CN110235822A - 活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法 - Google Patents

活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种活体水产品抗应激剂的生产方法，技术方案为将水1000ml、大豆粕10～15g、亚硒酸钠1.0～2.5g、磷酸氢二钾1.0～2.5g和混合菌液50～100mL混合后进行发酵，发酵结束后对发酵液高温杀菌并灭活酶，然后膜过滤去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得抗应激剂，其中，所述混合菌液为双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌混合培养后得到的菌液。本发明还公开了由上述方法得到的活体水产品抗应激剂及其使用方法，本发明富含有机硒、有利于水产品吸收利用、具有良好抗应激效果、且可改善水产品肌肉品质。

Description

活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法
技术领域
本发明属于水产品保鲜与贮运领域，具体的涉及一种活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法。
背景技术
活体水产品在运输过程中生理活动较为特殊，由于捕捞、运输、颠簸、氨氮等不利因素刺激，通常会使鱼体产生应激反应，造成应激胁迫，影响鱼体非特异性免疫能力和疾病抵抗力，造成鱼死亡。鱼类的应激反应是鱼体对各种环境因子的超常刺激(应激因子)所产生的全身性非特异性生理反应。鱼体的内外感受器接受应激因子的刺激后将信息传递到中枢神经系统(central nervous system,CNS)，由CNS启动应激反应，导致一系列复杂的生理变化。氧化应激是机体细胞水平上最常见的应激，是鱼类应激生物学研究领域的重要分支。以谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、过氧化脂质及其产物丙二醛、非酶抗氧化系统(如维生素C/E、谷胱甘肽)等作为氧化应激水平的量化指标，能较好地反映鱼类氧化应激反应状况。其中，AST和ALT主要存在于肝脏细胞中，血清中含量极少，当细胞受到损伤时才会扩算到血液，因此血清中含量可以反映鱼体应激水平。目前，关于水产品的暂养国内外研究较少，无法解决鱼体代谢高、应激强、运输存活率低、运输后品质下降等问题。
申请号为201810445420.9的中国专利公开了一种水产品抗应激饲料添加剂，将金属硫蛋白和蛋粉、大豆磷脂及胆汁酸复配作为抗应激饲料添加剂，具有抗应激效果；但是该饲料添加剂制备工艺复杂，且会导致水产品肝脏应激，使得血液中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量上升，肝脏细胞损伤增加。
申请号为201811146951.4的中国专利公开了一种可提高鲤鱼抗应激性的饲料，添加了鱼粉、猪肉粉、木薯粉、大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、海带粉、复合维生素、无机盐、大豆油、膨润土和中药添加剂等，具有抗应激效果；但该饲料配方复杂，且没有提供应用方法和效果数据，效果不确切，中药的添加也可能对脏器代谢带来负担。
申请号201810716122.9的中国专利公开了一种用于豆粕发酵的混合益生菌及其发酵方法，将罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉混合对豆粕进行发酵。该发明是固态发酵，具有效果的是发酵后的活菌，目的是调节猪肠道菌群，具有一定抗应激效果，但仅适用于畜禽。
综上所述，目前，在水产养殖中常用的抗应激剂包括维生素类、糖类、植物提取物、抗菌剂等，尚未发现将生物硒应用在活体水产品抗应激剂中的研究。硒元素是动物体中抗氧化酶(如：谷胱甘肽过氧化物酶)和硒-P蛋白的重要组成部分。经中国营养学会测定，成年人每天硒的摄入量应为50～250微克，但从食物中获取的硒远远低于正常人体代谢的需求量。而对于动物体特别是鱼体来说不可直接摄入无机硒，也没有有效摄入生物硒的摄入方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种富含有机硒、有利于水产品吸收利用、具有良好抗应激效果、且可改善水产品肌肉品质的活体水产品抗应激剂。
本发明的另一目是提供一种方法简单、生产成本低、有机硒转化率高的活体水产品抗应激剂的生产方法。
本发明还提供一种上述水产品抗应激剂的使用方法。
本发明活体水产品抗应激剂的生产方法，将水1000ml、大豆粕10～15g、亚硒酸钠1.0～2.5g、磷酸氢二钾1.0～2.5g和混合菌液50～100mL混合后进行发酵，发酵结束后对发酵液高温杀菌并灭活酶，然后膜过滤(优选3000～5000kDa)去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得抗应激剂，其中，所述混合菌液为双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌混合培养后得到的菌液。
所述双歧杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌的菌种液为从固体培养基挑出单菌落分别37℃液体培养36h的菌液，按1～5:2:1(优选2-3：2：1)体积比混合后37℃继续培养36h，制成混合菌液(含菌量1～5×109CFU/mL)。
所述发酵温度为37℃、pH为6.0～6.5，发酵时间48～62h。
本发明活体水产品抗应激剂，上述生产方法制得，所述抗应激剂中至少含有菌体单质硒、硒代氨基酸、灭活的微生物和酶。
所述抗应激剂中总有机硒含量90～120mg/g。
本发明活体水产品抗应激剂的使用方法为：每公斤水产品对应抗应激剂的使用剂量为5～50mg，每公斤水产品加入5～10L水。抗应激剂在水中的添加浓度优选为1～5mg/L，
将抗应激剂加入水中混匀，然后加入水产品进行3～5天暂养，使用期间禁投饲料，每次换水需重新加入相应剂量的抗应激剂。
春秋季节水温控制为15～16℃，夏季水温控制为20～22℃。
针对背景技术中存在的问题，发明人进行深入研究，首次将无机硒亚硒酸钠加入到大豆粕底物中，巧妙的利用混合发酵将无机硒转化成菌体膜蛋白单质硒、硒代氨基酸等有机硒，将富含有机硒的发酵物应用在水体中，通过富硒发酵物-水体-鱼体之前的交互作用，可有效降低鱼体应激指标-血液谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量，抗应激效果非常好；同时提高了鱼体有机硒含量、肌肉持水力和嫩度。
本发明中，采用双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌进行混合发酵，是因为双歧杆菌和嗜热链球菌可利用底物合成胞外多糖、细菌素、维生素等，同时促进硒的利用转化；乳酸杆菌可利用复合碳源产生大量乳酸，同时促进硒等微量元素的利用转化。三者协同，可有效利用发酵底物中的植物蛋白、复合碳源氮源、无机盐及微量元素，底物转化率高，有机硒的转化效率高，使总有机硒含量可达90～120mg/g。底物中亚硒酸钠的添加量为1.0～2.5g，过高会导致无机硒残余，过低会导致豆粕和磷酸盐利用不完全。
本发明抗应激剂采用混合发酵工艺，通过高温杀菌并灭活酶、过滤滤渣，得到的产品中至少含有菌体单质硒、硒代氨基酸、灭活的微生物和酶，这些成分全部能被水产品的消化吸收，其中菌体单质硒和硒代氨基酸具有提高抗氧化酶(如：谷胱甘肽过氧化物酶)和硒-P蛋白活性，维持水产品抗氧化系统和细胞膜稳定，提高免疫力的功能，而灭活后的微生物和酶也是优质蛋白，不仅不会对水产品的脏器代谢带来任何负担或副作用影响，还能有效降低水产品捕捞应激，预防运输应激；使用后鱼肉有机硒含量可达0.05～0.09mg/kg。本发明可解决活体水产品运输前应激强、品质下降等问题，有效预防鱼体在长途运输中的疾病及应激氧化反应，提高活体水产品运距离保活流通后的存活时间、存活率和鱼体品质。
具体实施方式
菌液培养实施例：
将双歧杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌的菌种液在37℃分别培养36h后按照体积比1:2:1、2:2:1、3:2:1、4:2:1、5:2:1混合制成悬浊液，在37℃下进一步培养36h后得到浓度分别为1.0×109CFU/mL、3.1×109CFU/mL、5.0×109CFU/mL、3.6×109CFU/mL、2.5×109CFU/mL的混合菌液1-5。
实施例1
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕900g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾120g，亚硒酸钠165g(其中硒含量75.9g)，水70L，混合菌液3使用7L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵56h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶，通过膜过滤(5000kDa)去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉675g，每g干粉中总有机硒含量120mg。抗应激剂使用剂量为5～50mg/kg水产品，在水中的添加浓度为1～5mg/L。在放入鲈鱼(大口黑鲈)进行3天暂养，鱼水比例为1kg鱼:7L水。3天后取鱼，麻醉后尾椎处取血5mL，血样置于4℃冰箱中，1小时后取血清按照试剂盒说明书测定血液相关指标。
取鱼背部肉10g，按照《食品安全国家标准食品中硒的测定》GB5009.93—2017)中氢化物原子荧光光谱法进行总硒和无机硒含量的测定。取2g样品加40mL 4mol/L的HCl，在100℃下进行回流反应30min，等待冷却之后取上清液，采用原子荧光光谱法测定样品中无机硒含量。取2g干样，加入15mL混合消化液(12mL HNO3+3mL HClO4)，100℃消化2h，待冷却后加入40mL的HCl 4mol/L，反应10min，蒸馏水定容，采用原子荧光光谱法测定总硒含量。有机硒含量(mg/kg)＝总硒含量-无机硒含量，结果见表1。
表1不同剂量抗应激剂的鲈鱼血液相关酶结果
结果可见，鱼血液应激相关指标谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)值均比对照组有所下降。AST和ALT主要存在于肝脏细胞中，血清中含量极少，当细胞受到损伤时才会扩散到血液，因此表1结果表明随抗应激剂使用剂量上升，鱼体应激损伤下降，应激恢复较好。此外，暂养3天时，鱼肌肉中富集的有机硒随抗应激剂添加剂量增加而增加，其含量符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。
实施例2，同实施例1，不同的是，
抗应激剂使用剂量为35mg/kg水产品，在水中的添加浓度为5mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行5天暂养，鱼水比例为1kg鱼:7L水。每天取样，迅速取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，用低场核磁共振仪进行肌肉结合水、半结合水、自由水的分布检测，结果见表2。
表2使用期间鱼肉水分分布和占比结果
表2结果可见，在使用剂量为35mg/kg水产品时，鲈鱼在暂养5天后，肌肉半结合水(P21)上升，自由水占比(P22)下降，即鱼肉持水力上升。
实施例3，同实施例1，不同的是:
抗应激剂使用剂量为30mg/kg水产品，在水中的添加浓度为5mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行5天暂养，鱼水比例为1kg鱼:6L水。每天取鱼，麻醉后尾椎处取血5mL，血样置于4℃冰箱中，1小时后取血清按照试剂盒说明书测定血液相关指标(ALT和AST)。每天取鱼，迅速取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果见表3和表4。
表3使用期间鱼血液中相关应激指标结果
表4使用期间鱼肉硬度结果
根据表3结果，鱼血液应激相关指标谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)均随时用时间的延长而下降。AST和ALT主要存在于肝脏细胞中，血清中含量极少，当肝脏细胞受到损伤时才会扩散到血液，因此表3结果表明随抗应激剂使用时间的延长，鱼体肝脏应激损伤下降，应激恢复较好。表4的质构结果表明，随时用时间的延长，鱼肉硬度下降，即嫩度上升，可能跟肌肉结合水占比上升有关(表2)。
实施例4
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕700g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾70g，亚硒酸钠70g(其中硒含量32.2g)，水70L，混合菌液1使用3.5L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵48h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶。通过膜过滤(4000kDa)去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉352g，每g干粉中总有机硒含量90mg。抗应激剂使用剂量为5mg/kg水产品，在水中的添加浓度为1mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行3天暂养，鱼水比例为1kg鱼:5L水。第3天取样，取鱼背部肉10g，采用原子荧光光谱法测定总硒和单质硒的含量，鱼肉有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量，为0.051mg/kg，符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果为2452.87g，低于表4对照组第五天硬度结果。
实施例5
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕750g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾90g，亚硒酸钠90g(其中硒含量41.4g)，水70L，混合菌液2使用3.5L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵62h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶。通过膜过滤(4000kDa)，去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉405g，每g干粉中总有几硒含量102mg。
抗应激剂使用剂量为12mg/kg水产品，在水中的添加浓度为2mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行4天暂养，鱼水比例为1kg鱼:6L水。第4天取样，取鱼背部肉10g，采用原子荧光光谱法测定总硒和单质硒的含量，鱼肉有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量；结果为0.055mg/kg，符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果为2352.87g，低于表4第五天对照组结果。
实施例6
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕800g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾110g，亚硒酸钠110g(其中硒含量50.6g)，水70L，混合菌液3使用5L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵56h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶。通过膜过滤(4000kDa)，去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉445g，每g干粉中总有机硒含量114mg。
抗应激剂使用剂量为21mg/kg水产品，在水中的添加浓度为3mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行4天暂养，鱼水比例为1kg鱼:7L水。第4天取样，取鱼背部肉10g，采用原子荧光光谱法测定总硒和单质硒的含量，鱼肉有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量；结果为0.059mg/kg，符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果为2326.51g，低于表4对照组。
实施例7
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕850g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾130g，亚硒酸钠130g(其中硒含量59.8g)，水70L，混合菌液3使用6L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵60h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶。通过膜过滤(3000kDa)，去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉587g，每g干粉中总有机硒含量102mg。
抗应激剂使用剂量为32mg/kg水产品，在水中的添加浓度为4mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行5天暂养，鱼水比例为1kg鱼:8L水。第5天取样，取鱼背部肉10g，采用原子荧光光谱法测定总硒和单质硒的含量，鱼肉有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量；结果为0.066mg/kg，符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果为2287.36g，低于表4对照组。
实施例8
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕950g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾150g，亚硒酸钠150g(其中硒含量69.0g)，水70L，混合菌液4使用7L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵62h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶。通过膜过滤(3000kDa)，去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉660g，每g干粉中总有机硒含量104.5mg。
抗应激剂使用剂量为45mg/kg水产品，在水中的添加浓度为5mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行5天暂养，鱼水比例为1kg鱼:9L水。第5天取样，取鱼背部肉10g，采用原子荧光光谱法测定总硒和单质硒的含量，鱼肉有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量；结果为0.075mg/kg，符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果为2152.64g，低于表4对照组。
实施例9
使用100L发酵罐，按比例添加发酵底物，大豆粕1050g(粉碎过40目筛)，磷酸氢二钾175g，亚硒酸钠175g(其中硒含量80.5g)，水70L，混合菌液5使用7L。37℃连续搅拌(速率140转/分钟)发酵62h，实时监测pH值，添加食用小苏打使pH保持在6.0～6.5。发酵结束后用高温高压杀菌并灭活酶。通过膜过滤(3000kDa)，去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得红色干粉750g，每g干粉中总有机硒含量107mg。
抗应激剂使用剂量为50mg/kg水产品，在水中的添加浓度为5mg/L。在带有水循环系统和过滤系统的水池中加入抗应激剂，混匀，水体呈淡红色，然后加入水产品进行5天暂养，鱼水比例为1kg鱼:10L水。第5天取样，取鱼背部肉10g，采用原子荧光光谱法测定总硒和单质硒的含量，鱼肉有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量；结果为0.082mg/kg，符合DB6124.01-2010富硒食品硒含量标准(水产品0.02-1.00mg/kg)。取鱼背部肉，切割成若干2*2*2cm的小块，在质构仪中进行硬度测定，结果为2146.53g，低于表4对照组。

Claims (9)

1.一种活体水产品抗应激剂的生产方法，其特征在于，将水1000ml、大豆粕10～15g、亚硒酸钠1.0～2.5g、磷酸氢二钾1.0～2.5g和混合菌液50～100mL混合后进行发酵，发酵结束后对发酵液高温杀菌并灭活酶，然后膜过滤去除发酵滤渣，滤过液冷冻干燥后获得抗应激剂，其中，所述混合菌液为双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌混合培养后得到的菌液。
2.如权利要求1所述的活体水产品抗应激剂的生产方法，其特征在于，所述双歧杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌的菌种液按1～5:2:1体积比混合制成悬浊液，培养后得到含菌量为1～5×109CFU/mL的混合菌液。
3.如权利要求1或2所述的活体水产品抗应激剂的生产方法，其特征在于，所述发酵温度为37℃、pH为6.0～6.5，发酵时间48～62h。
4.一种活体水产品抗应激剂，其特征在于，由权利要求1-3任一项生产方法制得。
5.如权利要求4所述的活体水产品抗应激剂，其特征在于，所述抗应激剂中至少含有菌体单质硒、硒代氨基酸、灭活的微生物和酶。
6.如权利要求5所述的活体水产品抗应激剂，其特征在于，所述抗应激剂中总有机硒含量90～120mg/g。
7.一种权利要求4-6任一项所述活体水产品抗应激剂的使用方法，其特征在于，每公斤水产品对应抗应激剂的使用剂量为5～50mg，每公斤水产品加入5～10L水。
8.如权利要求7所述活体水产品抗应激剂的使用方法，其特征在于，将抗应激剂加入水中混匀，然后加入水产品进行3～5天暂养，使用期间禁投饲料，每次换水需重新加入相应剂量的抗应激剂。
9.如权利要求7或8所述的活体水产品抗应激剂的使用方法，其特征在于，春秋季节水温控制为15～16℃，夏季水温控制为20～22℃。
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