CN106046189A - 南瓜多糖的提取与纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了南瓜多糖的提取与纯化方法，提取纯化过程包括，将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，低温冷冻后采用超声辅助提取南瓜多糖得到南瓜多糖提取液；在南瓜多糖提取液中加入聚乙二醇和硫酸铵进行萃取，充分搅拌使其均匀后，静置待其分相完全，离心分离，溶液形成两相，在上相中加入无水乙醇，沉淀出南瓜多糖。本发明方法优点：超声波用于南瓜多糖的提取具有省时、高效、节能等优点。在水溶液中进行萃取，不会引起生物活性物质是失活或变性。本方法的南瓜多糖的收率可达60.58‑62.82％。分相时间短，自然分相时间一般为5min‑15min；不存在有机物残留问题，易于工程放大和连续操作。

Description

南瓜多糖的提取与纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及南瓜多糖及其提取与纯化方法。

背景技术

南瓜又称番瓜、倭瓜、金瓜等，系葫芦科南瓜属一年生蔓性草本植物，是重要药食两用植物之一。南瓜营养丰富，不仅含有甘露醇，多种氨基酸，维生素C、E及微量元素Fe、Se、Zn、Mn等，还含有大量生物碱、南瓜子碱、果胶等活性成分。

南瓜多糖是一种非特异性免疫增强剂，能提高机体的免疫功能，促进细胞因子生成，通过活化补体等途径对免疫系统发挥多方面的调节功能。南瓜多糖呈棕色粉末，是南瓜活性成分中最重要、最具潜力功能因子之一。不仅具有复杂、多方面生物活性，作为广谱免疫促进剂，且具有免疫调节，抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质生物合成，控制细胞分裂、分化，调节细胞生长、衰老等作用。因此，对南瓜多糖分离提取，日益引起人们重视。

现有技术中南瓜多糖的提取与纯化方法很多，如水提醇沉法、碱液提取法、超声波提取法、微波辅助提取法、酶提取法等等。提取方法的研究现状：

1水提醇沉法，提醇沉法是通过在天然产物的浓缩的水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，利用南瓜多糖溶于水而不溶于高浓度的乙醇的性质，使其生成沉淀而与其他水溶性的杂质分离的方法。水提醇沉法提取南瓜多糖的工艺，工艺流程如下：市购南瓜洗净、去皮切丁并配水榨汁→加热浸提→过滤→提取液→浓缩→乙醇沉淀→南瓜粗多糖。通过四因素三水平正交试验法优选，研究发现南瓜多糖提取的最优条件为：南瓜丁的质量与水的体积比为1(g):5(ml)，90℃条件下浸提2h，浓缩水浸提液与乙醇的体积比为1:4，南瓜粗多糖提取率为1.5％左右，纯度可达到21.02％。

2碱液提取法 由于D-葡萄糖醛酸的存在，南瓜多糖为酸性多糖，故可采用稀碱液如氢氧化钠、氢氧化钾等来提取。由于稀碱液有助于解除植物细胞壁分子间的化学和物理作用，故可增加南瓜多糖的提取率。利用氢氧化钠溶液提取南瓜多糖的工艺，实验表明：随着碱液浓度的升高，多糖的提取率增加，当达到0.3mol/L之后，碱液浓度的升高对提取率无显著影响，而且由于碱性条件下，其中的还原糖会分解成分子量更小的色素分子，从而使的产品的色泽加深。经过正交实验，确定了碱提法的最佳生产工艺：80℃的条件下提取，提取时间为2h，综合考虑时间对提取率的影响和生产周期因素，可以缩短为1h，液固比为5:1，氢氧化钠的浓度为0.4mol/L。

3超声波提取法 超声波是频率大于20KHz以上的声波，具有频率高、波长短、功率大、穿透力强等特点。它在液体介质中传播时，能产生空化作用及一系列特殊效应具有搅拌、分散成雾、凝聚、冲击破碎和加热等作用。超声波提取是利用超声波具有的空化效应、机械效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增强介质的穿透力以提取天然产物有效成分的方法。

利用超声波提取南瓜多糖的方法。赵二劳等使用KQ-100DB型数控超声波清洗器(超声波频率为40kHz)，研究了预浸时间、超声功率、提取温度、时间以及占空比对南瓜多糖提取率的影响水平：以水为提取溶剂，经过10min预浸后,在60℃的提取温度下，用功率为80W、占空比为1的超声波作用20min,样品中南瓜多糖的提取率最高可达4.26％。

4微波辅助提取法 微波辅助提取指在天然产物有效成分提取过程中加入微波场，利用微波场的特点来强化有效成分浸出的新型提取技术。微波可导致天然产物细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能产生大量的热量，胞内温度迅速上升，从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力，结果细胞破裂，有效成分自由流出并溶解于提取介质中，通过进一步的过滤和分离，即可获得所需的提取物。

5复合酶提取法 酶提取法的原理是利用酶反应的高度专一性，将天然产物细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等大分子物质水解或降解，破坏细胞壁，加快有效成分溶出细胞的速度，从而提高有效成分的提取率。采用酶法提取天然产物有效成分，反应条件温和，是一种较为先进有效的提取方法。使用纤维素酶(1％)、果胶酶(1.5％)和木瓜蛋白酶(1％)组成的复合酶，在pH为5.5、温度为40℃的条件下提取30min，南瓜多糖的粗产率可高达28.8％左右。利用微波协同酶法来提取南瓜多糖，先利用1.0％纤维素酶和1.5％果胶酶组成的复合酶，在磷酸氢二钠-柠檬酸组成的pH＝5.5的缓冲溶液中，于40℃水浴中振荡30min，然后将酶解后的多糖提取液用功率为500W的微波，在料液比为1g:30 mL、温度为60℃条件下微波加热3min，可达到11.9％的粗提取率。

我国南瓜资源丰富，价廉易得，从南瓜中提取具有降糖等生物活性的南瓜多糖具有广阔的应用前景。就提取工艺来说，水提醇沉法耗时长，且提取率偏低，碱提法虽然在一定程度上提高了提取率，但使得产品质量下降，超声波法和微波辅助法耗时短、提取率亦得到了大幅度的提高，但是由于条件限制，很难用于工业生产。目前最基础的工作便是要改进提取工艺，找到一条简单、价廉、提取率和纯度高的工艺流程。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了南瓜多糖的提取与纯化方法。

本发明的技术方案是：南瓜多糖的提取与纯化方法，将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，低温冷冻后采用超声辅助提取南瓜多糖得到南瓜多糖提取液；在南瓜多糖提取液中加入聚乙二醇和硫酸铵进行萃取，充分搅拌使其均匀后，静置待其分相完全，离心分离，溶液形成两相，南瓜多糖主要富集在上相中，分离出上相，在上相中加入无水乙醇，沉淀出多糖，经过滤、烘干后得到纯化的南瓜多糖。

本发明的进一步改进包括：

所述的低温冷冻是在-18℃环境下冷冻3小时。

所述超声辅助提取的提取温度60℃，超声功率200W，提取时间30min，料液比1:30。

在提取液内加入聚乙二醇，使其的浓度为21.33-24.00％；在提取液内加入硫酸铵，使其的浓度为14.00％。

南瓜样品经冷冻处理后,以水为提取液。

将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，在-18℃环境下冷冻3小时后采用超声辅助提取南瓜多糖，提取温度60℃，超声功率200W，提取时间30min，料液比1:30；在南瓜多糖提取液中加入PEG4000和硫酸铵进行萃取，使PEG4000浓度为21.33-24.00％，硫酸铵浓度为14.00％，充分搅拌使其均匀后，静置待其分相完全，以4000r/min的转速离心5min，溶液形成两相，南瓜多糖主要富集在上相中，分离出上相，在上相中加入无水乙醇，使其浓度达到80％，沉淀出多糖，经过滤、烘干后得到纯化的南瓜多糖。

本发明的另一目的在于提供了按照上述方法制得的纯化后的南瓜多糖。

本发明方法优点：传统的索氏提取相比,超声波用于南瓜多糖的提取具有省时、高效、节能等优点。在水溶液中进行萃取，不会引起多糖活性物质失活或变性。本方法的南瓜多糖的收率可达60.58-62.82％。分相时间短，自然分相时间一般为5min-15min；不存在有机物残留问题；大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更加经济；易于工程放大和连续操作。

附图说明

图1是不同冷冻温度下南瓜粗多糖的提取率柱状图。

图2分配系数K上下相的体积比R和收率Y和PEG分子量的关系。

图3分配系数K上下相的体积比R和收率Y和硫酸铵浓度的关系。

图4分配系数K上下相的体积比R和收率Y和PEG浓度的关系。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

1.南瓜样品的处理和提取条件的确定：将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，低温冷冻3小时后采用超声辅助提取，提取温度60℃，超声功率200W，提取时间30min，料液比1:30。

1.1冷冻温度对南瓜多糖提取率的影响

不同冷冻温度条件下南瓜多糖的提取率见图1。由图1可知,冷冻处理后的南瓜多糖提取率远高于室温(18℃)贮存的南瓜多糖提取率,并且随着冷冻温度的降低,南瓜多糖的提取率呈上升趋势,但在冷冻温度降至-16℃以后,南瓜多糖的提取率增加趋势不明显,在-18℃与-20℃的条件下,提取率仅相差了0.01％。这说明快速冷却有利于南瓜多糖的提取,提高冷冻速率可以使植物细胞内水分快速结冰膨胀,从而破坏细胞壁和细胞组织,有利于细胞内生物质的释放,但冷冻速率到达一定值后,不会加速细胞内冰晶的形成,而且因南瓜多糖含量一定,所以多糖提取率不是线性增加。

1.2超声辅助提取条件的选择

准确称取相同质量的南瓜样品，经冷冻处理后,以水为提取液,分别在不同的超声波功率、提取时间、提取温度和料液比下进行超声波提取。将提取液过滤,收集滤液,加入无水乙醇(使乙醇浓度达到80％)静置,沉淀多糖。对沉淀用乙醇洗涤多次,晾干用蒸馏水将沉淀溶解,定容。然后准确吸取一定量处理后的提取液,测定吸光度。考察超声波功率、提取时间、提取温度、料液比对提取结果的影响。

1.2.1提取时间对南瓜多糖的提取影响

在料液比(g:mL)为1:25,超声波功率200W,温度50℃的条件下,考察提取时间对南瓜多糖提取的影响。结果见表1

表1提取时间对南瓜多糖的提取影响

从表1可以看出在10到30分钟内，由于超声波作用，吸光度也随时间的增加而增加；在30分钟以后，当时间延长时,吸光度反而下降,这可能是由于超声波的机械剪切作用,长时间加热使大分子多糖断裂,在后处理中损失。所以选择提取时间为30min。

1.2.2料液比的影响

在超声波功率为200W,温度50℃,提取时间30min的条件下,考察料液比对南瓜多糖提取的影响,结果见表2。

表2料液比对南瓜多糖提取的影响

结果表明,当料液比≥1:30时吸光度变化不大。所以选择料液比(g:mL)为1:30。

1.2.3超声波功率的影响

在温度为50℃,提取时间30min,料液比(g:mL)1:30的条件下,考察超声波功率对提取的影响,结果见表3.

表3超声波功率对南瓜多糖提取的影响

由表3可见,随着超声波功率的增加,吸光度逐渐增大,但超声波功率大于200W后,吸光度增加很少,考虑到经济性和超声波功率过高可能使多糖降解,降低多糖活性,选择超声波功率为200W。

1.2.4不同温度的影响

在超声波功率为200W,提取时间30min,料液比1:30(g:mL)的条件下,考察温度对南瓜多糖提取的影响,结果见表4。

表4提取的温度对南瓜多糖的吸光度的影响

结果表明,随着温度升高,吸光度逐渐增加。但温度过高,蛋白质等杂质的提出也将增加,会对后续处理带来不便,同时考虑经济性,选择温度为60℃。

南瓜多糖最佳提取条件为时间30min,料液比(g:mL)1:30,超声波功率200W,温度60℃。

2.PEG/(NH₄)₂SO₄双水相体系萃取南瓜多糖条件的确定

2.1双水相体系的配制

双水相体系按体积配制，系统总量为20mL，称取一定质量的聚乙二醇置于50mL离心试管中，然后加入一定量的硫酸铵，最后加入南瓜多糖提取液至20mL。振荡2min，静置待溶液分相完全，在离心机中以4000r/min的转速离心5min，分相后测定上、下相的体积，分别取样分析上下相中南瓜多糖的含量。

有关的计算公式如下。

K＝Ct/Cb

R＝Vt/Vb

Y＝1/(1+1/R×K)

注：K为多糖在双水相体系分配系数；R为双水相体系上下相的体积比；Y为多糖在上相中的收率；Vt为双水相体系上相体积，单位mL；Vb为双水相体系下相积，单位mL；Ct为双水相系统上相多糖的质量浓度，单位mg/mL；Cb为双水相系统下相多糖的质量浓度单位，mg/mL。

2.2多糖含量的测定方法

利用苯酚-硫酸法测多糖。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再用分光光度计比色测定。以葡萄糖为标准样品，采用可见光分光光度计在490nm下测吸光度值做标准曲线。

制作葡萄糖标准曲线：准确称取葡萄糖0.0200g用蒸馏水溶解，然后定容至500mL。首先取10支试管，分别编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10取定容好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL于2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，10号为对照组(蒸馏水)。其次在每支试管中分别加蒸馏水至1mL，摇匀，再在每支试管中加入事先配制好的5％苯酚1mL，然后立即加入5mL浓硫酸，摇匀。静置30min后，在490nm处测其吸光值。

2.3利用PEG/(NH₄)₂SO₄双水相体系萃取南瓜多糖的方法

先称取一定量的聚乙二醇和硫酸铵置于50mL离心管中，再加入南瓜多糖提取液定容20mL，每次称取聚乙二醇和硫酸铵的量由试验设计要求而定。搅拌使其溶解。充分摇匀后，静置待其分相完全，以4000r/min的转速离心5min。溶液形成两相，用分液漏斗分相并测定上、下相的体积后。从上、下相中各取1mL到试管中，再加9mL水稀释。再从稀释液中取1mL加1mL5％苯酚和5mL浓硫酸，充分摇匀，静置30min后用722可见分光光度计在490nm下测吸光度值。对照组是用蒸馏水代替南瓜多糖提取液。

2.4单因素对南瓜多糖分配系数和收率的影响

2.4.1聚合物(PEG)分子量对多糖分配系数和收率的影响

分别取6支离心管，3支试验组，3支对照组，按表5加入南瓜多糖提取液和药品，对照组用蒸馏水代替南瓜多糖提取液，其余都相同。待其溶解后静置10min，在4000r/min下离心5min，分相并测定各相体积后上、下相各取0.5mL置于不同试管中，加9.5mL蒸馏水稀释20倍，再取稀释液1mL加1mL 5％苯酚和5mL浓硫酸，混匀后静置30min，在490nm下测吸光值。

聚合物分子量的改变会改变体系的成相行为，进而影响多糖在两相中的分配。分配系数K，上、下相体积比R和收率Y与PEG分子量的变化结果如图2。

由图2可以看出，当初始硫酸铵质量分数不变时，上、下相体积比随PEG分子量的增大而增大，因为上相体积增加，下相体积降低。分配系数变化较大，随着PEG分子量的增大先增加后减小，在PEG分子量4000时达到最大，高于4000时分配系数随着分子量的增加而降低。收率的变化与分子量的变化相一致，但收率的变化较缓慢，没有分配系数变化明显，这表明PEG分子量在4000时有利于上相富集多糖且有较好的收率，故最佳聚合物分子量选为PEG4000。

表5不同分子量PEG的加入量

注：-代表不添加。

2.4.2硫酸铵浓度对多糖分配系数和收率的影响

固定PEG分子量为4000，研究不同浓度的硫酸铵对双水相体系的成相行为的影响。取10支离心管，5支试验组，5支对照组，按表6加入糖提取液和药品，对照组用蒸馏水代替糖提取液，其余都相同，待其溶解后静置10min，在4000r/min下离心5min，分相后测定上、下相体积，再从上、下相各取1mL置于不同试管加9mL水稀释10倍，再取1mL稀释液加入1mL 5％苯酚和5mL浓硫酸，混匀后静置30min，在490nm下测吸光值。

表6硫酸铵的加入量

在固定PEG分子量4000，一定的PEG浓度条件下，分配系数K、上、下相体积比R和多糖在上相中的收率Y随硫酸铵浓度的变化关系如图3所示。

由图3可以看出对于同一初始质量的聚乙二醇，分配系数K和收率Y随硫酸铵质量分数的增加而逐渐增大，当硫酸铵浓度大于14％时，吸光值开始下降。这是因为硫酸铵质量分数增大，分相能力也增大，上相中PEG的质量分数也就随之增大，故分配系数K增大。但随着硫酸铵质量分数的再增大，上相体积减小，下相体积增大，所以上、下相体积之比R逐渐减小，导致收率Y增加不明显。故可选择硫酸铵浓度为14％。

2.4.3 PEG4000浓度对多糖分配系数和收率的影响

固定聚乙二醇的分子量为4000(PEG4000)、硫酸铵浓度为14％，研究PEG4000浓度对双水相体系成相行为的影响。取10支离心管，5支试验组，5支对照组，按表7加入溶液，对照组用蒸馏水代替糖提取液，其余都相同。待其溶解静置10min后，4000r/min离心5min，分相并测定上、下相体积，再从上、下相各取1mL置于不同试管中，加9mL水稀释10倍，再取1mL加1mL 5％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，在490nm下测吸光值。

表7 PEG4000的加入量

在PEG4000，硫酸铵2.8g下，分配系数K、上、下相体积比和多糖在上相中的收率Y随PEG浓度的变化关系如图4所示。

由图4可知，在试验设定的浓度范围内，随着PEG浓度的增加，分配系数K、体积比及收率都不断增加。但当PEG浓度增加到24％时，由于上相的PEG含量太多导致溶液的黏度很大，影响两相的相比，而相比和提取率有关，所以对提取率也有一定的影响，会损失一部分多糖。因此试验结果表明PEG4000的萃取浓度应选择21.33％。

考察了南瓜多糖在PEG/(NH₄)₂SO₄双水相体系中的分配规律，结果表明：当PEG4000浓度为21.33-24.00％之间，(NH₄)₂SO₄浓度为14.00％，分配系数K可达1.953-2.015，收率可达60.58-62.82％。利用PEG/(NH₄)₂SO₄形成的双水相体系中，南瓜多糖更易于分配在上相，与传统工艺相比，操作简单，条件温和，可以用作南瓜多糖的提取。

3.结论

南瓜多糖的提取与纯化方法：将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，低温(-18℃)冷冻3小时后采用超声辅助提取南瓜多糖，提取温度60℃，超声功率200W，提取时间30min，料液比1:30。在南瓜多糖提取液中加入一定量的PEG4000和硫酸铵进行萃取，使PEG4000浓度为21.33-24.00％，(NH₄)₂SO₄浓度为14.00％，充分搅拌使其均匀后，静置待其分相完全，以4000r/min的转速离心5min。溶液形成两相，南瓜多糖主要富集在上相中，分离出上相，在上相中加入无水乙醇，使其浓度达到80％，沉淀出多糖，经过滤、烘干后得到纯化的南瓜多糖。南瓜多糖的收率可达60.58-62.82％。

方法优点：

(1)传统的索氏提取相比,超声波用于南瓜多糖的提取具有省时、高效、节能等优点。

(2)在水溶液中进行萃取，不会引起多糖活性物质失活或变性。

(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min-15min；

(4)不存在有机物残留问题；

(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更加经济；

(6)易于工程放大和连续操作。

以上显示和描述了本发明的基本原理与主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.南瓜多糖的提取与纯化方法，其特征在于，将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，低温冷冻后采用超声辅助提取南瓜多糖得到南瓜多糖提取液；在南瓜多糖提取液中加入聚乙二醇和硫酸铵进行萃取，充分搅拌使其均匀后，静置待其分相完全，离心分离，溶液形成两相，南瓜多糖主要富集在上相中，分离出上相，在上相中加入无水乙醇，沉淀出多糖，经过滤、烘干后得到纯化的南瓜多糖。

2.根据权利要求1所述的南瓜多糖的提取与纯化方法，其特征在于，所述的低温冷冻是在-18℃环境下冷冻3小时。

3.根据权利要求1所述的南瓜多糖的提取与纯化方法，其特征在于，所述超声辅助提取的提取温度60℃，超声功率200W，提取时间30min，料液比1:30。

4.根据权利要求1所述的南瓜多糖的提取与纯化方法，其特征在于，在提取液内加入聚乙二醇，使其的浓度为21.33-24.00％；在提取液内加入硫酸铵，使其的浓度为14.00％。

5.根据权利要求1所述的南瓜多糖的提取与纯化方法，其特征在于，南瓜样品经冷冻处理后,以水为提取液。

6.根据权利要求1所述的南瓜多糖的提取与纯化方法，其特征在于，将南瓜洗净，去皮，去瓤后经粉碎机粉碎，搅拌均匀，在-18℃环境下冷冻3小时后采用超声辅助提取南瓜多糖，提取温度60℃，超声功率200W，提取时间30min，料液比1:30；在南瓜多糖提取液中加入PEG4000和硫酸铵进行萃取，使PEG4000浓度为21.33-24.00％，硫酸铵浓度为14.00％，充分搅拌使其均匀后，静置待其分相完全，以4000r/min的转速离心5min，溶液形成两相，南瓜多糖主要富集在上相中，分离出上相，在上相中加入无水乙醇，使其浓度达到80％，沉淀出多糖，经过滤、烘干后得到纯化的南瓜多糖。

7.按照如权利要求1-6任一项方法制得的南瓜多糖。