CN105837704A - 一种苜蓿多糖的提取和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取和纯化苜蓿多糖的方法。该方法包括：1)将苜蓿粉末用水浸提两次，合并两次所得的滤液，浓缩后醇析，收集析出物后离心或过筛，收集沉淀，再加水溶解所述沉淀，得到粗苜蓿多糖溶液；2)将步骤1)所得粗苜蓿多糖溶液依次进行透析和脱蛋白处理，将脱蛋白所得体系沉淀后离心或过筛，收集上清液，醇析后，收集沉淀，干燥，得到所述苜蓿多糖。本发明对苜蓿多糖传统的水煮醇提方法加以改进，增加透析过程，并通过α‑萘酚实验，斐林实验，茚三酮实验，三氯化铁实验和蒽酮‑硫酸比色法对样品进行定性和定量检测，结果发现改进方法的提取率高达89.87％。

Description

一种苜蓿多糖的提取和纯化方法

技术领域

本发明属于农业领域，涉及一种苜蓿多糖的提取和纯化方法。

背景技术

据2013年6月份出版的中国畜禽养殖中抗生素使用情况调查报告显示，养殖业是当前抗生素使用量最大的领域。国内抗生素总产量为21万吨，国内消费量约18万吨，其中，用于畜牧及其饲料行业的抗生素高达9.7万吨，约占54％。抗生素的大量使用造成动物耐药性增强，畜禽机体抗病力减弱；抗生素的长期使用更使得机体肠道菌群失调，破坏微生态环境；同时畜产品中药物的残留成为突出问题。1986年，瑞典成为第一个全面禁止使用抗生素的国家，1999年开始，欧盟禁止在饲料中添加部分抗生素，2006年开始欧盟全面禁止抗生素的使用。因此寻求抗生素替代物是当前畜牧业迫切需要解决的问题。

近年来，植物多糖的药用保健功能逐渐引起人们的关注。植物多糖具有自身特有的优点：其来源广泛、种类繁多；生物学功能突出；无毒副作；无残留；无抗药性。同时植物多糖所具有的多种生物学功能，已被广泛应用于畜禽生产，并被证明有着显著的改善胴体品质，促生长的作用；提高抗原免疫应答，激活免疫细胞的作用；以及广泛的抗病毒和抗应激作用。植物性多糖作为植物源性添加剂，替代抗生素，更是开发无抗日粮的备选项，对将来畜产品的安全生产提供了安全优质保障。

水溶性多糖是多糖中活性较大的组分，人们对它的研究最多。一般水溶性多糖易溶于热水，冷却后成粘稠沉淀析出。通常用水提取乙醇沉淀的方法得到粗多糖。杨丽娥等(2002)采用水提取乙醇沉淀的方法对苜蓿多糖提取、纯化条件进行优化研究，初步确立了较为合理的提取工艺。其研究结果显示，提取苜蓿多糖的最佳条件为100℃水浴浸提2h，固液比为1:20，醇析浓度为80％，粗多糖脱蛋白时，V氯仿与V正丁醇之比为4:1，经脱蛋白处理后多糖浸出率可达7.84％。张东杰等也对苜蓿多糖提取过程中各环节的最佳条件进行了一定的探讨，其试验结果与杨丽娥得到的最佳条件存在着一定的差异，温度100℃提取时间为1h，浸提时固液比为1:40，醇析浓度为95％，粗多糖脱蛋白时，v氯仿与v正丁醇之比为5:1，多糖浸出率可达6.8％。

苜蓿堪称“牧草之王”，是世界上栽培面积最广泛、最重要的豆科牧草之一。我国种植面积为183万hm²，居世界第5位，以其草质优良、营养丰富在畜牧业上发挥着重要的作用。同时，据中药记载，苜蓿具有清热解毒、凉血通淋之功效，能降血脂、利尿、抑菌、抗肿瘤。长期服用利五脏、轻身健人。基于多糖的药用保健功能，推测苜蓿多糖可能是其发挥功能的活性成分之一。

大量试验证明，苜蓿具有免疫调节，降血糖、降血脂、抗炎、抗疲劳、抗衰老等功效。中国农业科学院畜牧兽医研究所自1996年开始，针对紫花苜蓿中有利于动物健康的有效活性成分进行了深入研究，成功研发出苜草素(主要活性成分——苜蓿多糖、黄酮、皂苷)。

水溶性苜蓿多糖是从紫花苜蓿中提取的植物多糖。研究表明，水溶性苜蓿多糖具有体外协同PHA、ConA、LPS、PWM诱导淋巴细胞增殖的作用。水溶性苜蓿多糖是多糖中活性较大的组分，人们对它的研究也最多。水溶性多糖分子量一般在2～6万道尔顿，易溶于热水，冷却后成粘稠沉淀析出，。通常用水煮醇提的方法得到粗多糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种苜蓿多糖的提取和纯化方法。

本发明提供的提取和纯化苜蓿多糖的方法，包括如下步骤：

1)将苜蓿碎段用水浸提两次，合并两次所得的滤液，浓缩后醇析，收集析出物后离心或过筛，收集沉淀，再加水溶解所述沉淀，得到粗苜蓿多糖溶液；

2)将步骤1)所得粗苜蓿多糖溶液依次进行透析和脱蛋白处理，将脱蛋白所得体系沉淀后离心或过筛，收集上清液，醇析后，收集沉淀，干燥，得到所述苜蓿多糖。

上述方法的流程如图1所示。所述步骤1)中，所述苜蓿碎段的长度为2-3cm；

所述用水浸提步骤中，苜蓿碎段与水的用量比为1g：10-20g；

所述用水浸提包括如下步骤：将所述苜蓿碎段与水混合后煮沸，过滤，收集所得滤液，记为滤液I；再向所得滤渣中加水，煮沸，收集所得滤液，记为滤液II；最后合并所述滤液I和滤液II；

所述煮沸步骤中，时间均为0.5h-1h；

所述加水步骤中，水的用量为由滤液I和滤渣组成的体系的体积的1倍；

所述步骤1)浓缩步骤中，浓缩的程度为将所述滤液浓缩至原体积的1/4至1/10；

所述醇析步骤中，所用醇析剂为乙醇，具体为无水乙醇或乙醇的质量百分含量为95％的工业乙醇；

所述醇析剂的用量为浓缩后所得体系体积的4倍；

醇析的时间为12h；

所述离心步骤中，转速为4000rpm；时间为10min；

所述过筛步骤中，筛孔的目数为200目。

所述步骤2)透析步骤中，透析液为水，具体为去离子水；

透析的温度为4℃；

透析袋的截留分子量为8000-14000D；

所述透析具体包括如下步骤：将透析袋一段用透析夹夹住，加入70％透析袋体积的所述步骤1)所得粗苜蓿多糖溶液，然后用夹子夹住另一端，用去离子水透析，在第3h、第9h和第18h更换去离子水透析，第30h时收集透析袋中溶液，备用。

所述方法还包括如下步骤：在所述步骤1)之后，所述步骤2)透析之前，先对透析所用透析袋进行如下预处理：

以对6个透析袋总共装填300mL的透析液为例：将碳酸氢钠的水溶液和浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的水溶液加去离子水至300mL，调节体系的pH为8，将透析袋置于其中，煮沸15min，再用去离子水冲洗3遍后，将处理后的透析袋置于浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的水溶液中煮沸15min后用纯净水冲洗3遍；

所述加去离子水步骤中所述碳酸氢钠的水溶液中，碳酸氢钠与水的用量比为0.02g：1mL；所述碳酸氢钠的用量为6g；所述乙二胺四乙酸的用量为0.0877g。

所述步骤2)脱蛋白步骤中，脱蛋白剂为质量百分浓度为≥95％的三氯甲烷的水溶液；

所述脱蛋白的时间为上清液由深褐色变为浅黄色或大量出现土黄色絮状沉淀；

所述沉淀步骤中，温度为5-10℃；时间为12h；

所述离心步骤中，转速为4000rpm；时间为10min；

所述过筛步骤中，筛孔的目数为200目；

所述醇析步骤中，所用醇析剂为乙醇，具体为无水乙醇或乙醇的质量百分含量的≥99.7％工业乙醇，具体为乙醇的质量百分含量为95％的工业乙醇；

所述醇析剂的用量为浓缩后所得体系体积的4倍；

醇析的时间为12h；

所述干燥步骤中，干燥的方式为冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥。

所述苜蓿可为现蕾期苜蓿，具体可为现蕾期紫花苜蓿。

所述方法还包括如下步骤：在所述步骤1)浸提步骤之前，将所述苜蓿粉末烘干；

所述烘干步骤中，温度为100-105℃。

本发明对苜蓿多糖传统的水煮醇提方法加以改进，增加透析过程，并通过α-萘酚实验，斐林实验，茚三酮实验，三氯化铁实验和蒽酮-硫酸比色法对样品进行定性和定量检测，结果发现改进方法的提取率高达89.87％。

附图说明

图1为本发明提供的提取纯化苜蓿多糖的工艺流程图。

图2为标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、

材料方法：

试验材料

现蕾期紫花苜蓿，透析袋(截留分子量8000-14000D)，透析夹

试验试剂

蒸馏水，无水乙醇(分析纯级)，碳酸氢钠(分析纯)，EDTA，三氯甲烷，正丁醇

葡萄糖标准品，蒽酮，浓硫酸(98％)

试验仪器

镰刀、电子天平、剪刀、烘箱、粉碎机、不锈钢锅、高压锅、大烧杯、玻璃棒、尼龙布、旋转浓缩机、离心管、试管架、高速离心机、镊子、量筒、勺子、胶头滴管、托盘天平、真空冷冻干燥机、锡纸、橡皮筋、透析袋(截留分子量：8000-14000)、721/722型双光束扫描紫外分光光度计、电子天平；

实验设计

试验首次对现蕾期收割的紫花苜蓿进行切碎，然后进行水煮醇析，得到粗多糖溶液后进行透析除去单糖、无机盐等小分子物质，然后使用sevag试剂进行脱蛋白，乙醇沉淀，并冷冻干燥得到固体多糖，并对得到的多糖进行定性与定量的检测。

1苜蓿干草料的制备

现蕾期刈割，剪为2-3cm碎段，称重，在100-105℃温度下烘干(生产上直接用干草料)。

2水溶提取多糖

按料水1：20(生产上1:10)的比例混合均匀，煮沸1h，过滤，在滤渣中加水至原体积(生产上加水至原体积的3/5)，煮沸1小时(生产上水煮0.5小时)，弃去滤渣，合并两次的滤液。

在旋转浓缩蒸发仪上将滤液浓缩至原体积的1/4(生产上可用真空浓缩罐浓缩至1/10)，在溶液中加入4倍体积的无水乙醇(生产上加入4倍体积的95％工业乙醇)进行醇析(醇析苜蓿多糖原理：苜蓿多糖能溶于水而不溶于乙醇，由于乙醇能与任意比例水互溶，因此当向多糖溶液加入大量乙醇时，由于乙醇都溶于水中了而使多糖从水-乙醇溶液中大量析出，析出物可从水-乙醇溶液中分离出来，叫醇析法)，静置12h，用离心机以4000rpm的速度离心10min(生产上用200目筛过滤弃上清液)，弃去上清液，得固体物质，为粗多糖，加水使沉淀物溶解，这样就得到粗多糖溶液。

2.4.3透析

透析袋前处理(以对6个透析袋总共装填300mL的透析液为例)：将碳酸氢钠的水溶液和浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的水溶液加去离子水至300mL，调节体系的pH为8，将透析袋置于其中，煮沸15min，再用去离子水冲洗3遍后，将处理后的透析袋置于浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的水溶液中煮沸15min后用纯净水冲洗3遍；其中，加去离子水步骤中所述碳酸氢钠的水溶液中，碳酸氢钠与水的用量比为0.02g：1mL；碳酸氢钠的用量为6g；乙二胺四乙酸的用量为0.0877g。

透析：将透析袋一段用透析夹夹住，加入70％透析袋体积的粗多糖溶液，然后用夹子夹住另一端。在4℃环境中，用去离子水透析，在第3h，第9h，第18h更换去离子水透析，第30h时收集透析袋中溶液进行下一步处理。

2.4.4脱蛋白

加一定量质量百分浓度为≥95％分析纯的三氯甲烷的水溶液(两次)(上清液由深褐色变为浅黄色停止)(生产上出现大量土黄色絮状沉淀)在5～10℃过夜沉淀12h，4000rpm离心10min，取上清液(生产上用200目筛过滤，取上清液)。上清液再次进行醇析(生产上用95％的乙醇两次醇沉，分别为12h，6h)，弃去上清液，干燥沉淀物(冷冻、喷雾、减压干燥)，得到苜蓿多糖。

2.5多糖的定性检测

多糖提取后首先对多糖进行定性检测，常用的检测方法有α-萘酚实验，斐林实验，茚三酮实验，三氯化铁实验。

(1)α-萘酚实验:取检品的水溶液1mL，加5％α-萘酚试液数滴振荡后，沿管壁滴入5-6滴浓硫酸，使成两层，待2-3min后，观察液面分界处是否有紫红色环出现；

(2)斐林实验:取样品的水溶液1mL，加入稀盐酸5滴，置沸水浴10-15min，用10％氢氧化钠溶液中和至中性，再加新配的碱性酒石酸铜试液4滴；另取检液1mL，不加酸直接加入上述试液4滴，两管同时置水浴上煮沸5-6min；

(3)茚三酮实验:取样品的水溶液1mL，加入茚三酮试液2-3滴，加热煮沸4-5min，待其冷却；

(4)三氯化铁实验:取样品的水溶液1mL，加三氯化铁1-2滴；

2.6多糖含量测定

蒽酮—硫酸法检测多糖纯度。

葡萄糖标准曲线：准确吸取1mg/mL的葡萄糖标准液0、1、2、3、4、5mL置于50mL容量瓶中，定容至刻度。再准确吸取上述标准溶液各1mL置于具塞试管中，冰水浴中加入蒽酮硫酸试剂(取蒽酮0.2g置于100mL容量瓶中加浓硫酸溶解定容，现用现配)4mL，摇匀，放置5min后，置于沸水浴中加热10min，自来水冷却，冷却至室温。以蒸馏水代替标准糖液，按上述步骤处理作为空白对照，于620nm处测定吸光度值，得出标准曲线方程。

称取苜蓿多糖10mg蒸馏水溶解(具体称量质量与所测样品的多糖含量有关)，使吸光度值在0.2～0.7之间稳定符合比尔定律A＝1g(1/T)＝Kbc，确定最终称量重量，但均需精确至0.0001g，于50mL容量瓶中定容，准确吸取1mL按照标准曲线的制作方法测定吸光度值，根据葡萄糖的标准曲线方程计算苜蓿多糖的含量。图2为所得标准曲线。

3结果与讨论

对苜蓿多糖进行定性检测时，α-萘酚实验中有紫红色环出现，斐林实验中水解后生成棕红色沉淀物的量比未经水解的多，表示溶液中含有苜蓿多糖；

茚三酮实验中没有颜色反应，表明不含有蛋白质，肽类及氨基；三氯化铁实验中溶液呈现草绿色，表明不含有蹂质。

对蒽酮硫酸法检测苜蓿多糖的结果见表1。

表1、标准葡萄糖溶液吸光度

表2、蒽酮-硫酸法检测纯化后多糖纯度

由上可知，本发明通过水煮醇析得到粗多糖溶液后，改进纯化工艺流程，首先使用透析的方法除去小分子杂质，然后进行两次sevag脱蛋白及醇析，所得到的苜蓿多糖纯度为89.87％，比杨丽娥(2002)等人的试验纯度高19.07％。本试验通过改进以往多糖提取与纯化的方法，通过透析出去大量小分子物质，大幅度提高了纯化后多糖的纯度，为后续试验进行与对多糖的研究提供了参考。

Claims (8)

1.一种提取和纯化苜蓿多糖的方法，包括如下步骤：

1)将苜蓿碎段用水浸提两次，合并两次所得的滤液，浓缩后醇析，收集析出物后离心或过筛，收集沉淀，再加水溶解所述沉淀，得到粗苜蓿多糖溶液；

2)将步骤1)所得粗苜蓿多糖溶液依次进行透析和脱蛋白处理，将脱蛋白所得体系沉淀后离心或过筛，收集上清液，醇析后，收集沉淀，干燥，得到所述苜蓿多糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述苜蓿碎段的长度为2-3cm；

所述用水浸提步骤中，苜蓿碎段与水的用量比为1g：10-20g；

所述用水浸提包括如下步骤：将所述苜蓿碎段与水混合后煮沸，过滤，收集所得滤液，记为滤液I；再向所得滤渣中加水，煮沸，收集所得滤液，记为滤液II；最后合并所述滤液I和滤液II；

所述煮沸步骤中，时间均为0.5h-1h；

所述加水步骤中，水的用量为由滤液I和滤渣组成的体系的体积的1倍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步骤1)浓缩步骤中，浓缩的程度为将所述滤液浓缩至原体积的1/4至1/10；

所述醇析步骤中，所用醇析剂为乙醇，具体为无水乙醇或乙醇的质量百分含量为95％的工业乙醇；

所述醇析剂的用量为浓缩后所得体系体积的4倍；

醇析的时间为12h；

所述离心步骤中，转速为4000rpm；时间为10min；

所述过筛步骤中，筛孔的目数为200目。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)透析步骤中，透析液为水，具体为去离子水；

透析的温度为4℃；

透析袋的截留分子量为8000-14000D；

所述透析具体包括如下步骤：将透析袋一段用透析夹夹住，加入70％透析袋体积的所述步骤1)所得粗苜蓿多糖溶液，然后用夹子夹住另一端，用去离子水透析，在第3h、第9h和第18h更换去离子水透析，第30h时收集透析袋中溶液。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述步骤1)之后，所述步骤2)透析之前，先对透析所用透析袋进行如下预处理：

将碳酸氢钠的水溶液和浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的水溶液加去离子水至300mL，调节体系的pH为8，将透析袋置于其中，煮沸15min，再用去离子水冲洗3遍后，将处理后的透析袋置于浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸的水溶液中煮沸15min后用纯净水冲洗3遍；

所述加去离子水步骤中所述碳酸氢钠的水溶液中，碳酸氢钠与水的用量比为0.02g：1mL；所述碳酸氢钠的用量为6g；所述乙二胺四乙酸的用量为0.0877g。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)脱蛋白步骤中，脱蛋白剂为质量百分浓度为≥95％的三氯甲烷的水溶液；

所述脱蛋白的时间为上清液由深褐色变为浅黄色或大量出现土黄色絮状沉淀；

所述沉淀步骤中，温度为5-10℃；时间为12h；

所述离心步骤中，转速为4000rpm；时间为10min；

所述过筛步骤中，筛孔的目数为200目；

所述醇析步骤中，所用醇析剂为乙醇，具体为无水乙醇或乙醇的质量百分含量为≥99.7％的工业乙醇；

所述醇析剂的用量为浓缩后所得体系体积的4倍；

醇析的时间12h；

所述干燥步骤中，干燥的方式为冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述苜蓿为现蕾期苜蓿，具体为现蕾期紫花苜蓿。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述步骤1)浸提步骤之前，将所述苜蓿粉末烘干；

所述烘干步骤中，温度为100-105℃。