CN102823772A - 一种抗猪热应激的富硒复合菌饲料添加剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饲料添加剂的应用领域，涉及一种抗猪热应激的富硒复合菌饲料添加剂及其应用。选用酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌作菌种，按1:2:2的体积比混合接种于含亚硒酸钠与硒转化和益生菌生长促进剂的适宜发酵液中，在温度为20～40℃，通气量为0.05m3/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa的条件下发酵30～40h，通过适当的后续处理，获得富含有机硒的复合菌制剂。饲喂该制剂能显著改善高温环境下猪的日增重和料重比，增强抗氧化性能和免疫功能，降低热休克蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平，有效发挥抗猪热应激的作用。
Description
技术领域
本发明属于饲料添加剂的应用领域，涉及一种抗猪热应激的富硒复合菌饲料添加剂及其应用。
技术背景
我国南方的大部分地区夏季和初秋气温高、湿度大，中北部近年来夏季气温也很高，加上没有像发达国家那样采用控温控湿全封闭的猪舍，因此猪的热应激问题越来越严重，特别是对集约化高密度饲养下的猪产生了极大地影响。国外学者报道，18-28公斤的小猪在35℃环境温度时，其体温可高出正常体温1.4℃，长期暴露在高温下的猪，过多的产热蓄积在体内不能散出，导致猪的神经内分泌系统发生变化，引起热应激。热应激的猪表现为精神沉郁、体温升高、心跳加快、呼吸急促甚至发生热性喘息、采食减少、喜欢饮水、活动量减少、伸张躯体、生长缓慢或停滞、繁殖机能下降、抗氧化功能和免疫功能下降，这严重制约了猪的生产效率，给养猪业带来巨大的经济损失。
目前国内外有许多减少猪热应激的措施。欧美发达国家大多数猪场通过采用控温控湿全封闭猪舍来解决这一难题。但是由于我国电价成本相对于猪肉价格较高，控温控湿全封闭猪舍很难推广；实际生产中，尤其在气温超过30℃时，通常采用通风降温结合冲洗等措施降低猪舍温度，缓解热应激对猪只的不良影响。但是降温的同时也极大的增加了猪舍湿度，不利于猪只自身体温调节，所以作用非常有限。目前报道的抗热应激添加剂也较多，如电解质平衡剂、酸制剂、药物与生物制剂，但这些抗热应激添加剂的效果都不太理想，而长期使用某些抗热应激药物，难免出现毒副作用和药物残留。另外，高温热应激可使动物发生氧化应激，氧化应激是猪只高温热应激反应的一部分。因此，在猪舍条件短期内难于实现根本改善的前提下，另辟蹊径，开发一种以抗氧化作用为主要特点的新型绿色抗猪热应激饲料添加剂，对于解决热应激导致的猪只的生长性能、抗氧化与免疫功能下降问题具有理论和现实意义。
众所周知，硒是人和动物所必需的微量元素，是一种多功能的生命营养元素。研究表明，硒具有抗氧化，调节机体代谢，提高机体免疫力和抗病力，提高繁育机能，抗肿瘤，防治地方病，延缓衰老，拮抗有毒元素等多种功能。自然界中，硒以有机硒和无机硒形式存在。无机硒包括硒酸盐和亚硒酸盐。有机硒存在形式之一是以可解离的因子，常见于细菌；另一种以氨基酸共价键结合形式存在，主要是有结合硒的蛋白又称为含硒蛋白(硒蛋氨酸Se-Met)和以硒半胱氨酸(Se-Cys)形式参入到多肽链的蛋白质称为硒蛋白又叫硒酶(如谷胱甘肽过氧化物酶、碘甲腺原氨酸脱碘酶和硒蛋白-P等)。硒是通过硒蛋白发挥作用的，Se-Cys被认为是硒的生物活性形式。Se-Met参入各种蛋白质中置换蛋氨酸，但组织中的Se-Met不能在体内合成，主要来自膳食。硒在动物机体中以Se-Cys的形式参与构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，从而清除体内过多的活性氧自由基。硒可以由谷胱甘肽(GSH)介导，生成硒代三硫化物(GSSeSG)和硒代硫化物(GSSeH)。硒具有增加GSH-Px的活力，降低机体内过氧化物堆积的功能。大量研究表明，有机硒的生物利用率高于无机硒，且毒性较小，适口性好。生物有机化是获得有机营养元素的简便而经济的途径，有利于实际生产中大量应用。硒的生物有机化主要是在植物和微生物体内进行的。有关硒特别是硒酵母对鸡和奶牛热应激的影响近年来研究较多，但对猪热应激的影响鲜有报道。
益生菌是指“当摄入一定量时能对宿主的健康有作用的微生物活体”，主要包括乳酸菌类、双歧杆菌类、芽孢杆菌类、光合细菌类和酵母类等。研究表明，益生菌能通过竞争性排斥病原、增强肠道屏障功能来防止肠道感染，维持肠道菌群平衡，提高免疫机能。近来有报道，益生菌具有缓解家禽热应激的能力，例如乳杆菌能提高热应激蛋鸡和肉鸡的生产性能和采食量。但应用益生菌尤其是应用复合益生菌对猪热应激的影响鲜有报道，至于应用富含有机硒的复合益生菌缓解猪的热应激国内外均未见报道。
发明内容
技术问题：
本发明涉及一种简单、低成本生产的富硒复合菌饲料添加剂具有抗猪热应激的作用。在含有无机硒源的发酵液中加入复合菌，并加入有机硒转化促进剂，其中的多种益生菌能将无机态的硒转变成有机态的硒，得到一种可同时发挥有机硒和复合益生菌等多重作用的饲料添加剂。用该添加剂饲喂高温环境下的猪只，能缓解热应激所带来的不利影响，提高猪的抗氧化性能、免疫功能与生长性能，降低热应激蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平。
技术方案：
热应激条件下，机体的氧化应激加剧，消耗的抗氧化物质增多。本发明利用有机硒和复合益生菌都能增强机体抗氧化能力的原理，在预试验的基础上，筛选出以3种不同的益生菌(嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌和酿酒酵母)为菌种，接种于含亚硒酸钠的培养基中，通过发酵生产出具有有机硒和复合益生菌等多重作用的饲料添加剂，将该添加剂饲喂热应激条件下的猪只，能有效发挥抗热应激的作用。
一种具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂在制备具有抗猪热应激作用的饲料中的应用。
所述的具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂优选按照以0.2-0.5mg/kg的硒水平添加到基础日粮中，进一步优选按照以0.3mg/kg的硒水平添加到基础日粮中。
本发明所述的一种具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂，所述的富硒复合菌饲料添加剂通过如下方法制备得到：
将无机硒源加入生产培养基中，使培养基中硒浓度为4～10mg/L；按1∶2∶2（v/v/v）比例将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种子液，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)种子液和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)种子液接种于添加了有机硒转化和益生菌生长促进剂的生产培养基中，总接种量为2％～5％（v/v），在发酵温度为20～40℃，通气量为0.05m3/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa的条件下发酵30～40h，获得富硒复合菌添加剂；所获得的富硒复合菌添加剂中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到109/mL、1010/mL和1010/mL左右；含硒量为4～10mg/L；其中有机硒含量在90％以上，硒蛋氨酸含量在75％以上；
其中，
所述的无机硒源：配制含硒量为0.5～5mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
所述的生产培养基：0.5％～2％酵母膏，0～1％牛肉浸膏，0.5％～3％葡萄糖，pH自然；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
所述的有机硒转化和复合菌生长促进剂添加量为：每升生产培养基中加入1～5g寡糖、0.01～0.5g蛋氨酸、0.01～0.5g丝氨酸、0.1～2g硫酸铵、0.01～0.5g磷酸氢二钾和0.01～0.5g磷酸二氢钾。
本发明所述的具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂中，所述的酿酒酵母种子液，嗜酸乳杆菌种子液和嗜热链球菌种子液分别优选通过如下方法获得：
1)将保存在4℃的酿酒酵母接种于斜面活化培养基上，20～30℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，20～30℃，220r/min，摇床培养30～40h，得到酿酒酵母种子液；
2)将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到嗜酸乳杆菌种子液；
3)将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，30～43℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～43℃，培养30～40h，得到嗜热链球菌液体种子液；
其中，所述的斜面活化培养基配方如下：
酿酒酵母活化培养基：酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，pH为5.5～6.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜酸乳杆菌活化培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温801ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO42g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜热链球菌活化培养基：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
所述的液体活化培养基：斜面活化培养基中不加琼脂。
本发明所述的具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂的生产方法，包括：
①菌种：酿酒酵母，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌，均为农业部允许使用的饲料级益生菌菌种；
②生产培养基：0.5％～2％酵母膏，0～1％牛肉浸膏，0.5％～3％葡萄糖，pH自然；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
③斜面活化培养基：
酿酒酵母活化培养基：酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，pH为5.5～6.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜酸乳杆菌活化培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温801ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO42g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜热链球菌活化培养基：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
④液体活化培养基：斜面活化培养基中不加琼脂；
⑤无机硒源：配制含硒量为0.5～5mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
⑥菌种的活化与种子液的获得：
将保存在4℃的酿酒酵母接种于斜面活化培养基上，20～30℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，20～30℃，220r/min，摇床培养30～40h，得到酿酒酵母种子液；将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到嗜酸乳杆菌种子液；将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，30～43℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～43℃，培养30～40h，得到嗜热链球菌液体种子液；
⑦发酵：
将无机硒源加入生产培养基中，使培养基中硒浓度为4～10mg/L；按1∶2∶2比例将酿酒酵母种子液，嗜酸乳杆菌种子液和嗜热链球菌种子液接种于添加了有机硒转化和益生菌生长促进剂的生产培养基中，总接种量为2％～5％（v/v），在发酵温度为20～40℃，通气量为0.05m3/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa的条件下发酵30～40h，获得富硒复合菌添加剂；所获得的富硒复合菌添加剂中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到109/mL、1010/mL和1010/mL；含硒量为4～10mg/L；其中有机硒含量在90％以上，硒蛋氨酸含量在75％以上。
本发明建议的日粮组成及饲喂方法：根据国家研究委员会制定的猪营养需求标准，配制了除硒之外的其他营养都满足营养需要的玉米豆粕型基础日粮，将富硒复合菌以0.3mg/kg的硒水平添加到基础日粮中，连续饲喂。自由采食和饮水，用药和防疫按猪场常规程序进行。
有益效果：
本发明利用益生菌可将无机态的硒转化成有机态的硒以及不同益生菌的协同作用原理，筛选出特定的益生菌，以及针对所述益生菌组合物的有机硒转化和益生菌生长促进剂，通过在富含有机硒转化和复合菌生长促进剂的培养基中对益生菌的发酵生产出富含较高量有机硒的复合菌产品。本发明的富硒复合菌同时发挥有机硒和复合益生菌的多重功效，能显著提高热应激条件下猪的平均日增重，降低料重比，提高抗氧化能力和免疫功能，降低热应激蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平，缓解热应激所带来的不利影响。
附图说明
图1.富硒复合菌对断奶仔猪肝脏（A）、肾脏（B）和脾脏（C）相对热休克蛋白Hsp70mRNA表达的影响。Con为对照组，P为复合菌组，SS为亚硒酸钠组，SP为富硒复合菌组。柱形图代表平均数±标准误。同一脏器内平均值带有不同字母表示差异显著(P<0.05)。
图2.富硒复合菌对断奶仔猪肝脏（A）、肾脏（B）和脾脏（C）相对热休克蛋白Hsp27mRNA表达的影响。Con为对照组，P为复合菌组，SS为亚硒酸钠组，SP为富硒复合菌组。柱形图代表平均数±标准误。同一脏器内平均值带有不同字母表示差异显著(P<0.05)。
图3.富硒复合菌对育肥猪外周血（A）和脾脏（B）淋巴细胞转化率的影响。对照组为基础日粮组，试验组为基础日粮加富硒复合菌组。柱形图代表平均数±标准误。同一脏器内平均值带有不同字母表示差异显著(P<0.05)。
图4.富硒复合菌对育肥猪肝脏（A）、肾脏（B）和脾脏（C）相对热休克蛋白Hsp70mRNA表达的影响。对照组为基础日粮组，试验组为基础日粮加富硒复合菌组。柱形图代表平均数±标准误。同一脏器内平均值带有不同字母表示差异显著(P<0.05)。
图5.富硒复合菌对育肥猪肝脏（A）、肾脏（B）和脾脏（C）相对热休克蛋白Hsp27mRNA表达的影响。对照组为基础日粮组，试验组为基础日粮加富硒复合菌组。柱形图代表平均数±标准误。同一脏器内平均值带有不同字母表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方案
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1以江苏兴化某猪场48头28日龄断奶仔猪为实施对象
1.富硒复合菌饲料添加剂的生产
(1)菌种：
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)：购自中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌株代号为1.1878；
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus):购自中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌株代号为1.2471；
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：购自中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌株代号为2.2081。
(2)无机硒源：配制Se浓度为1.0mg/ml的亚硒酸钠溶液800ml，115℃，高压蒸汽灭菌30min，备用。
(3)菌种的活化与种子液的获得：将保存在4℃的酿酒酵母接种于斜面培养基上，28℃，培养32h；如此连续活化3次后，再接种于0.5L液体活化培养基中，28℃，220r/min，摇床培养32h，得到酿酒酵母液体种子液A；将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3次后，再接种于1L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜酸乳杆菌种子液B；将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3次后，再接种于1L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜热链球菌液体种子液C。
(4)发酵：将生产培养基2kg葡萄糖、2kg酵母浸膏溶解在20L水中，然后加入到BIOTECH-BS/JS(150L)发酵罐中，加80L水补至100L，115℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，加入800ml亚硒酸钠（1mg/ml，以Se计）溶液；加入硒转化及益生菌生长促进剂：培养基中加入已灭菌的100g寡糖、1克蛋氨酸、1克丝氨酸、100g硫酸铵、20g磷酸氢二钾和20g磷酸二氢钾，充分搅拌均匀，然后接入菌种液A 0.5L、菌种液B 1L和菌种液C 1L；培养温度：30℃；通气量：0.05m3/h；转数：70r/min；罐压：0.04Mpa；发酵时间：36h；发酵结束，将富硒复合菌发酵液分装入桶，4℃冷藏，备用。
上述发酵获得的富硒复合菌中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到3.75×109/mL、4.46×1010/mL和5.12×1010/mL；含硒量为7.5mg/L，其中有机硒含量为91.34％以上，硒蛋氨酸含量为76.26％。
2.复合菌饲料添加剂的生产
按照生产富硒复合菌饲料添加剂的方法生产复合菌饲料添加剂，不同的是不加入无机硒，也不加入有机硒转化和复合菌生长促进剂。发酵获得的复合菌中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到5.18×109/mL、5.87×1010/mL和6.05×1010/mL。
3.富硒复合菌饲料添加剂饲喂高温环境下的断奶仔猪
(1)实施动物与分组
试验选用48头28日龄杜长大断奶仔猪（平均体重7.7±0.5kg），随机分为4组，每组3个重复，每个重复4头，Con组为玉米豆粕型基础日粮；P组在其基础日粮中添加一定量的复合菌（与SP组含等量益生菌数）；SS组在其基础粮中添加0.3mg.kg-1硒的亚硒酸钠；SP组在其基础粮中添加0.3mg·kg-1硒的富硒复合菌。
(2)日粮与饲养管理
试验采用玉米－豆粕型基础日粮，其营养组成除了硒之外，均按照NRC（1998）关于断奶仔猪所需营养标准并结合生产实践进行配制（表1）。将富硒复合菌、亚硒酸钠、复合菌按实验所需剂量添加到基础日粮中，配制成3种试验日粮，基础日粮作对照。充分混匀后，分别取样，测定实际硒含量（表2）。
试验猪饲养在夏天自然高温环境下的猪舍，自由采食、饮水、每日喂料3次，每天记录猪舍温度，舍温26～40℃，其他管理按猪场常规管理进行。试验时间为2011年6月12日-7月30日，其中预试期7d，正式试验期42d，试验组与对照组分别饲喂试验日粮和基础日粮。
表1断奶仔猪基础日粮组成和营养水平
注：预混料为每千克日粮提供：维生素A 15000IR；维生素D3 3000mg；维生素E40mg；维生素K2mg；烟酸40mg；泛酸20mg；叶酸2mg；维生素B120.2mg；胆碱1000mg；铁100mg；铜10mg；锰40mg；锌100mg；硒0.2mg；碘0.5mg。
表2试验日粮中硒添加水平及实际测定的硒水平
说明：P代表复合菌，SS代表亚硒酸钠，SP代表富硒复合菌。
(3)样品采集与制备
在正式试验的第0d、14d、28d和42d分别从各组随机选取3头猪进行前腔静脉采血，EDTA抗凝和不抗凝，抗凝血保存于-20℃用于测全血硒含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）酶活。非抗凝血斜放于37℃2h，后4℃过夜，离心分离血清，保存于-20℃用于测定丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）酶活。
在正式试验第42d采血结束后每组随机选取3头猪屠宰。肝、肾、脾迅速分离并用冷的平衡盐溶液清洗，后液氮冷冻，保存于-70℃，用于测定Hsp70和Hsp27mRNA水平。
(4)测定指标及方法
①生长性能的测定
仔猪在正式试验前分组时称个体体重，以后在第42d试验结束时称个体体重一次，记录体重和耗料量，计算各组的平均日增重、平均日采食量和料重比（耗料/增重）。
②硒含量的测定
利用氢化物发生－原子荧光光谱法测定日粮、蛋样硒含量。
精确吸取1ml完全混匀的全血样品放入250ml具塞的三角瓶，而后加入10ml高氯酸与硝酸的混酸（V∶V=1∶1），盖上塞子，冷消化过夜。次日于电热板上加热消化(消化温度不超过180℃)，并及时补加混合酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟出现时，再继续加热至体积剩余2ml左右，切不可蒸干。冷却，再加入6mol·L-1盐酸5ml，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现。冷却，将消化液稀释适当倍数后，取一定量转移到25ml的容量瓶中，加1ml的0.30mol·L-1铁氰化钾溶液，用5％(V∶V)的盐酸溶液定容，同时用超纯水和硒标准参照物（GBW08551猪肝，国家商业局食品检测科学院）做空白对照和标准样品对照，利用原子荧光光谱仪测定全血样品硒含量。
③全血GPX酶活分析
采用二硫代硝基苯甲酸法(DTNB法)，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。每4μl全血在37℃反应5min，扣除非酶促反应，以GSH浓度降低1mol·L-1为一个酶活力单位。
④MDA含量分析
采用TBA法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
⑤SOD酶活分析
采用黄嘌呤氧化酶法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。以每毫升反应液中SOD抑制率达到50％时所对应的SOD含量为一个SOD活力单位(R·L-1)。
⑥Hsp70和Hsp27mRNA水平分析
根据已发表的2个热休克蛋白基因和1个内参基因序列，用Primer Primer（PREMIER BiosoftInternational，USA）设计引物，引物参数见下表3。总RNA的提取采用TRIZOL试剂盒（TaKaRa，china）按照说明书操作进行，最后通过1.5％琼脂糖凝胶电泳和蛋白核酸测定仪检测所提取的RNA的质量。Real-time PCR反应体系与PCR扩增条件参照TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒说明书。Real-time PCR扩增在美国应用生物系统公司（ABI）生产的7300Real-time PCRSystem上进行。结果用2-ΔΔCT表示。
表3荧光定量PCR的引物
(5)实施结果
①富硒复合菌对断奶仔猪生产性能的影响
试验期间仔猪平均日增重、平均日采食量和料重比的测定结果见表4。由表4可知，与对照组相比，复合菌组、亚硒酸钠组和富硒复合菌组平均日增重分别提高了3.57％、5.19％和16.88％，料重比分别下降了2.52％、3.78％和12.18％。复合菌组和亚硒酸钠组在提高日增重和料重比时与对照组比差异不显著（P>0.05），而富硒复合菌组与对照组相比差异显著（P<0.05），且在提高日增重和料重比时显著优于复合菌组和亚硒酸钠组（P<0.05）。结果表明，日粮中添加富硒复合菌可显著提高热应激条件下断奶仔猪的日增重，降低料重比。
表4富硒复合菌在高温环境下对断奶仔猪生产性能的影响
注：同一行中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
②富硒复合菌对断奶仔猪全血硒含量的影响
试验期间仔猪全血硒含量见表5。由表5可知，在整个42d的试验期内，与对照组相比，饲喂复合菌对仔猪全血硒含量无显著影响（P>0.05）。在第14d、28d和42d，亚硒酸钠组和富硒复合菌组断奶仔猪的全血硒含量显著高于对照组和复合菌组（P<0.05），且富硒复合菌组的全血硒含量显著高于亚硒酸钠组的全血硒含量（P<0.05）。在第14d、28d和42d，富硒复合菌组仔猪的全血硒含量比亚硒酸钠组分别高出7.92％、9.11％和7.98％（P<0.05）；比复合菌组分别高出了16.24％、19.51％和21.48％（P<0.05）；比对照组组分别高出了20.35％、23.99％和26.50％（P<0.05）。对照组和复合菌组断奶仔猪的全血硒含量在整个42d的试验期间基本保持稳定。添加富硒复合菌或亚硒酸钠14d后便可显著提高断奶仔猪的全血硒含量，且富硒复合菌效果显著优于亚硒酸钠。结果表明，富硒复合菌可显著提高热应激条件下断奶仔猪全血硒含量。
表5富硒复合菌在高温环境下对断奶仔猪全血硒含量变化的影响(ug·L-1)
注：同一列中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
③富硒复合菌对断奶仔猪全血GPX酶活性的影响
试验期间仔猪全血GPX酶活性见表6。由表6可知，整个试验期内，与对照组相比，复合菌组的全血GPX酶活性无显著性影响（P>0.05）。在第14d、28d和42d，亚硒酸钠组和富硒复合菌组断奶仔猪的全血GPX酶活性显著高于对照组和复合菌组（P<0.05），且富硒复合菌组的全血GPX酶活性显著高于亚硒酸钠组的全血GPX酶活性（P<0.05）。在第14d、28d和42d，富硒复合菌组仔猪的全血GPX酶活性比亚硒酸钠组分别高出21.47％、22.28％和21.39％（P<0.05）；比复合菌组分别高出了60.98％、61.10％和64.55％（P<0.05）；比对照组组分别高出了65.00％、72.03％和79.48％（P<0.05）。对照组和复合菌组断奶仔猪的全血GPX酶活性在整个42d的试验期间基本保持稳定。添加富硒复合菌或亚硒酸钠14d后便可显著提高断奶仔猪的全血GPX酶活性，且富硒复合菌效果显著优于亚硒酸钠。结果表明，富硒复合菌可显著提高热应激条件下断奶仔猪全血GPX酶活性。
表6富硒复合菌在热应激条件下对断奶仔猪全血GPX酶活变化的影响(R·L-1)
注：同一列中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
④富硒复合菌对断奶仔猪血清SOD酶活性的影响
试验期间仔猪血清SOD酶活性见表7。由表7可知，复合菌、亚硒酸钠和富硒复合菌饲喂断奶仔猪14d、28d和42d后，均可使断奶仔猪血清中SOD活性显著升高（P<0.05）。在饲喂相同时间后，富硒复合菌组提高仔猪血清中SOD酶活性的效果优于复合菌组和亚硒酸钠组。结果表明，富硒复合菌可显著提高热应激条件下断奶仔猪血清SOD酶活性。
表7富硒复合菌在高温环境下对断奶仔猪血清SOD酶活性变化的影响(R·L-1)
注：同一列中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
⑤富硒复合菌对断奶仔猪血清MDA含量的影响
试验期间仔猪血清MDA含量见表8。由表8可知，复合菌、亚硒酸钠和富硒复合菌饲喂仔猪14d、28d和42d后，均可使断奶仔猪血清中MDA含量显著下降（P<0.05）。在饲喂相同时间后，富硒复合菌试验组降低仔猪血清中MDA含量的效果最好，与复合菌组和亚硒酸钠组差异显著（P<0.05）。结果表明，富硒复合菌可显著降低热应激条件下断奶仔猪血清MDA含量。
表8富硒复合菌在高温环境下对断奶仔猪血清MDA含量变化的影响(mol·L-1)
注：同一列中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
⑥富硒复合菌对断奶仔猪热休克蛋白Hsp70mRNA水平的影响
饲喂复合菌、亚硒酸钠和富硒复合菌后仔猪肝脏、肾脏、脾脏中热休克蛋白Hsp70mRNA水平的变化见图1。饲喂复合菌、亚硒酸钠和富硒复合菌42d后，均可使仔猪肝脏、肾脏和脾脏中热休克蛋白Hsp70mRNA水平显著降低（P<0.05）。在饲喂相同时间后，富硒复合菌组降低仔猪肝脏、肾脏和脾脏中热休克蛋白Hsp70mRNA水平的效果最好，且与复合菌组和亚硒酸钠组差异显（P<0.05）。结果表明，富硒复合菌可显著降低热应激条件下断奶仔猪肝脏、肾脏、脾脏热休克蛋白Hsp70mRNA水平。
⑦富硒复合菌对断奶仔猪热休克蛋白Hsp27mRNA水平的影响
饲喂复合菌、亚硒酸钠和富硒复合菌后仔猪肝脏、肾脏、脾脏中热休克蛋白Hsp27mRNA水平的变化见图2。饲喂复合菌、亚硒酸钠和富硒复合菌42d后，均可使仔猪肝脏、肾脏和脾脏中热休克蛋白Hsp27mRNA水平显著降低（P<0.05）。在饲喂相同时间后，富硒复合菌试验组降低仔猪肝脏、肾脏和脾脏中热休克蛋白Hsp27mRNA水平的效果最好，且与复合菌组和亚硒酸钠组差异显著（P<0.05）。结果表明，富硒复合菌可显著降低热应激条件下断奶仔猪肝脏、肾脏、脾脏热休克蛋白Hsp27mRNA水平。
通过本实施例，可见富硒复合菌可显著提高热应激条件下猪的平均日增重，降低料重比，提高GPX和SOD酶活性，降低MDA含量，增强仔猪抗氧化能力，降低热休克蛋白Hsp70和Hsp27mRNA水平。而且富硒复合菌抗热应激的效果显著优于单纯的亚硒酸钠或单纯的复合菌。表明富硒复合菌是抗猪热应激的优质生物饲料添加剂。
实施例2以江苏兴化某猪场48头80日龄育肥猪为实施对象
1.富硒复合菌饲料添加剂的生产
(1)菌种：
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)：购自中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌株代号为1.1878；
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus):购自中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌株代号为1.2471；
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：购自中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌株代号为2.2081。
(2)无机硒源：配制Se浓度为1mg/ml的亚硒酸钠溶液1000ml，115℃，高压蒸汽灭菌30min，备用。
(3)菌种的活化与种子液的获得：将保存在4℃的酿酒酵母接种于斜面培养基上，28℃，培养32h；如此连续活化4次后，再接种于0.5L种子培养基中，28℃，220r/min，摇床培养32h，得到酿酒酵母液体种子液A；将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化4次后，再接种于1L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜酸乳杆菌种子液B；将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化4次后，再接种于1L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜热链球菌液体种子液C。
(4)发酵：将生产培养基2kg葡萄糖、2kg酵母浸膏溶解在20L水中，然后加入到BIOTECH-BS/JS(150L)发酵罐中，加80L水补至100L，115℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，加入900ml亚硒酸钠（1mg/ml，以Se计）溶液；加入硒转化及益生菌生长促进剂：培养基中加入已灭菌的120g寡糖、1克蛋氨酸、1克丝氨酸、80g硫酸铵、20g磷酸氢二钾和20g磷酸二氢钾，充分搅拌均匀，然后接入菌种液A 0.5L、菌种液B 1L和菌种液C 1L；培养温度：30℃；通气量：0.05m3/h；转数：70r/min；罐压：0.04Mpa；发酵时间：36h；发酵结束，将富硒复合菌发酵液液分装入桶，4℃冷藏，备用。
上述发酵获得的富硒复合菌中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到3.63×109/mL、3.95×1010/mL和4.29×1010/mL；含硒量为8.6mg/L，其中有机硒含量为91.21％，硒蛋氨酸含量为75.45％。
2.富硒复合菌添加剂饲喂高温环境下80日龄育肥猪
(1)实施动物与分组
试验选用48头80日龄杜长大育肥猪（平均体重27.96±0.3kg），随机分为2组，每组3个重复，每个重复8头。1组为对照组饲以玉米豆粕型基础日粮（表9），基础日粮中测得硒含量为0.21mg·kg-1；2组为试验组在基础日粮中添加0.3mg·kg-1硒的富硒复合菌，试验组日粮中测得硒含量为0.53mg·kg-1。
表9育肥猪基础日粮组成和营养水平
注：每千克预混料成分含：VA 110万IR，VD322万IR，VE1100万IR，VK 180mg，VB2880mg，VB121.8mg，烟酸3600mg，叶酸60mg，锰Mn 30mg；碘I 0.3mg；硒Se 15mg；钴Co 0.5mg；铁Fe 5mg；铜Cu 7.5mg；锌Zn 6mg。
(2)日粮与饲养管理
试验采用玉米－豆粕型基础日粮，其营养组成除了硒之外，均按照NRC（1998）关于育肥猪所需营养标准并结合生产实践进行配制。将富硒复合菌按实验所需剂量添加到基础日粮中，配制成试验日粮，基础日粮作对照。
试验猪饲养在夏天自然高温环境下的猪舍，自由采食、饮水、每日喂料3次，每天记录猪舍温度，舍温26～39℃，其他管理按猪场常规管理进行。试验时间为2011年6月12日-7月30日，其中预试期7d，正式试验期42d，试验组与对照组分别饲喂试验日粮和基础日粮。
(3)样品采集与测定
在正式试验的第0d、14d、28d和42d分别从各组随机选取3头猪进行前腔静脉采血，抗凝和非抗凝，第42d抗凝血用于分离淋巴细胞，测定淋巴细胞转化率；非抗凝血斜放于37℃2h，后4℃过夜，离心分离血清，保存于-20℃用于测定白介素2（IL-2）的含量。
在正式试验第42d采血结束后每组随机选取3头猪屠宰。肝、肾、半个脾迅速分离并用冷的平衡盐溶液清洗，后液氮冷冻，保存于-70℃，用于检测Hsp70和Hsp27mRNA水平。另半个脾脏用于分离淋巴细胞，测定淋巴细胞转化率。
(4)测定指标及方法
①生长性能的测定
育肥猪在正式试验前分组时称个体体重，以后在第42d试验结束时称个体体重一次，记录体重和耗料量，计算各组的平均日增重、平均日采食量和料重比（耗料/增重）。
②猪脾脏淋巴细胞的分离
无菌摘取的脾脏，用75％的酒精浸泡后，使用D-hank’s液清洗，剥离脾脏周围的结缔组织和脂肪，剪成约1mm3大小，移至盛有D-hank’s液平皿中200目的纱布筛上，用无菌的注射器头轻轻挤压脾脏，使脾淋巴细胞进入D-hank’s液中，静置几分钟后吸取中间的悬液缓慢加入盛有淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心20min，弃上清，吸取中间层淋巴细胞至另一离心管中，加入5倍体积的D-hank’s液，1000r/min离心7min，重复洗涤两次，再用无血清RPMI-1640培养液洗涤一次，将细胞重悬于6ml RPMI-1640完全培养液，吹散细胞，台盼兰染色计数，细胞存活率在90％以上，可用于后续试验。
③猪血液淋巴细胞的分离
采集的抗凝血使用D-hank’s液1∶1（v/v）稀释，缓慢加入盛有淋巴细胞分离液的离心管中，之后分离步骤同上。
④MTT法测定淋巴细胞转化率
在96孔细胞培养板中，每孔加入细胞培养液100μl，使细胞数达到5×105个/孔。每孔加入2ug/ml抗猪CD3单抗(clone PPT3，Abcam)刺激剂后，使用RPMI-1640完全培养基将体积补至200μl，每个组5个重复。37℃、5％CO2培养箱中培养44h，培养结束后，于个孔中加20μlMTT（5mg/ml）溶液，37℃、5％CO2培养箱中继续培养4h，弃去培养基，加入200μl二甲基亚砜，于酶标仪450nm处测定OD值。
⑤血清中IL-2的测定
采用ELISA法测定血清中的细胞因子IL-2。试剂盒购自R&D Systems，具体操作步骤详见试剂盒。
⑥Hsp70和Hsp27mRNA水平分析
测定方法同实施例1。
(5)实施结果
①富硒复合菌对育肥猪生产性能的影响
试验期间育肥猪平均日增重、平均日采食量和料重比的测定结果见表10。由表10可知，与对照组相比，富硒复合菌组平均末重提高了7.75％，且显著高于对照组（P<0.05）；与对照组相比，富硒复合菌组日增重升高了12.55％，料重比下降了8.71％，且与对照组差异显著（P<0.05）。结果表明，日粮中添加富硒复合菌可显著提高热应激条件下育肥猪的日增重，降低料重比。
表10富硒复合菌在高温环境下对育肥猪生产性能的影响
注：同一列中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
②富硒复合菌对育肥猪淋巴细胞转化率的影响
育肥猪外周血液淋巴细胞转化率见图3A，脾脏淋巴细胞转化率见图3B。由图3可见，与对照组相比，富硒复合菌可显著提高淋巴细胞转化率（P<0.05），促进T淋巴细胞转化。结果表明，富硒复合菌可显著提高热应激条件下猪淋巴细胞转化率，增强猪的免疫功能。
③富硒复合菌对育肥猪血清IL-2含量的影响
试验期间育肥猪血清IL-2浓度的变化见表11。由表11可知，与对照组相比，富硒复合菌饲喂育肥猪14d、28d和42d后，均可显著提高育肥猪血清中IL-2浓度（P<0.05）。结果表明，富硒复合菌可显著提高热应激条件下猪血清IL-2含量，增强猪的免疫功能。
表11富硒复合菌在高温环境下对育肥猪血清中IL-2浓度的影响（pg/ml）
注：同一列中每一数值后标有不同小写字母者差异显著(P<0.05)。
④富硒复合菌对育肥猪Hsp70mRNA表达的影响
由图4可见，与对照组相比，饲料中添加含0.3mg·kg-1硒的富硒复合菌后，肝脏、肾脏和脾脏Hsp70mRNA水平显著下降（P<0.05）。结果表明，富硒复合菌可显著降低热应激条件下猪肝脏、肾脏和脾脏热休克蛋白Hsp70mRNA的表达。
⑤富硒复合菌对育肥猪Hsp27mRNA表达的影响
由图5可见，与对照组相比，饲料中添加含0.3mg·kg-1硒的富硒复合菌后，肝脏、肾脏和脾脏Hsp27mRNA水平显著下降（P<0.05）。说明富硒复合菌可显著降低热应激条件下猪肝脏、肾脏和脾脏热休克蛋白Hsp27mRNA的表达。
通过本实施例，可见富硒复合菌可显著提高热应激条件下猪生长性能，淋巴细胞转化率和IL-2含量，增强猪免疫功能，降低热应激引起的热休克蛋白Hsp70和Hsp27mRNA的表达，表明富硒复合菌可作为猪抗热应激的饲料添加剂。
本发明中涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)可以是任意来源的，只要是这三种细菌和酵母，均能够实现本发明的效果，并不局限于实施例1和2中的CGMCC来源。
Claims (5)
1.一种具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂在制备具有抗猪热应激作用的饲料中的应用；所述的富硒复合菌饲料添加剂通过如下方法制备得到：
将无机硒源加入生产培养基中，使培养基中硒浓度为4～10mg/L；按1∶2∶2的体积比将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种子液，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)种子液和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)种子液接种于添加了有机硒转化和复合菌生长促进剂的生产培养基中，总接种量为2％～5％，在发酵温度为20～40℃，通气量为0.05m3/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa的条件下发酵30～40h，获得富硒复合菌添加剂；所获得的富硒复合菌添加剂中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到109/mL、1010/mL和1010/mL；含硒量为4～10mg/L；其中有机硒含量在90％以上，硒蛋氨酸含量在75％以上；其中，
所述的无机硒源：配制含硒量为0.5～5mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
所述的生产培养基：0.5％～2％酵母膏，0～1％牛肉浸膏，0.5％～3％葡萄糖，pH自然；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
所述的有机硒转化和复合菌生长促进剂添加量为：每升生产培养基中加入1～5g寡糖、0.01～0.5g蛋氨酸、0.01～0.5g丝氨酸、0.1～2g硫酸铵、0.01～0.5g磷酸氢二钾和0.01～0.5g磷酸二氢钾。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于权利要求1所述的具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂按照以0.2-0.5mg/kg的硒水平添加到基础日粮中。
3.一种具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂，其特征在于所述的富硒复合菌饲料添加剂通过如下方法制备得到：
将无机硒源加入生产培养基中，使培养基中硒浓度为4～10mg/L；按1∶2∶2的体积比将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种子液，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)种子液和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)种子液接种于添加了有机硒转化和复合菌生长促进剂的生产培养基中，总接种量为2％～5％，在发酵温度为20～40℃，通气量为0.05m3/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa的条件下发酵30～40h，获得富硒复合菌添加剂；所获得的富硒复合菌添加剂中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到109/mL、1010/mL和1010/mL；含硒量为4～10mg/L；其中有机硒含量在90％以上，硒蛋氨酸含量在75％以上；其中，
所述的无机硒源：配制含硒量为0.5～5mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
所述的生产培养基：0.5％～2％酵母膏，0～1％牛肉浸膏，0.5％～3％葡萄糖，pH自然；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
所述的有机硒转化和复合菌生长促进剂添加量为：每升生产培养基中加入1～5g寡糖、0.01～0.5g蛋氨酸、0.01～0.5g丝氨酸、0.1～2g硫酸铵、0.01～0.5g磷酸氢二钾和0.01～0.5g磷酸二氢钾。
4.根据权利要求3所述的具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂，其特征在于所述的酿酒酵母种子液，嗜酸乳杆菌种子液和嗜热链球菌种子液分别通过如下方法获得：
1)将保存在4℃的酿酒酵母接种于斜面活化培养基上，20～30℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，20～30℃，220r/min，摇床培养30～40h，得到酿酒酵母种子液；
2)将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到嗜酸乳杆菌种子液；
3)将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，30～43℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～43℃，培养30～40h，得到嗜热链球菌液体种子液；
其中，所述的斜面活化培养基配方如下：
酿酒酵母活化培养基：酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，pH为5.5～6.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜酸乳杆菌活化培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温801ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO4 2g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜热链球菌活化培养基：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
所述的液体活化培养基：斜面活化培养基中不加琼脂。
5.权利要求3所述的具有抗猪热应激作用的富硒复合菌饲料添加剂的生产方法，其特征在于包括：
①菌种：酿酒酵母，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌，均为农业部允许使用的饲料级益生菌菌种；
②生产培养基：0.5％～2％酵母膏，0～1％牛肉浸膏，0.5％～3％葡萄糖，pH自然；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
③斜面活化培养基：
酿酒酵母活化培养基：酵母浸膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，pH为5.5～6.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜酸乳杆菌活化培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温801ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO4 2g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜热链球菌活化培养基：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
④液体活化培养基：斜面活化培养基中不加琼脂；
⑤无机硒源：配制含硒量为0.5～5mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
⑥菌种的活化与种子液的获得：将保存在4℃的酿酒酵母接种于斜面活化培养基上，20～30℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，20～30℃，220r/min，摇床培养30～40h，得到酿酒酵母种子液；将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到嗜酸乳杆菌种子液；将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，30～43℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～43℃，培养30～40h，得到嗜热链球菌液体种子液；
⑦发酵：将无机硒源加入生产培养基中，使培养基中硒浓度为4～10mg/L；按1∶2∶2的体积比将酿酒酵母种子液，嗜酸乳杆菌种子液和嗜热链球菌种子液接种于添加了有机硒转化和复合菌生长促进剂的生产培养基中，总接种量为2％～5％，在发酵温度为20～40℃，通气量为0.05m3/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa的条件下发酵30～40h，获得富硒复合菌添加剂；所获得的富硒复合菌添加剂中酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到109/mL、1010/mL和1010/mL；含硒量为4～10mg/L；其中有机硒含量在90％以上，硒蛋氨酸含量在75％以上；所述的有机硒转化和复合菌生长促进剂添加量为：每升生产培养基中加入1～5g寡糖、0.01～0.5g蛋氨酸、0.01～0.5g丝氨酸、0.1～2g硫酸铵、0.01～0.5g磷酸氢二钾和0.01～0.5g磷酸二氢钾。
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480049A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-04-01 | 天津农学院 | 一种提高肉鸡肌肉肉色的富硒乳酸菌制剂及其应用 |
| CN104542484A (zh) * | 2015-02-03 | 2015-04-29 | 何寒 | 一种富硒肉猪的饲养方法 |
| CN105104863A (zh) * | 2015-09-06 | 2015-12-02 | 来宝根 | 一种易于促进猪生长的猪饲料 |
| CN105166458A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-12-23 | 淮安正昌饲料有限公司 | 一种能够抗猪热应激的发酵型富硒植物性饲料添加剂 |
| CN105166459A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-12-23 | 淮安正昌饲料有限公司 | 一种猪饲料 |
| CN106119139A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-11-16 | 南京农业大学 | 一种富硒产谷胱甘肽复合菌及其制备方法和应用 |
| CN106912602A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-07-04 | 深圳市大百汇技术有限公司 | 一种多汁乳菇多糖的嗜酸乳杆菌发酵乳及其制备方法 |
| CN110235822A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-17 | 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 | 活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法 |
| CN110236005A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-09-17 | 南京农业大学 | 一种用于调节仔猪断奶应激诱发的免疫抑制的复合菌及其制备方法和应用 |
| CN113481110A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-10-08 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种玉木耳富硒培养物的制作方法和用途 |
| CN114794303A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-29 | 吉林省农业科学院 | 一种富硒胶红酵母、富硒胶红酵母饲料添加剂及其制备方法和应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1144615A (zh) * | 1994-06-21 | 1997-03-12 | 太原康强生物技术开发公司 | 利用微生物生产的动物饲料添加剂及其生产方法 |
| CN1615730A (zh) * | 2004-12-09 | 2005-05-18 | 上海交通大学 | 猪双低菜籽粕复合饲料添加剂 |
| CN1709133A (zh) * | 2005-07-12 | 2005-12-21 | 南京农业大学 | 富硒益生菌饲料添加剂的生产方法及其产品 |
| CN101253994A (zh) * | 2008-04-08 | 2008-09-03 | 南京农业大学 | 一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂 |
| CN102172265A (zh) * | 2011-04-02 | 2011-09-07 | 湖南广安生物技术股份有限公司 | 一种提高生长育肥猪抗应激能力和肉色肉质的饲料添加剂及应用 |
| CN102370102A (zh) * | 2011-10-11 | 2012-03-14 | 河南普爱饲料股份有限公司 | 一种乳猪配合饲料及其生产方法 |
-
2012
- 2012-09-11 CN CN 201210333510 patent/CN102823772B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1144615A (zh) * | 1994-06-21 | 1997-03-12 | 太原康强生物技术开发公司 | 利用微生物生产的动物饲料添加剂及其生产方法 |
| CN1615730A (zh) * | 2004-12-09 | 2005-05-18 | 上海交通大学 | 猪双低菜籽粕复合饲料添加剂 |
| CN1709133A (zh) * | 2005-07-12 | 2005-12-21 | 南京农业大学 | 富硒益生菌饲料添加剂的生产方法及其产品 |
| CN101253994A (zh) * | 2008-04-08 | 2008-09-03 | 南京农业大学 | 一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂 |
| CN102172265A (zh) * | 2011-04-02 | 2011-09-07 | 湖南广安生物技术股份有限公司 | 一种提高生长育肥猪抗应激能力和肉色肉质的饲料添加剂及应用 |
| CN102370102A (zh) * | 2011-10-11 | 2012-03-14 | 河南普爱饲料股份有限公司 | 一种乳猪配合饲料及其生产方法 |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480049B (zh) * | 2014-12-25 | 2017-12-22 | 天津农学院 | 一种提高肉鸡肌肉肉色的富硒乳酸菌制剂及其应用 |
| CN104480049A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-04-01 | 天津农学院 | 一种提高肉鸡肌肉肉色的富硒乳酸菌制剂及其应用 |
| CN104542484A (zh) * | 2015-02-03 | 2015-04-29 | 何寒 | 一种富硒肉猪的饲养方法 |
| CN105166458A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-12-23 | 淮安正昌饲料有限公司 | 一种能够抗猪热应激的发酵型富硒植物性饲料添加剂 |
| CN105166459A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-12-23 | 淮安正昌饲料有限公司 | 一种猪饲料 |
| CN105104863A (zh) * | 2015-09-06 | 2015-12-02 | 来宝根 | 一种易于促进猪生长的猪饲料 |
| CN106119139A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-11-16 | 南京农业大学 | 一种富硒产谷胱甘肽复合菌及其制备方法和应用 |
| CN106912602A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-07-04 | 深圳市大百汇技术有限公司 | 一种多汁乳菇多糖的嗜酸乳杆菌发酵乳及其制备方法 |
| CN106912602B (zh) * | 2017-01-24 | 2020-10-02 | 深圳市大百汇技术有限公司 | 一种多汁乳菇多糖的嗜酸乳杆菌发酵乳及其制备方法 |
| CN110236005B (zh) * | 2019-04-02 | 2023-11-21 | 南京农业大学 | 一种用于调节仔猪断奶应激诱发的免疫抑制的复合菌及其制备方法和应用 |
| CN110236005A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-09-17 | 南京农业大学 | 一种用于调节仔猪断奶应激诱发的免疫抑制的复合菌及其制备方法和应用 |
| CN110235822A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-17 | 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 | 活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法 |
| CN110235822B (zh) * | 2019-07-10 | 2021-11-26 | 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 | 活体水产品抗应激剂及其生产方法以及使用方法 |
| CN113481110B (zh) * | 2021-08-23 | 2023-04-11 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种玉木耳富硒培养物的制作方法和用途 |
| CN113481110A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-10-08 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种玉木耳富硒培养物的制作方法和用途 |
| CN114794303A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-07-29 | 吉林省农业科学院 | 一种富硒胶红酵母、富硒胶红酵母饲料添加剂及其制备方法和应用 |
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