CN110283242A - 一种提取植物凝集素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提取植物凝集素的方法，属于植物凝集素提取技术领域。本发明中通过缓冲液浸泡、酸调沉淀蛋白和加0.1‑0.4%的氯化钠溶液沉淀蛋白三个步骤就能够将植物凝集素从豆子中提取出来，提取方法简单、方便；而且提取过程中使用的试剂便宜、易得，对人体无危害。并且，提取的PHA蛋白纯度高、活性好，将提取出的PHA蛋白应用于淋巴细胞培养基中，无凝血和溶血现象，刺激淋巴细胞生长效果良好。本发明中的提取方法适合于大规模的生产PHA蛋白。

Description

一种提取植物凝集素的方法

技术领域

本发明涉及一种提取植物凝集素的方法，属于植物凝集素提取技术领域。

背景技术

植物凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质。PHA又分为E型和L型，其中PHA-E型具有红细胞凝集作用；PHA-L型能够刺激淋巴细胞转化，是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，即在PHA-L作用下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。

目前，已经公开了多种从豆科植物中提取植物凝集素的方法。如公开号为CN101508730 A的中国发明专利申请中公开了一种豆类植物凝集素的提取方法，具体是：使用40-60℃水提法，并辅助超声和微波的交替施加的方法来提取植物凝集。公开号为CN101340923 A的中国发明专利申请中公开了用乙醇沉淀的菜豆提取物，其应用及制剂，其中涉及使用乙醇沉淀的方法来制备植物凝集素(PHA)和α-淀粉酶抑制剂。在这些方法中，使用乙醇梯度沉淀或是硫酸铵梯度沉淀的方法都会导致制备出来的PHA含有大量杂蛋白，在后续应用到淋巴细胞培养中会出现严重的沉淀或是凝血现象。

而且现有技术中存在的其他提取方法，如分子排阻色谱方法、离子色谱法等也不能得到高纯度的PHA，也会出现乙醇梯度沉淀或是硫酸铵梯度沉淀类似的后续问题。目前虽然也、有报道使用亲和层析方法(Con A-Sepharose等)是可以得到相对来说高纯度的PHA蛋白，但是这种制备方法成本太高，其中亲和填料的本身价格就很高，而且亲和填料如果使用或是清洗不好，会导致亲和填料的损坏，再有就是亲和填料纯化出来的PHA量有限，无法适合工业化生产需要的大量的PHA。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取植物凝集素的方法，其提取方法简便、成本低，并且提取的植物凝集素中含有的杂蛋白少。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种提取植物凝集素的方法，包括如下步骤：

1)取豆子浸提液离心后取上清液，用酸调整上清液的pH至4.5-5.0，得酸调混合液；

2)将步骤1)中的酸调混合液离心后取上清液，在上清液中加入质量浓度0.1-0.4％的氯化钠溶液，然后离心取上清液，即可。

优选的，所述豆子为菜豆；更为优选的，所述菜豆为红芸豆、白芸豆、红腰豆、猫眼豆或斑马豆。本发明中从豆子中提取的植物凝集素为PHA-L型蛋白，其分子量为30kD；等电点约为4.7。本发明通过上述的三次处理和离心取上清就能够将植物凝集素从豆子中提取出来，提取方法简单、方便；而且提取过程中使用的试剂便宜、易得，对人体无危害。本发明中的提取方法适合于大规模的生产PHA蛋白，可以制作成含PHA的活性溶液，也可以冻干制作含PHA的冻干粉。

本发明的提取植物凝集素的方法中：使用酸调节豆子浸提液上清液的pH至pH＝4.5-5.0，该步骤是通过等电点沉淀的方法调整溶液的pH值，沉淀大部分杂蛋白；在酸调混合液上清中液加入0.1-0.4％的氯化钠溶液，该步骤是通过不同蛋白的亲、疏水性不同，加入0.1-0.4％的氯化钠溶液再次沉淀大部分杂蛋白。共通过两步沉淀即可得到纯度高、活性好的PHA蛋白；纯化出的PHA蛋白应用于淋巴细胞培养基中，刺激淋巴细胞生长效果良好。

优选的，步骤1)中所述豆子浸提液的制备包括：取豆粉在缓冲液中浸泡1-3d。缓冲液具有缓冲作用，因此在酸调pH的过程中，pH变化较慢，不会因酸浓度过高影响PHA活性。进一步优选的，所述缓冲液为pH＝7.3-7.5的缓冲液。

更进一步优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液，浓度为9-11mM。本发明中使用的该种浓度和pH的PBS缓冲液能够将豆粉中的植物凝集素充分溶出；并且PBS缓冲液的缓冲能力较强，pH变化慢，在调节pH的过程中能够有足够的时间使杂蛋白沉淀。

优选的，所述豆粉与缓冲液质量/体积比为1g：5-20mL；更为优选的，所述豆粉与缓冲液质量/体积比为1g：8-12mL。浸泡缓冲液过少，则豆粉不能充分浸提；缓冲液过多，则浸提出的PHA浓度较低。

优选的，所述浸泡在2-10℃下进行。考虑到豆粉浸提过程中，浸泡时间可能较长，在冰箱冷藏条件下浸提，保障浸提液不会变质、腐坏或是滋生细菌。

优选的，步骤1)中所述酸为为盐酸、硫酸或磷酸，所述酸的浓度为0.9-1.1N(当量浓度)。本发明中的调节酸为稀酸，稀酸的浓度低，因此调节溶液中pH变化较慢，在调节pH的过程中不会因酸浓度过高影响PHA活性。盐酸、硫酸或磷酸为本领域经常使用的酸，都能够达到较好的效果。

优选的，将步骤1)中的酸调混合液离心后取上清液，在上清液中加入质量浓度0.15-0.25％的氯化钠溶液，然后离心取上清液，即可。

优选的，步骤2)中所述0.1-0.4％的氯化钠溶液的加入量为上清液体积的0.8-5倍；更为优选的，步骤2)中所述0.1-0.4％的氯化钠溶液的加入量为上清液体积的0.8-1.2倍。加入生理盐水能够使疏水蛋白大量沉淀，加入量越大沉淀越充分，优选方案主要考虑到后续PHA溶液浓度以及便于离心处理。该步骤的中加入了较多的0.1-0.4％的氯化钠溶液，原因是：酸调离心后的上清液中主要的杂蛋白为疏水蛋白，通过加入生理盐水能够使其大量沉淀，获得纯度更高的植物凝集素。

优选的，步骤1)和2)中所述离心的条件为9000-12000rpm，离心10-20min。该离心参数为最优参数，使用其他的能够实现固液分离的方法也能够达到相应的效果。

附图说明

图1为本发明对比例1中的PHA电泳纯度鉴定结果图；

图2为本发明实施例1中的新疆红芸豆提取PHA电泳纯度鉴定结果图；

图3为本发明实施例1-3中中的新疆红芸豆、云南白芸豆、山东红腰豆中提取PHA电泳纯度鉴定结果图；

图4为本发明实施例4-6中的吉林白芸豆、河南猫眼豆、江西斑马豆提取PHA电泳纯度鉴定结果图；

图5为本发明实施例1中提取的PHA与对比例1中的PHA对于外周血淋巴细胞的刺激效果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。以下实施例中豆子均为菜豆，红芸豆、白芸豆、红腰豆、猫眼豆或斑马豆分别采购于淘宝。

实施例1

本实施例中提取植物凝集素的方法，包括如下步骤：

1)将购买的豆子进行粉碎成细粉(新疆红芸豆)；

2)将豆粉浸泡于10mM pH7.4的PBS缓冲液中，其中豆粉与PBS缓冲液的质量/体积比为1:10(即1g豆粉加入10mL PBS缓冲液)，于5℃冰箱中浸泡2天，期间可每天拿出来进行混摇1-2次；

3)浸泡2天后，将浸提液进行离心，转速10000rpm，离心15min，得上清液I；

4)用1M的(即1N，当量浓度)稀盐酸，将上清液I的pH值调到4.8，此时会出现大量白色沉淀；

5)离心：转速10000rpm，离心15min；得上清液II；

6)向上清液II中加入1倍体积的质量浓度为0.2％的氯化钠溶液，再次出现大量沉淀；

7)离心：转速10000rpm，离心15min，得上清液III，即为含PHA的溶液，该步骤离心得到的沉淀记为沉淀III。

上述方法中得到的含PHA的溶液可以进行冻干，得到PHA干粉，在使用时稀释至相应的浓度使用。

实施例2

本实施例中提取植物凝集素的方法，所使用的豆子为云南白芸豆。

包括如下步骤：

1)将购买的豆子进行粉碎成细粉；

2)将豆粉浸泡于10mM pH7.4的PBS缓冲液中，其中豆粉与PBS缓冲液的质量/体积比为1:10(即1g豆粉加入10mL PBS缓冲液)，于6℃冰箱中浸泡2天，期间可每天拿出来进行混摇1-2次；

3)浸泡2天后，将浸提液进行离心，转速10000rpm，离心15min，得上清液I；

4)用1M的(即1N，当量浓度)稀盐酸，将上清液I的pH值调到4.8，此时会出现大量白色沉淀；

5)离心：转速10000rpm，离心15min；得上清液II；

6)向上清液II中加入1倍体积的质量浓度为0.2％的氯化钠溶液，再次出现大量沉淀；

7)离心：转速10000rpm，离心15min，得上清液III，即为含PHA的溶液，该步骤离心得到的沉淀记为沉淀III。

上述方法中得到的含PHA的溶液可以进行冻干，得到PHA干粉，在使用时稀释至相应的浓度使用。

实施例3

本实施例中提取植物凝集素的方法，所使用的豆子为山东红腰豆。

包括如下步骤：

1)将购买的豆子进行粉碎成细粉；

2)将豆粉浸泡于10mM pH7.4的PBS缓冲液中，其中豆粉与PBS缓冲液的质量/体积比为1:10(即1g豆粉加入10mL PBS缓冲液)，于5℃冰箱中浸泡2天，期间可每天拿出来进行混摇1-2次；

3)浸泡2天后，将浸提液进行离心，转速10000rpm，离心15min，得上清液I；

4)用1M的(即1N，当量浓度)稀盐酸，将上清液I的pH值调到4.8，此时会出现大量白色沉淀；

5)离心：转速10000rpm，离心15min；得上清液II；

6)向上清液II中加入1倍体积的质量浓度为0.2％的氯化钠溶液，再次出现大量沉淀；

7)离心：转速10000rpm，离心15min，得上清液III，即为含PHA的溶液，该步骤离心得到的沉淀记为沉淀III。

上述方法中得到的含PHA的溶液可以进行冻干，得到PHA干粉，在使用时稀释至相应的浓度使用。

实施例4

本实施例中提取植物凝集素的方法，所使用的豆子为吉林白芸豆。

包括如下步骤：

1)将购买的豆子进行粉碎成细粉；

2)将豆粉浸泡于10mM pH7.4的PBS缓冲液中，其中豆粉与PBS缓冲液的质量/体积比为1:10(即1g豆粉加入10mL PBS缓冲液)，于4℃冰箱中浸泡2天，期间可每天拿出来进行混摇1-2次；

3)浸泡2天后，将浸提液进行离心，转速10000rpm，离心15min，得上清液I；

4)用1M的(即1N，当量浓度)稀盐酸，将上清液I的pH值调到4.8，此时会出现大量白色沉淀；

5)离心：转速10000rpm，离心15min；得上清液II；

6)向上清液II中加入1倍体积的质量浓度为0.2％的氯化钠溶液，再次出现大量沉淀；

7)离心：转速10000rpm，离心15min，得上清液III，即为含PHA的溶液，该步骤离心得到的沉淀记为沉淀III。

上述方法中得到的含PHA的溶液可以进行冻干，得到PHA干粉，在使用时稀释至相应的浓度使用。

实施例5

本实施例中提取植物凝集素的方法，所使用的豆子为河南猫眼豆。

包括如下步骤：

1)将购买的河南猫眼豆进行粉碎成细粉；

2)将豆粉浸泡于10mM pH7.5的PBS缓冲液中，其中豆粉与PBS缓冲液的质量/体积比为1:10(即1g豆粉加入10mL PBS缓冲液)，于2℃冰箱中浸泡3天，期间可每天拿出来进行混摇1-2次；

3)浸泡3天后，将浸提液进行离心，转速9000rpm，离心20min，得上清液I；

4)用0.45M的(即0.9N，当量浓度)稀硫酸，将上清液I的pH值调到4.5，此时会出现大量白色沉淀；

5)离心：转速9000rpm，离心20min；得上清液II；

6)向上清液II中加入1倍体积的水，再次出现大量沉淀；

7)离心：转速9000rpm，离心20min，得上清液III，即为PHA溶液(植物凝集素)，该步骤离心得到的沉淀记为沉淀III。

上述方法中得到的含PHA的溶液可以进行冻干，得到PHA干粉，在使用时稀释至相应的浓度使用。

实施例6

本实施例中提取植物凝集素的方法，所使用的豆子为江西斑马豆。

包括如下步骤：

1)将购买的江西斑马豆进行粉碎成细粉；

2)将豆粉浸泡于10mM pH7.3的PBS缓冲液中，其中豆粉与PBS缓冲液的质量/体积比为1:10(即1g豆粉加入10mL PBS缓冲液)，于6℃冰箱中浸泡1天，期间可每天拿出来进行混摇1-2次；

3)浸泡1天后，将浸提液进行离心，转速10000rpm，离心10min，得上清液I；

4)用0.37M的(即1.1N，当量浓度)稀磷酸，将上清液I的pH值调到5.0，此时会出现大量白色沉淀；

5)离心：转速10000rpm，离心10min；得上清液II；

6)向上清液II中加入1倍体积的质量浓度为0.2％的氯化钠溶液，再次出现大量沉淀；

7)离心：转速10000rpm，离心10min，得上清液III，即为PHA溶液(植物凝集素)，该步骤离心得到的沉淀记为沉淀III。

上述方法中得到的含PHA的溶液可以进行冻干，得到PHA干粉，在使用时稀释至相应的浓度使用。

对比例1

本对比例中使用的PHA为新国卫PHA冻干粉，该产品在用纯化水溶解后于4℃冰箱保存。在保存过程中出现沉淀，12000rpm离心10min后取其上清，进行电泳纯度鉴定。

具体是：聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为5％，分离胶12％；恒电压，初始为90V，待样品进入分离胶后为150V；考马斯亮蓝染色30min；冰醋酸乙醇脱色液。(电泳所需要试剂均采购于阿拉丁试剂盒)

鉴定结果如图1所示，其中泳道1为Maker；泳道2为新国卫PHA冻干粉，用纯化水溶解，电泳上样量为10μL；泳道3为新国卫PHA冻干粉，用纯化水溶解，电泳上样量为20μL；箭头指示为PHA蛋白条带。从图中可以看出该产品中杂蛋白较多。

试验例1

将实施例1中得到的新疆红芸豆PHA进行电泳纯度鉴定。具体是：聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为5％，分离胶12％；恒电压，初始为90V，待样品进入分离胶后为150V；考马斯亮蓝染色30min；冰醋酸乙醇脱色液。(电泳所需要试剂均采购于阿拉丁试剂盒)

试验结果如图2所示，其中泳道1为Maker，泳道2为豆粉浸提2天后离心得到的上清液I；泳道3为将上清液I调至pH4.8沉淀杂蛋白，离心后的上清液II；泳道4为将上清液II加生理盐水沉淀杂蛋白，离心后的上清液III；箭头指示为PHA蛋白条带。从图中可以看出采用本发明的方法能够得到纯度高的PHA，其中杂蛋白含量很少。

将实施例1-3中的得到的PHA进行电泳纯度鉴定，方法同上。结果如图3所示，其中泳道1为Maker；泳道2为新疆红芸豆上清液II；泳道3为新疆红芸豆沉淀III；泳道4为新疆红芸豆上清液III；泳道5为云南白芸豆上清液II；泳道6为云南白芸豆沉淀III；泳道7为云南白芸豆上清液III；泳道8为山东红腰豆上清液II；泳道9为山东红腰豆沉淀III；泳道10为山东红腰豆上清液III；箭头指示为PHA蛋白条带。从电泳图中可以看出PBS缓冲液能从豆粉中浸提出大量各种蛋白，即粗提液I，粗提液I经过调整溶液的pH值为4.8左右后，能沉淀一部分杂蛋白，离心后得到上清液II；再将向上清液II中，加入等体积一定浓度的盐水后，再次沉淀，除PHA之外的大部分杂蛋白全部沉淀出去，得到上清液III，即为最终的PHA蛋白，其纯度很高，且制备方法简单、经济、有效。

将实施例4-6中的得到的PHA进行电泳纯度鉴定，方法同上。结果如图4所示，其中泳道1为Maker；泳道2为吉林白芸豆上清液I；泳道3为吉林白芸豆上清液II；泳道4为吉林白芸豆上清液III；泳道5为河南猫眼豆上清液I；泳道6为河南猫眼豆上清液II；泳道7为河南猫眼豆上清液III；泳道8为江西斑马豆上清液I；泳道9为江西斑马豆上清液II；泳道10为江西斑马豆上清液III；箭头指示为PHA蛋白条带。从电泳图中可以看出PBS缓冲液能从豆粉中浸提出大量各种蛋白，即粗提液I，粗提液I经过调整溶液的pH值为4.8左右后，能沉淀一部分杂蛋白，离心后得到上清液II；再将向上清液II中，加入等体积一定浓度的盐水后，再次沉淀，除PHA之外的大部分杂蛋白全部沉淀出去，得到上清液III，即为最终的PHA蛋白，其纯度很高，且制备方法简单、经济、有效。

试验例2

测定实施例1-6中所得到的上清液III蛋白总量，计算PHA纯化效率。溶液中蛋白浓度的测定方法使用紫外分光光度法，测定280nm处吸光值，所用仪器为凌析LAB的BD-500超微量分光度计。结果如表1所示，从表中可以看出本发明中的方法所得到的PHA纯化效率高。

表1各实施例的PHA纯化效率

试验例3

采购的新安国安剖瓶装PHA用纯化水溶解后，放置冰箱冷藏层中，次日出现浑浊，离心：转速12000rpm，时间10min，得上清和沉淀；取离心后上清(PHA溶液)作为对比例1，和实施例1中得到的PHA同时进行活性检测。

具体的包括：

1)按表2的配方配制成外周血淋巴细胞培养基；培养基中实施例1中PHA的使用浓度为每支培养基中加入200μL PHA液体，PHA终浓度为0.2mg/mL。培养基中对比例1的PHA的使用浓度为每支培养基中加入100μL的PHA液体，PHA终浓度为0.25mg/mL。每支培养基体积为5mL。青霉素钾货号P102194；硫酸链霉素货号S105491。

表2

2)培养、收集淋巴细胞培养基细胞收集

a、种血：血样来自于赛诺特医学检测所，每支培养基种血400μL；

b、培养：将种过血的培养基放入37℃恒温箱中培养3天；

c、制片：加秋水仙素-离心-低渗-固定(甲醇/冰醋酸固定液)-滴片；秋水仙素浓度为20μg/mL，用量为50μL；离心转速为2000rpm，时间为10min；低渗液浓度为0.075mol/L的氯化钾，用量为6mL；固定液为甲醇和冰醋酸的混合液，其体积比为3:1。

d、Giemsa染色液进行染色；

e、显微镜下观察。

观察结果如图5所示：其中A为对比例1的PHA培养0h观察图；B为对比例1的PHA培养3d观察图；C为实施例1的PHA培养0h观察图；D为实施例1的PHA培养3d观察图。

判断标准：淋巴母细胞越多，分裂相越多，则证明PHA刺激淋巴细胞生长效果越好。在显微镜下观察到使用本发明实施例1中的PHA培养3d后的淋巴细胞生长状态良好，经过滴渗和固定后淋巴细胞转化为淋巴母细胞(细胞大)，此外淋巴母细胞可破碎，释放出染色体。

使用本发明的方法提取的PHA，按照刺激淋巴细胞生长效果看，本发明0.2mg/mLPHA的活性要较购买的PHA 0.25mg/mL活性要好，通过将PHA加入到人外周血淋巴细胞培养中，种血、收集细胞，并在镜下观察到，使用该工艺制备的PHA其刺激淋巴细胞生长效果更好，细胞收获得量更多、细胞生长状态更好。该工艺可实现方便、实用的方法从豆子中提取高收率的PHA活性蛋白。更好的结果是该工艺提取的PHA配制成淋巴细胞培养基，无凝血和溶血现象发生。

Claims (9)

1.一种提取植物凝集素的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）取豆子浸提液离心后取上清液，用酸调整上清液的pH至4.5-5.0，得酸调混合液；

2）将步骤1）中的酸调混合液离心后取上清液，在上清液中加入质量浓度为0.1-0.4%的氯化钠溶液，然后离心取上清液，即可。

2.根据权利要求1所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：步骤1）中所述豆子浸提液的制备包括：取豆粉在缓冲液中浸泡1-3d，即得。

3.根据权利要求2所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH=7.3-7.5的缓冲液。

4.根据权利要求3所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：所述缓冲液为PBS缓冲液，浓度为9-11mM。

5.根据权利要求2所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：所述豆粉与缓冲液质量/体积比为1g：5-20mL。

6.根据权利要求2所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：所述浸泡在2-10℃下进行。

7.根据权利要求1所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：步骤1）中所述酸为盐酸、硫酸或磷酸，所述酸的浓度为0.9-1.1N。

8.根据权利要求1所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：步骤2）中所述0.1-0.4%的氯化钠溶液的加入量为上清液体积的0.8-5倍。

9.根据权利要求1所述的提取植物凝集素的方法，其特征在于：步骤1）和2）中所述离心的条件为9000-12000rpm，离心10-20min。