CN101253994A - 一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富含有机硒和有机锌的益生菌制剂，属于食品工程和添加剂领域。以产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌作为菌种，按1∶2∶2∶2的比例混合接种于添加亚硒酸钠、硫酸锌和有机硒锌转化及益生菌生长促进剂的适宜培养基中，培养，真空冷冻干燥，得到一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌产品。产品中CFU数分别达108/g、109/g、108/g和108/g以上，有机硒含量为50～150μg/g，有机锌含量为2.5～7.5mg/g。该产品具有有机硒、有机锌和益生菌的三重功效，能调节肠道菌群，拮抗病原微生物，增进食欲，有利于正常生长发育，提高机体免疫力和抗病力，降低血脂，延缓衰老，是一种安全、无残留、效价高的新型保健食品和添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种简单的生产富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂，属于食品工程和饲料添加剂生产领域。
背景技术
硒和锌是人和动物所必需的微量元素，是一种多功能的生命营养元素。研究表明，硒具有抗氧化，提高机体免疫力，抗病能力，调节机体代谢，提高繁育机能，抗肿瘤，防治地方病，延缓衰老，拮抗有毒元素等多中功能；锌具有促进正常生长发育，提高免疫力，提高繁育机能，促进骨骼生长，促进食欲，参与基因遗传，参与维持皮肤和黏膜的正常结构和功能等多种功能。
硒和锌一般通过日常饮食进入机体内，食品中微量元素硒和锌缺乏或者食品结构不合理都会引起人体缺乏微量元素硒和锌，而我国食品中的硒和锌多从土壤中获得，因此人体硒锌状况与土壤中硒和锌含量密切相关。调查表明，我国有72％的国土面积存在着硒缺乏，有40％的土壤存在着锌的缺乏，许多地区都处在低硒和低锌的水平线上，许多存在缺乏硒和锌的人和动物都处在亚临床状态，虽然其外表不表现临床症状，但是他们的生长发育缓慢、免疫力低下和智力低下等。为了在食品中强化硒和锌，防治缺硒和缺锌症状的发生，人们开发了多种硒和锌营养补充剂。大量研究表明，有机硒和有机锌的生物利用率高于无机硒和无机锌，且毒性较小，适口性好。生物有机化是获得有机营养元素的简便而经济的途径，有利于实际生产中大量应用。硒和锌的生物有机化主要是在植物和微生物体内进行的。研究表明，在人和动物体内，大部分的硒是以含硒蛋白及硒酶的生物活性形式发挥作用的，硒在这些蛋白质及硒酶的氨基酸中取代硫的位置，形成硒蛋氨酸、硒胱氨酸、硒半胱氨酸等；而大部分的锌是以酶或有机分子配基的形式发挥着生理作用的，锌能与氨基酸形成氨基酸络合锌。通过生物转化获得的有机硒和有机锌因与其在人和动物体内的存在形式相同或相近，所以吸收利用率更高。
益生菌(probiotics)，又名促生素、生菌剂、原生菌、微生态制剂、活菌制剂，是指“当摄入一定量时能对宿主的健康有作用的微生物活体”。益生菌主要包括乳酸菌类、双歧杆菌类、芽孢杆菌类、光合细菌类和酵母类等。
由于机体衰老、环境污染、饮食改变、滥用抗生素、放化疗等原因，往往会造成人和动物体内肠道内有益菌数量下降，导致肠道微生态失调，引起菌群易位，诱发内源感染，造成机体病变，通过外源补充益生菌，可维持肠道菌群平衡，提高机体免疫力，控制血清胆固醇，预防心血管疾病，抗肿瘤，延缓衰老从而促进健康。
利用生物转化法，在益生菌生长过程中，益生菌将无机态的硒锌转变成有机态的硒锌，得到一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂，可以同时发挥有机硒、有机锌和益生菌的三重功效，这显然能更好的改善机体的内生环境，拮抗病原微生物，增强机体的免疫力，抵抗肿瘤、预防疾病。因此富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂作为安全、多功能的保健食品和饲料添加剂必将在食品、医药和添加剂等领域发挥巨大作用。
发明内容
技术问题：本发明涉及一种简单、低成本生产富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂，该产品能同时发挥有机硒、有机锌和益生菌的三重功效。生产方法：在培养基中同时添加无机硒源和无机锌源，并加入有机硒锌转化促进剂，其中的多种益生菌将无机态的硒和锌转变成有机态的硒和锌，培养物在低温下冷冻干燥，得到一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂。
技术方案：
具体生产方法包括以下步骤：
1)菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，均为卫生部允许使用的益生菌菌种；
2)菌剂生产培养基质量比：0.5％～2％葡萄糖，0.5％～2％酵母浸膏，0～1％牛肉浸膏，pH自然；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
3)斜面活化培养基质量比：
产朊假丝酵母活化培养基(YPD培养基)：5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、1000ml水，pH为6.6～7.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌活化培养基(MRS培养基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO42g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜热链球菌活化培养基(改良M17培养基)：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min.，备用；
3)液体活化培养基质量比：斜面活化培养基中不加琼脂；
4)无机硒源：配制含硒量为0.2～2mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
5)无机锌源：配制含锌量为10～100mg/ml的硫酸锌溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌30min，备用；
6)有机硒和有机锌转化及益生菌生长促进剂：按每升水中含有50g寡糖、0.5g蛋氨酸、50g硫酸铵、10g磷酸氢二钾和10g磷酸二氢钾配制成混合溶液，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
7)菌种的活化与种子液的获得：将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于斜面活化培养基上，20～30℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，20～30℃，220r/min，摇床培养30～40h，得到产朊假丝酵母液体种子液(菌种液A)；将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到嗜酸乳杆菌种子液(菌种液B)；将保存在4℃的鼠李糖乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到鼠李糖乳杆菌液体种子液(菌种液C)；将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，30～43℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～43℃，培养30～40h，得到嗜热链球菌液体种子液(菌种液D)；
8)生产：将无机硒源、无机锌源和2％～5％的硒锌转化及益生菌生长促进剂加入菌剂生产培养基中，使培养基中硒浓度为2～4mg/kg；锌浓度为100～200mg/kg；将产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌种子液接种比例按1∶2∶2∶2接种于菌剂生产培养基中，总接种量为3％～7％；培养温度：20～40℃；通气量：0.05m3/h；转数：70r/min；罐压：0.04Mpa；培养时间：24～48h；
9)产品的获得：培养结束后，培养液在低温下3000r/min离心20min，得到菌泥，向菌泥中加入保护剂(脱脂奶粉和蔗糖)，真空冷冻干燥，得到富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂。
上述获得的富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂中，产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到108/g、109/g、108/g和108/g，硒含量为0.05～0.15mg/g，锌含量为2.5～7.5mg/g。
有益效果本发明利用益生菌可将无机态的硒锌转化成有机态的硒锌的原理，生产出富含有机硒和有机锌的复合益生菌产品，能同时发挥有机硒、有机锌和益生菌的三重功效，改善人体内生态环境，拮抗病原微生物，调节维生素的吸收与消耗，增强免疫力和抗病力，提高繁育能力，抗肿瘤，抗自由基，延缓衰老，拮抗有毒元素，都发挥着及为重要的作用，是一种安全，无残留、效价高的新型保健食品和添加剂。
具体实施方式
实施例1
(1)菌种：
产朊假丝酵母(Candida utilis)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为AS2.1180。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为AS1.1878。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为1.552。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为1.2471。
(2)菌种的活化与种子液的获得
斜面活化培养基质量比：产朊假丝酵母活化培养基(YPD培养基)：5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、1000ml水，pH为6.6～7.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌活化培养基(MRS培养基)：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO4 2g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；嗜热链球菌活化培养基(改良M17培养基)：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min.，备用；液体活化培养基为斜面活化培养基中不加琼脂。
将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于斜面活化培养基上，28℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于0.5液体活化培养基中，28℃，220r/min，摇床培养32h，得到产朊假丝酵母液体种子液，CFU为4.52×109/ml(菌种液A)。
将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于1L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜酸乳杆菌种子液，CFU为8.32×1010/ml(菌种液B)。
将保存在4℃的鼠李糖乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于1L液体活化培养基中，30℃，培养32h，得到鼠李糖乳杆菌液体种子液，CFU为2.17×109/ml(菌种液C)。
将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于1L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜热链球菌液体种子液，CFU为3.25×109/ml(菌种液D)；
(3)发酵所需配料：2kg葡萄糖，2kg酵母浸膏，0.84g Na2SeO3·5H2O，54.95g ZnSO4·7H2O，100g寡糖、1g蛋氨酸、100g硫酸铵、20g磷酸氢二钾和20g磷酸二氢钾。
(a)制备无机硒源：配制Se浓度为0.5mg/ml的Na2SeO3溶液0.5L，121℃，高压蒸汽灭菌30min，备用。
(b)制备无机锌源：配制Zn浓度为25mg/ml的ZnSO4溶液0.5L，121℃，高压蒸汽灭菌30min，备用。
(c)制备硒锌转化及益生菌生长促进剂：按每升水中含有50g寡糖、0.5g蛋氨酸、50g硫酸铵、10g磷酸氢二钾和10g磷酸二氢钾配制成混合溶液，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用。
(4)生产：
将菌剂生产培养基2kg葡萄糖、2kg酵母浸膏溶解在100L水中，然后加入到BIOTECH-BS/JS(150L)发酵罐中，115℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，加入含硒量为0.5mg/ml的Na2SeO3溶液0.5L、含锌量为25mg/ml的ZnSO4溶液0.5L和硒锌转化及益生菌生长促进剂2L，充分搅拌均匀，然后接入菌种液A 0.5L、菌种液B 1L、菌种液C 1L和菌种液D 1L，温度：34℃，通气量：0.05m3/h，转数：70r/min，罐压：0.04Mpa，培养时间：36h，培养结束后，培养液在低温下3000r/min离心20min，得到菌泥，向菌泥中加入保护剂(保护剂为2kg脱脂奶粉和10g蔗糖的混合物)，然后真空冷冻干燥，得到富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂。
上述获得的富含有机硒和有机锌复合益生菌制剂中，产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到4.21×108/g、3.86×109/g、4.59×108/g和5.78×108/g，复合益生菌制剂的量为2594.12g，有机硒含量为87.92μg/g，有机锌含量为3.87mg/g。
实施例2
(1)菌种：
产朊假丝酵母(Candida utilis)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为AS2.1180。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为AS1.1878。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为1.552。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保存中心，菌株代号为1.2471。
(2)菌种的活化与种子液的获得
将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于斜面活化培养基上，28℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于1L液体活化培养基中，28℃，220r/min，摇床培养32h，得到产朊假丝酵母液体种子液，CFU为3.18×109/ml(菌种液A)。
将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于2L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜酸乳杆菌种子液，CFU为6.57×1010/ml(菌种液B)。
将保存在4℃的鼠李糖乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于2L液体活化培养基中，30℃，培养32h，得到鼠李糖乳杆菌液体种子液，CFU为1.19×109/ml(菌种液C)。
将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3～5次后，再接种于2L液体活化培养基中，37℃，培养32h，得到嗜热链球菌液体种子液，CFU为2.02×109/ml(菌种液D)；
(3)发酵所需配料：2kg葡萄糖，1kg牛肉浸膏，1kg酵母浸膏，1.34g Na2SeO3·5H2O，87.92gZnSO4·7H2O，200g寡糖、2g蛋氨酸、200g硫酸铵、40g磷酸氢二钾和40g磷酸二氢钾.
(a)制备无机硒源：配制Se浓度为0.8mg/ml的亚硒酸钠溶液0.5L，121℃，高压蒸汽灭菌30min，备用。
(b)制备无机锌源：配制Zn浓度为40mg/ml的硫酸锌溶液0.5L，121℃，高压蒸汽灭菌30min，备用。
(c)制备硒锌转化及益生菌生长促进剂：按每升水中含有50g寡糖、0.5g蛋氨酸、50g硫酸铵、10g磷酸氢二钾和10g磷酸二氢钾配制成混合溶液，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
(4)生产：
将菌剂生产培养基2kg葡萄糖、1kg酵母浸膏和1kg牛肉浸膏溶解在100L水中，然后加入到BIOTECH-BS/JS(150L)发酵罐中，115℃，高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，加入含硒量为0.8mg/ml的亚硒酸钠溶液0.5L、含锌量为40mg/ml的硫酸锌溶液0.5L和硒锌转化及益生菌生长促进剂4L，充分搅拌均匀，然后接入菌种液A 1L、菌种液B 2L、菌种液C 2L和菌种液D 2L，温度：34℃，通气量：0.05m3/h，转数：70r/min，罐压：0.04Mpa，培养时间：40h，培养结束后，培养液在室温下(20℃)3000r/min离心20min，得到菌泥，向菌泥中加入保护剂(保护剂为2kg脱脂奶粉和10g蔗糖的混合物)然后真空冷冻干燥，得到富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂。
上述获得的富含有机硒和有机锌复合益生菌制剂中，产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的CFU分别达到2.56×108/g、1.89×109/g、2.17×108/g和2.89×108/g，复合益生菌的量为2514.26g，有机硒含量为146.76μg/g，有机锌含量为6.18mg/g。
Claims (3)
1.一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂，其特征在于，该制剂是由以下方法生产而成的：
1)菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)；
2)菌剂生产培养基质量比：0.5％～2％葡萄糖，0.5％～2％酵母浸膏，0～1％牛肉浸膏，pH自然，100～120℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
3)斜面活化培养基：
产朊假丝酵母活化培养基：5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、1000ml水，pH为6.6～7.0，115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌活化培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温801ml，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.05g，K2HPO4 2g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.2～6.4；115℃，高压蒸汽灭菌15min，备用；
嗜热链球菌活化培养基：胰蛋白胨5g，鱼蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，甘油10g，乳糖3g，磷酸氢二钾5g，琼脂20g，水1000ml，pH为6.7～7.1，115℃，高压蒸汽灭菌15min.，备用；
4)液体活化培养基：斜面活化培养基中不加琼脂；
5)无机硒源：配制含硒量0.2～2mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌20～30min，备用；
6)无机锌源：配制含锌量10～100mg/ml的硫酸锌溶液，100～125℃，高压蒸汽灭菌20～30min，备用；
7)硒锌转化及益生菌生长促进剂配制：按每升水中含有50g寡糖、0.5g蛋氨酸、50g硫酸铵、10g磷酸氢二钾和10g磷酸二氢钾配制成混合溶液，115℃，高压蒸汽灭菌15min；
8)菌种的活化与种子液的获得
将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于斜面活化培养基上，20～30℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，20～30℃，220r/min，摇床培养30～40h，得到产朊假丝酵母液体种子液，其CFU达到109/ml以上；
将保存在4℃的嗜酸乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到嗜酸乳杆菌液体种子液，其CFU达到1010/ml以上；
将保存在4℃的鼠李糖乳杆菌接种于斜面活化培养基上，30～40℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～40℃，培养30～40h，得到鼠李糖乳杆菌液体种子液，其CFU达到109/ml以上；
将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，30～43℃，培养30～40h；如此连续活化3～5次后，再接种于液体活化培养基中，30～43℃，培养30～40h，得到嗜热链球菌液体种子液，其CFU达到109/ml以上；
9)菌剂生产
将无机硒源、无机锌源和硒锌转化及益生菌生长促进剂加入到菌剂生产培养基中，使培养基中硒浓度为2～4mg/kg，锌的浓度为100～200mg/kg，硒锌转化及益生菌生长促进剂的质量比浓度为2％～5％；将产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌种子液接种体积比例按1∶2∶2∶2接种于培养基中，总接种量体积比为3～7％，培养温度为20～40℃，通气量为：0.05m3/h；摇床转速：70r/min，罐压：0.04Mpa，培养时间24～48h；
10)产品获得：培养结束后，培养液在室温下3000r/min离心20min，得到菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥，即得到一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌产品。
2、根据权利要求1所述一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂，其特征在于，加入保护剂为2kg脱脂奶粉和10g蔗糖的混合物。
3、根据权利要求1或2所述一种富含有机硒和有机锌的复合益生菌制剂，其特征在于，
该产品中产朊假丝酵母、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的CFU数分别为108/g、109/g、108/g和108/g以上，有机硒含量为50～150μg/g，有机锌含量为2.5～7.5mg/g。
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