CN108522900A - 一种水产品抗应激饲料添加剂 - Google Patents

一种水产品抗应激饲料添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及饲料添加剂领域，公开了一种水产品抗应激饲料添加剂，该添加剂包含以下成分及重量份：金属硫蛋白提取液8‑35份，大豆磷脂5‑10份，蛋粉0.5‑3份，胆酸0.13‑0.18份。本发明将金属硫蛋白和蛋粉、大豆磷脂及胆汁酸复配作为水产动物的抗应激饲料添加剂，能够协同发挥抗应激作用，效果显著，同时，金属硫蛋白采用虾夷扇贝诱导提取，提取高效快速，适于水产品使用。

Description

一种水产品抗应激饲料添加剂
技术领域
本发明涉及饲料添加剂领域，尤其涉及一种水产品抗应激饲料添加剂。
背景技术
应激指在现代水产养殖过程中，鱼虾蟹等养殖对象面临应激因素的刺激影响，如水质污染、气候冷热突变、长途运输等等。这些不同程度的应激反应，不但能直接影响动物的正常生长发育，而且严重的可导致鱼虾蟹的机体免疫力卜降，诱发患病甚至死亡。随着水产养殖的发展，养殖对象面临的应激源也日趋增多。有害作用因子引起的动物一系列非特异性的生理防御反应的总和。在水产动物养殖中，水温变化(低温，高温)、运输、惊吓、水体污染、酸碱度变化。病原微生物侵袭、高密度饲养，分池、捕捉，饲料更换等活动都可能产生应激。
抗应激添加剂是指具有缓解、防治由应激源引起的应激综合症的饲料添加剂。目前，在畜禽生产中常用的抗应激添加剂包括维生素类、矿物质、糖类、有机酸类、植物提取物、微量元素或抗生素等。但金属硫蛋白还未用于水产抗应激添加剂，金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类广泛存在于生物中的低分子质量(6～7kD)、高金属含量、无芳香族氨基酸、富含半胱氨酸(20％～30％)的功能独特的金属结合蛋白。金属硫蛋白中大量巯基赋予了其螯合重金属离子功能及重金属解毒作用，同时MT清除自由基的能力明显强于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽，并调节生物体内微量元素浓度，对细胞代谢的调节，细胞分化和增殖的控制以及在参与紫外(UV)诱导反应中都有重要作用。
申请号为201410826339.7的中国专利公开了一种抗四氧化二氮应激的食品及制备方法，减少四氧化二氮吸入导致的肺组织损伤，抗应激效果好，但是该食品仅适于抗四氧化二氮应激，对于水体污染、病原微生物侵袭等作用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水产品抗应激饲料添加剂，将金属硫蛋白和蛋粉、大豆磷脂及胆汁酸复配，协同发挥抗应激作用，同时，金属硫蛋白采用虾夷扇贝诱导提取，提取高效快速，适于水产品使用。
本发明的具体技术方案为：该添加剂包含以下成分及重量份：金属硫蛋白提取液8-35份，大豆磷脂5-10份，蛋粉0.5-3份，胆酸0.13-0.18份。
重金属元素具有蓄积性，当重金属在水产品机体蓄积达到一定量后，会导致重金属中毒，产生应激反应，导致产量下降，而且人食用后，还会对人体心血管系统、神经系统和免疫系统等造成严重损害。金属硫蛋白中大量巯基赋予了其螯合重金属离子功能，并将之排出，进而解除重金属造成的损伤。金属硫蛋白还是最佳的抗氧化调节剂，MT可以通过结合或释放金属离子来调节自由基的水平，对由于金属离子调节机制稳态失衡对机体造成的氧化损伤起到一定预防和修复作用。MT还可大量吸收进入生物体内的半胱氨酸，为生物体内受损的二硫键修复提供原料，修复损伤细胞。
大豆磷脂是从生产大豆油的油脚中提取的产物，是由甘油、脂肪酸、胆碱或胆胺所组成的酯，不仅具有较强的乳化、润湿、分散作用，还在促进脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤等方面发挥很重要的作用。
蛋粉含有功能性卵黄抗体，卵黄抗体化学性质稳定、特异性强、绿色安全。针对水产生物，能提高肠道吸收功能，改善肠道屏蔽功能。针对添加剂本身，提高了其它营养成分吸收，减少有害物质进入肝脏。
胆酸在动物机体内能够乳化脂肪扩大与脂肪酶的接触面积；调控胰脂肪酶和脂蛋白酯酶的活性提高其对脂肪的水解代谢；在肠道内转运脂肪，促进脂肪的吸收。另外，胆酸通过调控激素敏感脂肪酶的活性，明显减少了自体脂肪的分解代谢，能够节约能量原料，提高能量利用率，改善生长性能。胆酸和大豆磷脂复配，组成与胆汁成分类似，能够协同发挥作用，帮助抗应激成分吸收，增强动物免疫力，从源头控制饲料等因素对养殖动物造成应激，同时主要保护水产品最重要的两个器官从肝胰脏和肠道的健康，增强水产品自身免疫力，提高了水产品抗应激的能力。
作为优选，所述金属硫蛋白提取液的提取方法包含以下步骤：
1)诱导：将鲜活虾夷扇贝Zn诱导5-7天；
2)提取：将诱导后的虾夷扇贝匀浆，匀浆组织中加入Tris-HCl缓冲液和TCEP后静置；
3)分离：离心后收集上清液，加热、离心、收集上清液，再加入乙醇后静置，收集沉淀物，加入Tris-HCl缓冲液溶解，再次离心分离得MT粗提液；
4)脱金属：MT粗提液加入盐酸溶液和LEDTA溶液于暗处脱去金属，得金属硫蛋白提取液。
金属硫蛋白作为一种应激蛋白，具有显著的可诱导性，可以采用物理或者化学方法对生物体进行诱导，产生MT，最常用的方法是重金属诱导，本发明采用Zn诱导，避免了Cd等有害重金属的残留。
使用性质稳定且与生理体液的相容性好的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷，简称Tris)缓冲溶液作为提取剂，提取效果好。TCEP作为还原剂能够防止MT氧化，并且残留的TCEP在后续作为添加剂的一部分仍然能够发挥还原剂的作用，延长保质期，提高抗应激效果。
MT本身具有一定的耐热性，可利用这一特性除去多数热不稳定蛋白质，进一步提高MT含量。上清液加热能够除掉热不稳定的大分子蛋白组分，提高提取率和稳定性。
作为优选，所述步骤1)中Zn诱导是采用氯化锌配置的暴露锌浓度为100mg/L的培养液培养虾夷扇贝。
作为优选，所述步骤2)中Tris-HCl缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值为8-9，匀浆组织与Tris-HCl缓冲液的的质量体积比为1∶3。
作为优选，所述步骤2)中TCEP浓度为1wt％。
作为优选，所述步骤2)中静置温度为4℃，静置时间为6-10h。
作为优选，所述步骤3)中加热温度为70℃，加热时间为5min，溶解温度为室温，溶解时间为3-4h。
作为优选，所述步骤3)中离心温度为4℃，离心时间为15-30min，转速为9000-12000r/min。
作为优选，所述步骤3)中乙醇温度为-20℃，乙醇与上清液的体积比为3∶1。
作为优选，所述步骤4)中盐酸溶液浓度为1.2mol/L，LEDTA浓度为0.1mol/L，盐酸溶液和LEDTA的体积比为1∶20，脱金属时间为8-12min。
不同浓度、pH值的提取液，以及动物组织与缓冲液的质量体积比、匀浆液离心转速大小，时间长短以及离心后上清液的加热处理不相同，对MT的提取率都会产生较大影响，而且没有明显规律。Tris-HCl缓冲液受温度影响大，一旦温度改变，pH将发生变化，而致酶活性改变，所以提取过程中尽量保持同一温度。本发明利用响应面法设计提取MT的实验方法，选取Tris-HCl提取液的浓度、提取液pH和加热温度为影响MT含量优化的因素得到提取效果较佳的提取条件。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明将金属硫蛋白和蛋粉、大豆磷脂及胆汁酸复配作为水产动物的抗应激饲料添加剂，能够协同发挥抗应激作用，效果显著，同时，金属硫蛋白采用虾夷扇贝诱导提取，提取高效快速，适于水产品使用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
金属硫蛋白提取液35份，大豆磷脂5份，蛋粉3份，胆酸0.13份。
金属硫蛋白提取液制备：将鲜活虾夷扇贝置于处理缸中，暴露Zn浓度为100mg/L(用氯化锌配置，以Zn+浓度计)，诱导时间为7天。将匀浆后组织加入3倍体积(质量/体积)Tris-HCl缓冲液(缓冲液需提前配置，Tris-HCl提取液浓度为0.01mol/L，提取液pH为8.23，放置4℃预冷)，同时加入1wt％TCEP作为还原剂，加入缓冲液后4℃过夜，然后10000r/min离心20min，收集上清液加热至70℃维持5min，除掉热不稳定的大分子蛋白组分，冰水浴快速冷却后4℃离心，收集上清液，加入3倍体积-20℃乙醇冰箱过夜沉淀，最后4℃条件下将沉淀物分离，弃去上清液后加入10mLTris-HCl缓冲液，室温下溶解3.5h，溶液4℃再次离心分离，收集到的上清液加入10μL 1.2mol/L盐酸溶液和200μL 0.1mol/LEDTA，置于暗处反应10min脱去金属，即为MT粗提液。
实施例2
金属硫蛋白提取液8份，大豆磷脂10份，蛋粉0.5份，胆酸0.18份。
金属硫蛋白提取液制备：将鲜活虾夷扇贝置于处理缸中，暴露Zn浓度为100mg/L(用氯化锌配置，以Zn+浓度计)，诱导时间为7天。将匀浆后组织加入3倍体积(质量/体积)Tris-HCl缓冲液(缓冲液需提前配置，Tris-HCl提取液浓度为0.01mol/L，提取液pH为8，放置4℃预冷)，同时加入1wt％TCEP作为还原剂，加入缓冲液后4℃过夜，然后12000r/min离心15min，收集上清液加热70℃，除掉热不稳定的大分子蛋白组分，冰水浴快速冷却后4℃离心，收集上清液，加入3倍体积-20℃乙醇冰箱过夜沉淀，最后4℃条件下将沉淀物分离，弃去上清液后加入10mLTris-HCl缓冲液，室温下溶解3h，溶液4℃再次离心分离，收集到的上清液加入10μL1.2mol/L盐酸溶液和200μ L0.1mol/LEDTA，置于暗处反应10min脱去金属，即为MT粗提液。
实施例3
金属硫蛋白提取液20份，大豆磷脂8份，蛋粉2份，胆酸0.15份。
金属硫蛋白提取液制备：将鲜活虾夷扇贝置于处理缸中，暴露Zn浓度为100mg/L(用氯化锌配置，以Zn+浓度计)，诱导时间为7天。将匀浆后组织加入3倍体积(质量/体积)Tris-HCl缓冲液(缓冲液需提前配置，Tris-HCl提取液浓度为0.01mol/L，提取液pH为9，放置4℃预冷)，同时加入1wt％TCEP作为还原剂，加入缓冲液后4℃过夜，然后9000r/min离心30min，收集上清液加热70℃，除掉热不稳定的大分子蛋白组分，冰水浴快速冷却后4℃离心，收集上清液，加入3倍体积-20℃乙醇冰箱过夜沉淀，最后4℃条件下将沉淀物分离，弃去上清液后加入10mLTris-HCl缓冲液，室温下溶解4h，溶液4℃再次离心分离，收集到的上清液加入10μL1.2mol/L盐酸溶液和200μL0.1mol/LEDTA，置于暗处反应10min脱去金属，即为MT粗提液。
实施例4-6
除不含金属硫蛋白提取液，其余组分及重量份分别和实施例1-3一致。
DTNB法测定金属硫蛋白含量结果分析：
MT脱去金属后与DTNB结合形成黄色络合物，通过紫外-可见分光光度计测定其浓度，即可得知MT含量。配置浓度为1μg/μL的MT混合标准品，在试管中分别加入20、40、60、80、100、150μL的MT标准溶液，之后加入5mmol/L DTNB试剂混匀3min，使MT与DTNB形成黄色络合物，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.25)稀释至4mL，在412nm波长处测定显色产物硫代硝基苯甲酸阴离子(TNBA)的量，以推算金属硫蛋白总量。样品测定为加入1mL样品溶液，其他试剂同上。
选用亲水性聚甲基丙烯酸酯填料的分子筛预装柱(Enrich SEC 70)，将提取得到的MT样品经7000r/min离心10min，之后过0.22μm滤膜，取1mL通过样品环上机，缓冲液为0.01mmol/L的Tris-HCl(pH 8.25)，流速为0.5mL/min，检测波长220nm，250nm，275nm。同时，将兔肝-金属硫蛋白标准品MT-I和MT-II用超纯水溶解，配置成浓度为1mg/mL，然后稀释到0.25mg/mL，上机，其他条件同上。以保留时间定性，峰面积占比计算纯度。
实施例1-3的金属硫蛋白提取液纯度分别为84％，81％，83％。
饲料添加剂效果试验：
试验用体重50g左右，体长18cm左右的一龄日本黄姑鱼，分别放养在3个循环水体内，每个水体放养50只体质健康、规格相近的日本黄姑鱼，3个水体中日本黄姑鱼体重基本一致总体重量基本相同，对各盆中日本黄姑鱼分别对其投喂实验饲料1号、2号、市场上购买的饲料。
1号饲喂本发明的饲料添加剂和市场上购买的饲料(实施例1-3)；
2号饲喂本发明不加金属硫蛋白提取液的饲料添加剂和市场上购买的饲料(实施例4-6)；
3号饲喂实施市场上购买的饲料；
饲养试验开始前准确称量每盆中每只鱼的体重，饲养实验8周结束后，禁食24h，进行样品采集。实验结束后称量实验鱼的终末体重，每个水体中取10只鱼分别解剖采集鱼的肠道、肝胰脏，先加入9倍0.9％生理盐水，用电动匀浆器在冰浴条件下充分匀浆；匀浆液在4℃，3000rpm条件下离心10min，吸取上清液，测定血液、肝胰脏生化免疫指标，同时取肝胰脏和肠道观察试验结果表明1号和2号饲喂组的饲料(添加了本发明的饲料添加剂)相对于3号饲喂组(市售饲料)能明显提高鱼免疫水平，1号饲喂组免疫指标优于2号饲喂组，2号饲喂组免疫指标优于3号饲喂组，投喂本发明的饲料添加剂，鱼肝功能明显增强(如表1所示)，肝糖原合成及分解正常，机体处于营养健康状态；肠道肠道壁厚、肠道增长，无炎症发生，肠道更健康，对病原微生物和内毒素的屏蔽作用明显更强，肝胰脏颜色正常，健康。血液生化指标也显示同样的结果(如表2所示)。
表1日本黄姑鱼肝脏免疫指标分析
指标 1号 2号 市场购买的饲料
超氧化物歧化酶U·mL 0.83±0.04 0.75±0.02 0.62±0.05
溶菌酶/U·L 0.20±0.01 0.17±0.01 0.12±0.01
表2日本黄姑鱼血液生化指标
指标 1号 2号 市场购买的饲料
总蛋白 30.86±0.12 28.35±0.12 20.11±0.12
谷丙转氨酶/U·L 11.5±0.12 9.6±0.11 6.8±0.15
谷草转氨酶/U·L 60.33±2.05 53.89±1.35 37.68±1.77
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，该添加剂包含以下成分及重量份：金属硫蛋白提取液8-35份，大豆磷脂5-10份，蛋粉0.5-3份，胆酸0.13-0.18份。
2.如权利要求1所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述金属硫蛋白提取液的提取方法包含以下步骤：
1）诱导：将鲜活虾夷扇贝Zn诱导5-7天；
2）提取：将诱导后的虾夷扇贝匀浆，匀浆组织中加入Tris-HCl缓冲液和TCEP后静置；
3）分离：离心后收集上清液，加热、离心、收集上清液，再加入乙醇后静置，收集沉淀物，加入Tris-HCl缓冲液溶解，再次离心分离得MT粗提液；
4）脱金属：MT粗提液加入盐酸溶液和LEDTA溶液于暗处脱去金属，得金属硫蛋白提取液。
3.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤1）中Zn诱导是采用氯化锌配置的暴露锌浓度为100mg/L的培养液培养虾夷扇贝。
4.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤2）中Tris-HCl缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值为8-9，匀浆组织与Tris-HCl缓冲液的的质量体积比为1:3。
5.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤2）中TCEP浓度为1wt%。
6.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤2）中静置温度为4℃，静置时间为6-10h。
7.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤3）中加热温度为70℃，加热时间为5min，溶解温度为室温，溶解时间为3-4h。
8.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤3）中离心温度为4℃，离心时间为15-30min，转速为9000-12000r/min。
9.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤3）中乙醇温度为-20℃，乙醇与上清液的体积比为3:1。
10.如权利要求2所述的水产品抗应激饲料添加剂，其特征在于，所述步骤4）中盐酸溶液浓度为1.2mol/L，LEDTA浓度为0.1mol/L，盐酸溶液和LEDTA的体积比为1:20，脱金属时间为8-12min。
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