化学试剂成分遗留和提取时间长的缺点，提供一种新的以豆类为原料的植物凝集素的提取方法。
本发明所述的植物凝集素来源于豆类，特别是芸豆。所提的植物凝集素为分子量约32k的糖蛋白。
本发明为水提法，其特征是在40～60℃温度下提取，按以下步骤：豆类种子粉碎到40～100目→加入浸泡液在40～60℃温度下提取60～180分钟并打捞豆皮→粗分去除豆渣→离心分离得含植物凝集素的上清液→对上清液进一步进行分离纯化→浓缩或干燥得植物凝集素。“加入浸泡液在40～60℃温度下提取”的过程中加以搅拌为好。搅拌的转数最好为60～500转/分。
所说“离心分离得含植物凝集素的上清液”、“对上清液进一步进行分离纯化”以及“浓缩或干燥得植物凝集素”均可以采用已有技术来实现。
本发明完全抛弃了传统的低温浸泡低温处理方法，实践证明本发明是一种简单高效和短时间的提取植物凝集素的方法。
以下是对上述发明过程的进一步优化：
于所说“在40～60℃温度下提取”的全过程或部分过程中施加超声波进行辅助提取，声强为1～40W/cm2；或者施加微波进行辅助提取，微波强度为5～20W/L；或者交替施加超声波和微波进行辅助提取，超声声强为1～40W/cm2，微波强度为5～20W/L。微波是一种高频的电磁波，微波场中的极性分子处于高速摆振状态，分子运动的结果造成了分子间的碰撞和摩擦加剧，因而产生大量的热量。微波加热的优势在于介质内外同时加热，即微波能够同时将能量传递给介质的所有反应活性中心，因此比其他加热体系有更多的活性中心，分子发生碰撞反应在瞬间完成，故而反应速度大大提高。且由此可推知，溶质中含溶剂量较多的地方，易于积聚热量，这同时解释了试验过程中蛋白中水分不均匀的时候，部分蛋白变性甚至糊化的现象。超声波是在弹性介质中传播的一种振动频率高于声波(20kHz)的机械波，能产生并传递强大的能量，给媒质(如固体小颗粒或团聚体)极大的加速度。当颗粒内部接收的能量足以克服固体结构的束缚能时，固体颗粒(或团聚体)被破碎(或解聚)，从而促进细胞内有效成分的溶出；这种能量作用于液体，振动处于稀疏状态时，液体会撕裂成很小的空穴，这些空穴一瞬间即闭合，闭合时产生高达几十个大气压的瞬间压力，即称为空化现象。这种空穴现象可细化各种物质以及制造乳溶液，加速细胞内有效成分的溶出。另外，超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速细胞内有效成分的扩散释放并使其充分与溶剂混合。
温度达到设定温度时，打开超声和微波的装置。超声和微波装置也可以在除去豆皮后就打开。微波和超声可以组合工作，特别是微波和超声最好为顺序工作模式，即使用微波时，超声不工作。所以实际微波或超声的使用时间为总的提取时间的一半。如可维持需要的温度，那么也可不用加热装置而只用微波和超声加搅拌维持温度。
所说“浸泡液”最好为0.8％～1.2％的氯化钠水溶液或pH＝6.5～7.2的磷酸缓冲液PBS，料水比例为1∶4～1∶10。
所说“进一步进行分离纯化”的步骤最好是：将上清液用50％饱和度NH4SO4搅拌后沉淀1～3小时，离心，沉淀物进行透析处理。而沉淀物进行透析处理的步骤又最好是：沉淀物加入到透析袋中，扎紧透析袋两端，把透析袋放入100-300目的尼龙袋中，再放入盛有蒸馏水或去离子水的带搅拌的容器中，以60～120转/分进行搅拌，水温为18～60℃。再优选的参数是：透析袋体积/蒸馏水或去离子水体积＝1∶7～1∶20，透析时间为1.0～3.0小时，透析袋的截留孔径为8000～10000道尔顿。
按进一步优化的工艺，提取所用容器最好用不锈钢板制成，容器设有加热和控温装置，在容器壁上设微波加热头，在容器底部设超声波输出头，容器并设有搅拌装置。豆粉加入后用手工或机械装置通过滤网把漂浮的豆皮打捞收集起来，豆皮可用于提取膳食纤维。可以先开动加热装置把浸泡液加热到40～60℃之间，具体温度视不同的原料而有所改变。加热的同时打开搅拌装置，搅拌转数为60～500转/分，以不起泡沫或少起泡沫为准。达到提取时间后，把容器中的液体和固体物质通过300-350目尼龙滤网过滤并用离心机在室温下以4000转/分，10～20分钟再次离心液体，获得上清液。将上清液用50％饱和度的NH4SO4搅拌后沉淀1～3小时，同上方法离心，取沉淀加入到透析袋中，扎紧透析袋两端。把透析袋放入100-300目的尼龙袋中(目的是保护透析袋在搅拌过程中不会破损)。再放如盛有蒸馏水或去离子水的带搅拌的容器中。该容器可以是前述提取所用的容器。采用60～120转/分进行搅拌。水温可以是常温到60℃之间。透析袋体积(V1)和蒸馏水或去离子水(V2)的体积比V1/V2为1∶7-1∶20之间。其间视情况更换1-3次蒸馏水或去离子水。用AgNO3进行检查，无沉淀是就可结束透析。透析时间为1.0-3.0小时。透析液中为PHA溶液。可采用旋转蒸发仪对PHA溶液进行浓缩。可用常规方法如凯氏定氮，Follin酚或Bedford等方法测定PHA的浓度。得到的PHA通过无菌过滤(孔径为0.45μm或0.22μm的微孔滤膜过滤)后可用于配制有关实验和分析用的培养基和试剂，也可以低温或室温密封保存，也可以冷冻保存。上述浓缩液可用于配制有关实验药剂。透析液或浓缩透析液可进一步经过冷冻干燥处理制成冻干粉长期保存或加入防腐剂后以浓缩液的方式保存。透析液或浓缩透析液可经过适当稀释采用通行的层析方法进行进一步的分离纯化。
通过有关检测和实验证明，得到的植物凝集素能满足常规的实验及药用。这为植物凝集素的广泛运用提供了良好的基础。
本发明的有益效果是克服了现有技术产品有较多化学试剂成分遗留和提取时间长的缺点。
附图说明
附图为采用本发明制备的不同样品PHA和其它标准蛋白质的电泳图。其中：1为1号样品-芸豆；2为2号样品-芸豆；3为3号样品-红豆；4为4号样品-花红豆；5为BSA；6为Marker；7为PHA(北星生物研发部-标样)；8为5号样品-刀豆；9为6号样品-扁豆；10为PHA(层析)。
具体实施方式
见以下实例。
实施例1：芸豆植物凝集素的制备
首先取干燥的芸豆籽粒，自来水洗净3-5分钟，去杂物，然后低温烘干或晾晒干。机械粉碎，过60目筛网，成为豆粉。称取50g豆粉放入聚乙烯袋中，加入250ml 0.9％生理盐水，封口机封口。放入微波炉，设置功率为800W。分为高、中、低三个处理强度组和一个对照组。高强度处理组第一次微波加热时间为60sec，然后放入50-60℃水浴，20min，期间搅动5次，然后进行第二次微波处理30秒，放入容量为6L的100w超声清洗器。在4L水中加3袋处理样，处理10min，然后进行第3次微波处理30秒，放入100w超声清洗器中处理10min，再进行第四次微波处理30秒，同样超声处理10min，进行第五次微波处理30秒，然后进行超声处理10min。共用五次微波处理，总时间为3min，超声处理的总时间为40min。总的提取时间是60min。中等强度处理组也是5次微波处理，第一次为60sec，第2-5次为20sec，间隔时间同高强度处理组。但超声处理时间相应缩短为30min；低强度中等强度处理组也是5次微波处理，第一次为60sec，第2-5次为10sec，间隔时间同高强度处理组。但超声处理时间相应缩短为20min。三组处理的具体步骤见表1.
表1芸豆凝集素提取中的不同处理步骤
达到提取时间后，把容器中的液体和固体物质通过300-350目尼龙滤网过滤并用离心机在室温下以4000转/分，10分钟离心过滤液体，获得上清液。将上清液用50％饱和度的NH4SO4搅拌均匀后低温(4-10℃)静置1-3小时沉淀，同上方法离心，取沉淀加入到透析袋中，扎紧透析袋两端。把透析袋放入100-300目的大尼龙袋中(目的是保护透析袋在搅拌过程中不会破损)。再放如盛有蒸馏水或去离子水的带搅拌的容器中。该容器可以上面步骤中所用的容器。采用60-120转/分进行搅拌。水温可以是常温到50℃之间。透析袋体积(V1)和蒸馏水或去离子水(V2)的体积比V1/V2为1∶7-1∶20之间。其间视情况更换1-3次蒸馏水或去离子水。用AgNO3进行检查，无沉淀是就可结束透析。透析时间为1.0-3.0小时。透析液中为PHA溶液。
表240-60℃不同微波和超声组合对芸豆PHA的提取率
实施例2：芸豆植物凝集素的制备
在本实施例中，处理量和方法同实施例2。仅改变温度设置为30-40℃。经测定，在30-40℃的温度范围内，高中低三种微波和超声组合的PHA提取结果见表2.
表330-40℃不同微波和超声组合对芸豆PHA的提取率
实施例3：扁豆植物凝集素的制备
在本实施例中，采用两种温度处理，即40-60℃处理2小时和4-10℃冰箱处理12-14小时。未施加微波和超声波处理。
扁豆的预处理方式同实施例1。粉碎的豆粉过60目筛网。按加入1∶5加入同实施例1的生理盐水或磷酸缓冲液。分别放入40-60℃保温容器和4-10℃冰箱处理。间隔15-30min搅拌一次。40-60℃保温提取组的提取时间是2小时，4-10℃冰箱处理12-14小时。提取结束后的处理同实施例1。结果见表4。
表440-60℃与4-10℃条件下的扁豆植物凝集素的提取率
实施例4：绿豆植物凝集素的制备
在本实施例中，采用两种温度处理，即40-60℃处理2小时和4-10℃冰箱处理12-14小时。未施加微波和超声波处理。
绿豆的预处理方式同实施例1。粉碎的豆粉过60目筛网。按加入1∶5加入同实施例1的生理盐水或磷酸缓冲液。分别放入40-60℃保温容器或4-10℃冰箱处理。间隔15-30min搅拌一次。40-60℃保温提取组的提取时间是2小时，4-10℃冰箱处理12-14小时。提取结束后的处理同实施例1。结果见表5。
表540-60℃与4-10℃条件下的绿豆植物凝集素的提取率
实施例5：刀豆植物凝集素的制备
在本实施例中，采用两种温度处理，即40-60℃处理2小时和4-10℃冰箱处理12-14小时。未施加微波和超声波处理。
刀豆的预处理方式同实施例1。粉碎的豆粉过60目筛网。按加入1∶5加入同实施例1的生理盐水或磷酸缓冲液。分别放入40-60℃保温容器或4-10℃冰箱处理。间隔15-30min搅拌一次。40-60℃保温提取组的提取时间是2小时，4-10℃冰箱处理12-14小时。提取结束后的处理同实施例1。结果见表6。
表640-60℃与4-10℃条件下的刀豆植物凝集素的提取率
实施例6：红豆植物凝集素的制备
在本实施例中，采用两种温度处理，即40-60℃处理2小时和4-10℃冰箱处理12-14小时。未施加微波和超声波处理。
扁豆的预处理方式同实施例1。粉碎的豆粉过60目筛网。按加入1∶5加入同实施例1的生理盐水或磷酸缓冲液。分别放入40-60℃保温容器或4-10℃冰箱处理。间隔15-30min搅拌一次。40-60℃保温提取组的提取时间是2小时，4-10℃冰箱处理12-14小时。提取结束后的处理同实施例1。结果见表7。
表740-60℃与4-10℃条件下的红豆植物凝集素的提取率
实施例7：红花豆植物凝集素的制备
在本实施例中，采用两种温度处理，即40-60℃处理2小时和4-10℃冰箱处理12-14小时。未施加微波和超声波处理。
红花豆的预处理方式同实施例1。粉碎的豆粉过60目筛网。按加入1∶5加入同实施例1的生理盐水或磷酸缓冲液。分别放入40-60℃保温容器或4-10℃冰箱处理。间隔15-30min搅拌一次。40-60℃保温提取组的提取时间是2小时，4-10℃冰箱处理12-14小时。提取结束后的处理同实施例1。结果见表8.
表840-60℃与4-10℃条件下的扁豆植物凝集素的提取率
实施例9：芸豆植物凝集素制备的系列实验
取干燥的芸豆籽粒，自来水洗净3-5分钟，去杂物，然后低温烘干或晾晒干。机械粉碎，过60目筛网，成为豆粉。称取50g豆粉放入聚乙烯袋中，加入250ml 0.9％生理盐水，封口机封口。施加超声波进行辅助提取，声强为1～40W/cm2。提取效果满意。
实施例10：芸豆植物凝集素制备的系列实验
取干燥的芸豆籽粒，自来水洗净3-5分钟，去杂物，然后低温烘干或晾晒干。机械粉碎，过60目筛网，成为豆粉。称取50g豆粉放入聚乙烯袋中，加入250ml 0.9％生理盐水，封口机封口。施加微波进行辅助提取，微波强度为5～20W/L。提取效果满意。
以上实施例仅为了对本发明作进一步说明，而本发明的范围不受所举实施例的局限。
检测例1：植物凝集素的电泳测定
采用常规的SDS-Page电泳测定提取物的分子量和提纯情况。经本法制备的植物凝集素采用Mini电泳槽，120-130V，50分钟电泳后得到的电泳照片如说明书附图所示。
结果表明来自芸豆，刀豆，扁豆，红豆和红花豆等样品在32K处都有一个明显的符合PHA分子量的条带。
检测例2：植物凝集素的糖蛋白性质测定
植物凝集素是一种含糖基的蛋白，它可以和碱性磷酸酶反应生产红色物，利用这一特点，把同样条件下得到的电泳条带进行常规的碱性磷酸酶染色，就可在32K处显示红色条带。这进一步证明该条带就是芸豆的PHA。
检测例3：植物凝集检测素活性的测定
蛋白质含量采用凯氏定氮或双波长考马斯亮蓝法测定。
用上述实施例制备的植物凝集素经过常规方法测定浓度后，稀释成1mg/ml的浓度。
将浓缩的植物凝集素提取液或干粉用pH＝6.8-7.0的磷酸缓冲液配制成1mg/ml的浓度。采用96孔培养板，取100μl上述磷酸缓冲液分别加入1～8孔中，然后取100μl浓度为1mg/ml的植物凝集素提取物加入96孔板的第一孔，充分混匀(吹吸5次)，然后吸取100μl加入第二孔，充分混匀，再取100μl加入第三孔，充分混匀，依次加入到第八孔。得到倍比稀释的PHA磷酸缓冲液。然后从1-8孔顺序各取50μl加入9孔血凝板中，留最后一孔为对照。取混匀的2％新鲜或醛化的兔或人的红细胞50μl分别加入1-9孔血凝板，再取50μl磷酸缓冲液加入血凝板的第9孔为对照组。室温25℃放置1小时，肉眼或显微镜观察凝血情况。一般情况下，以此技术提取的凝集素的效价在7.8-15.6μg/ml之间，即1/64-1/128。换算成国内常用的活性为1/512-1/1024。
检测例4：植物凝集素的冻干粉和溶液冷冻保存后的活力变化
(1)采用甘露醇和乳糖按1∶5混合作为赋型剂，按体积重量比为20％，即w/v＝20％加入甘露醇和乳糖赋型剂，常规冷冻干燥。得到白色疏松的粉末。加水后易溶解。4-10℃冰箱保存。半年后测定活性维持不变。
(2)过滤后的透明PHA水溶液用10ml西林瓶封装。-20℃冷冻保存20-30天，然后取出，室温存放。结果溶液保持透明。半年后测定，活性下降一个等级。即原来为1/512的活性下降为1/256。
Claims (4)
1.一种豆类植物凝集素的提取方法，其特征是在40～60℃温度下提取，依次按以下步骤进行：(1)豆类种子粉碎到40～100目，(2)加入浸泡液在40～60℃温度下提取60～180分钟并打捞豆皮，(3)粗分去除豆渣，(4)离心分离得含植物凝集素的上清液，(5)对上清液进一步进行分离纯化，(6)浓缩或干燥得植物凝集素；所说浸泡液为0.8％～1.2％的氯化钠水溶液或pH＝6.5～7.2的磷酸缓冲液PBS，浸泡液料水比例为1∶4～1∶10；提取的过程中加以搅拌，搅拌的转数为60～500转/分。
2.如权利要求1所说的提取方法，其特征是于所说在40～60℃温度下提取的全过程或部分过程中施加超声波进行辅助提取，声强为1～40W/cm2；或者施加微波进行辅助提取，微波强度为5～20W/L；或者交替施加超声波和微波进行辅助提取，超声声强为1～40W/cm2，微波强度为5～20W/L。
3.如权利要求1所说的提取方法，其特征是所说进一步进行分离纯化的步骤是：将上清液用50％饱和度NH4SO4搅拌沉淀，离心，沉淀物进行透析处理，沉淀物进行透析处理的步骤是：沉淀物加入到透析袋中，扎紧透析袋两端，把透析袋放入100-300目的尼龙袋中，再放入盛有蒸馏水或去离子水的带搅拌的容器中，以60～120转/分进行搅拌，水温为18～60℃，参数是：透析袋体积/蒸馏水或去离子水体积＝1∶7～1∶20，透析时间为1.0～3.0小时，透析袋的截留孔径为8000～10000道尔顿。
4.如权利要求1所说的提取方法，其特征是提取所用容器为不锈钢板制成，容器设有加热和控温装置，在容器壁上设微波加热头，在容器底部设超声波输出头，容器设有搅拌装置。
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