CN103054902A - 一种规模化生产转移因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由动物脾脏提取转移因子的方法。本发明的主要目的是提供一种适合规模化生产转移因子的方法。步骤包括先将脾脏细胞破碎制备为匀浆液，然后祛除匀浆液中的细胞残渣，然后提取转移因子，所述祛除匀浆液中细胞残渣的步骤包括：调节pH值为7.2；匀浆液按质量体积比1%的比例在匀浆液中添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟；离心，离心时间不少于30秒；重复离心3次，每次按质量体积比分别加入0.5%、0.4%、0.1%的聚氯化铝，加入聚氯化铝后都搅拌均匀，作用30分钟；离心液初步过滤；粗滤液用过滤精度为0.2μm的滤膜精滤即得。本发明突破性地采用聚氯化铝沉淀祛除脾脏细胞残留，生产方法适合大规模批量生产有效含量高、生物活性好的转移因子。

Description

一种规模化生产转移因子的方法

技术领域

本发明涉及由动物脾脏提取转移因子的方法。

背景技术

Lawrence等于1953年首先发现白细胞的可透析物质具备活淋巴细胞的功能，并把引起这种效应的物质称之为“转移因子”。

转移因子是小分子肽类、核糖、氨基酸及未知因子的混合物,其成分多达200多种，分子量小于10000道尔顿，对紫外光有吸收特性，最大吸收波长为E230～280nm，平均值为E250nm，不耐热，56℃下30min即可灭活，但其活性不为胰蛋白酶、DNA酶和RNA酶破坏，冻融后稳定，在-20℃以下保存数年之久活性不消失。转移因子在人药和兽药方面应用广泛，临床主要用于调节机体免疫力及病毒性、细菌性疾病的治疗或辅助治疗。

目前转移因子制备技术方案主要有透析法、加热法、醇提取法、超滤法和基因工程法等。下面就上述方法中涉及的细胞破碎方法和转移因子提取或制备工艺描述如下：

第一阶段，脾脏细胞破碎方法：除基因工程法外，现有的技术方案大多采用动物脾脏为原料，匀浆，用生理盐水适当稀释，而后用超声波法、机械法、化学法或冻融法等进一步破碎脾脏细胞，使其内容物释放出来而后提取转移因子。脾脏细胞破碎方法具体来说主要有以下几种：

1.1超声波法：处理的脾脏细胞破碎率极高，据我们实验，将超声波破碎机功率设定为200W，将初步处理的脾脏细胞分为3组，第一组处理10分钟，第二组处理20分钟，第三组处理30分钟，其细胞破碎率分别为99.51%，99.90%和100%，但超声波在工作过程中产生的化学自由基团能使某些具有生物活性的物质变性失活，且大容量装置声能传递，散热均有困难，因此只适合实验室小规模破碎脾脏细胞。

1.2机械法：主要通过组织捣碎机、高压均质机等的剪切、挤压作用破碎细胞。有研究表明，该法处理时间短时的细胞破碎率低，只有约30～50%的细胞被破碎，其余的则以单细胞或多细胞形式存在；要达到90%以上的细胞破碎率，需延长处理时间，机械在破碎细胞过程中因摩擦产热使物料温度升高，随着处理时间延长，升温效应越明显，对生产转移因子而言，温度过高会部分破坏其生物活性。

1.3化学法：化学试剂（如盐酸、氢氧化钠等）能溶解细胞壁上的脂类物质，改变细胞壁通透性，由于不能完全破坏细胞壁的结构，细胞破碎不充分，使得细胞内的有效成分释放不完全，提取的转移因子单位产量低。

1.4冻融法：主要作用为冻融破坏了细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性，同时细胞内水的结晶使细胞内外产生溶液浓度差，进而产生渗透压差，并且冰晶也会破坏细胞壁的完整性，从而达到破碎细胞的目的，该方法也存在着化学法中的缺点。

第二阶段，脾脏组织残渣的祛除及转移因子提取，主要方法有：

2.1透析法：是将经破碎处理的白细胞或脾脏细胞液置于透析袋中，在4℃条件下透析24～48h，透析外液即为粗制转移因子。该方法简单、不涉及过滤祛除残渣过程，缺点是目前透析袋批处理能力较小（一般为10mL～500mL/袋）且单位产量低，因此该方法主要用于实验室制备少量转移因子，不适合规模化生产。

2.2加热法：是目前大规模生产转移因子的主要方法，在人药制备转移因子中应用普遍。其方法是将破碎的脾脏细胞液加热至一定温度，利用高温使细胞残渣变性、沉淀，粗滤祛除细胞残渣，取清液部分，清液经逐级过滤而后超滤获得转移因子。缺点是转移因子内的、具有生物活性的小分子物质会被高温灭活，导致其生物活性降低。

另外，还有一些生产方法例如：

醇提取法：取外周血白细胞或切成小块的新鲜淋巴组织(包括脾、淋巴结)，加l倍体积冷却的80%乙醇及3倍体积的40%乙醇，高速捣碎3分钟，调pH至5.0，随后在冰浴中放置30～60分钟后在0～4℃条件下以2500rpm离心20分钟，取其上清液，即为转移因子。该方法缺点是乙醇用量较大，批处理量小，效率低，生产成本高。

超滤法：其主要方法是取新鲜的猪脾脏，经清洗，去脂肪、筋膜等杂质，绞碎后加入适量生理盐水，用高速组织捣碎机捣碎，经检测无完整的细胞后，加入适量的注射用水，经4000rpm离心35分钟后取上清液。对上清液用无石棉的澄清滤板过滤、澄清，澄清液用截留相对分子质量为6000的中空纤维超滤器超滤，收集滤出液，除菌即为转移因子。该方法的主要缺点是细胞液要4000rpm离心35分钟，鉴于目前大容量离心机的每次最大处理溶液量只有6～10L，所以该方法产量低、效率低，难以实现转移因子的规模化生产。

基因工程法：以基因工程法制备抗乙肝病毒特异性转移因子为例，主要包括mRNA差异显示法克隆小鼠抗乙肝病毒特异性转移因子基因、重组基因工程酵母菌的构建、表达产物的分离与纯化。该方法涉及到分子生物学、发酵工程和纯化工程等技术领域，技术难度大，设备要求高，对从业人员的知识层面和操作能力要求很高，目前该技术还处于研究阶段，鲜有产品面世。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种适合规模化生产转移因子的方法。

为实现上述发明目的，本发明完成了以下几项具有相同技术构思的发明创造：

一种祛除脾脏细胞匀浆液中的细胞残渣的方法，步骤包括：脾脏细胞破碎后调节pH值为5-9，然后加入聚氯化铝搅拌均匀，然后过滤残渣或者离心收集清液即得。

优选的，所述的聚氯化铝加入匀浆后静置半小时。

优选的，所述的匀浆调节pH值为7.2。

本发明采用通常用于水处理的聚氯化铝作为絮凝沉淀剂促进脾脏残渣沉淀，便于祛除；能显著提高细胞残渣祛除效率。至于细胞破碎和后续转移因子的提取则可以采用本领域技术人员能所能及的其它方案，不受限制。

一种规模化生产转移因子的方法，包括先将脾脏细胞破碎制备为匀浆液，然后祛除匀浆液中的细胞残渣，然后提取转移因子，其特征在于：

所述祛除匀浆液中细胞残渣的步骤包括：

将匀浆液用2mol/L NaOH溶液调节pH值为7.2；

细胞破碎后的脾脏匀浆液按质量体积比1%的比例在匀浆液中添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟；

用离心机离心，保证匀浆液加入后离心时间不少于30秒，收集得到离心液；

按上述方法将离心液再重复离心3次，每次按质量体积比分别加入0.5%、0.4%、0.1%的聚氯化铝，加入聚氯化铝后都搅拌均匀，作用30分钟；

离心液初步过滤得比浊度为1的粗滤液；

粗滤液用过滤精度为0.2μm的滤膜精滤即得。

优选的，所述调节pH值之前用胶体磨进行第二次匀浆，胶体磨磨齿间距为9μm。

优选的，所述的转移因子的提取步骤包括：

用截留分子量为6000道尔顿的超滤设备将精滤液进行超滤，将精滤液中的蛋白质全部滤除；

超滤液用装有过滤精度为0.2μm的过滤器过滤除菌得产品。

优选的，产品在-20℃条件下保存；或者冻干制备成粉剂。

优选的，所述的脾脏细胞破碎制备为匀浆液的步骤包括：

用绞肉机将脾脏绞碎呈糊状液；

用4℃的灭菌注射用水按1:1体积稀释，搅拌均匀；

调节胶体磨磨齿间距为15μm，用胶体磨匀浆5分钟，期间保证物料温度不高于15℃；

将匀浆液用2mol/L的HCl溶液调节pH值至4.0；

在-20℃的冷库中充分冻实，在4℃的流动水中解冻，如此反复冻融6次。

本发明的方法适合大规模批量生产，生产的转移因子有效含量高、生物活性好，具体的有益技术效果：

1、综合使用了机械法、化学法和冻融法来破碎细胞，并对各个环节的技术指标进行了优化和筛选，细胞破碎率高达99.50%以上；且猪脾脏细胞破碎率高、处理过程全程低温、批处理能力大、避免有效物质失活：用水冷式胶体磨代替高压匀质机和超声波等来破碎脾脏细胞，解决了因机械摩擦产热使匀浆液温度升高进而影响后续产品活性的问题；同时实现了连续、大批处理脾脏细胞的能力。

2、祛除细胞残渣方法先进：首次将聚氯化铝用于脾脏细胞匀浆液的絮凝沉淀并对其添加量和添加方法进行了研究；实现了祛除细胞残渣的连续性和大规模化，是目前除加热法外唯一能规模化祛除细胞残渣的较好方法。

3、两次调节匀浆液pH值和二次匀浆破碎细胞法提高了细胞破碎率的同时使得细胞核内的肽类、线粒体内的核糖和附着在内质网上的核糖等有效成分充分释放出来，与目前文献报道的转移因子提取方法相比，本技术方案生产的转移因子的某些有效成分的单位含量，如多肽，提高了约1倍，现有公开文献报道的转移因子多肽含量最高为5.71mg/mL。

4、生产全过程的低温冷链控制，最大限度地保持了转移因子的生物活性，本方案生产的转移因子生物活性是国标的2.6倍。

5、该技术方案中最耗工时的部分是祛除细胞残渣过程，1台105型管式离心机在8小时的工作时间内可离心500L脾脏匀浆液1次，需工作人员2人，连续3～4天可生产一批转移因子半成品约380L；如果将同型号的管式离心机增加至4台，增加1名工作人员，可实现日产转移因子半成品500L；如果还要增加单产，可通过相应增加离心机、冷藏装置和工作人员数量来达到。

6、定量检测了铝残留量，转移因子中铝的残留量是标准要求的一半，确保了产品的安全性。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图；

图2是转移因子产品的光谱扫描图。

具体实施方式

一种规模化生产转移因子的方法，以猪、牛、羊、马或类似动物脾脏为起始原料，经过脾脏细胞破碎和脾脏组织残渣的祛除及转移因子提取处理。本发明以猪脾脏为例，进行详细介绍。

猪脾脏细胞的破碎方法优化筛选：

1.主要材料及设备

猪脾脏：雨润集团重庆汇通肉类加工有限公司，经检疫合格；

绞肉机：DJ32-2型，成都红樱桃食品机械制造有限公司；

胶体磨：CF-30型，温州市成华包装有限公司；

细胞计数板：XB-K-25型，上海安信光学仪器制造有限公司；

2.方法

经检疫合格的健康猪脾脏祛除筋膜、脂肪等，用4℃灭菌生理盐水洗涤3次，在无菌室内用绞肉机（75%酒精水溶液浸泡铰刀等与脾脏接触部件30分钟，而后用灭菌注射用水充分洗涤至无酒精残留，本发明中涉及机械、器械消毒的均采用此方法，特殊注明的除外）将脾脏绞碎呈糊状液，用4℃的灭菌注射用水按1:1体积稀释糊状液，而后导入经蒸汽消毒的搅拌罐，搅拌均匀；调节胶体磨磨齿间距为15μm，打开胶体磨的水冷却系统，将搅拌罐内的脾脏液导入胶体磨盛料斗，10L/次，接通胶体磨电源，匀浆5分钟/批次，匀浆结束后用温度计检测盛料斗内匀浆液的温度，确保温度低于15℃，如高于此温度，则加大水冷却系统的水流量来降温。而后将匀浆液导入储液罐。

如此重复加料直到全部脾脏液匀浆结束，搅拌均匀后从中间部位取样1mL，用适量体积的生理盐水稀释，在显微镜下用细胞计数板进行细胞计数，重复3次，取平均值，计算出每毫升匀浆液中的完整细胞个数。

将所得脾脏匀浆液分成5份，第1至第5份脾脏匀浆液分别用2mol/L的HCl溶液调节pH值至4.0、4.2、4.4、4.6和4.8，然后将其转入经高压灭菌的50L塑料桶中，分别标记为1～5号，在-20℃的冷库中充分冻实，在温度设定为4℃的水浴循环加热池中解冻，如此反复冻融1～7次，每冻融1次都对1～5号脾脏匀浆液取样1mL，进行细胞计数。结果显示，在冻融第6次时，1号的细胞破碎率最高，为99.69%，2～5号的细胞破碎率均低于此百分比，依次分别为：97.71%，95.55%，94.29%，和91.37%；当冻融7次时，1～5号的细胞破碎率分别为99.93%，99.92%，99.92%，99.90%和99.89%，差异不显著（P＞0.05）。

可见：采用1脾脏匀浆采用HCl溶液调节pH值至4.0的条件下，按本发明的温度条件冻融6次即可达到细胞破碎率99.69%。具有最好的经济效益，显著节省能源消耗并提高生产效率。

本发明在后续操作中利用与1号匀浆相同的处理方法破碎脾脏细胞，以下简称“1号方案”。当然本领域技术人员也可以利用其它方式处理的破碎脾脏细胞匀浆进行残渣祛除处理。

脾脏细胞残渣的祛除方法优化筛选

1.主要材料及设备（对重复的材料设备不再单独标列）

聚氯化铝:25kg/袋，河南蓝天净化材料有限公司；

板框过滤器：6HL2-20LSWSC型，杭州南方特种泵业有限公司；

滤板：规格，30cm，大连天龙过滤介质有限公司；

卫生级蠕动泵：PP-06型，成都市南方模具研究所；

管式离心机：GF-105型，辽阳天兴药机有限公司；

澄明度检测仪：YB-II型，天津市新天光分析仪器技术有限公司；

比浊管：北京天安联合科技有限公司。

2.方法

2.1实验室初步筛选：

取猪脾脏，按照1号方案处理后用胶体磨进行第二次匀浆，同时调节胶体磨磨齿间距为9μm，将匀浆液分成5份，用2mol/L NaOH溶液分别调节pH值为6.0、6.3、6.6、6.9和7.2，搅拌均匀，标记为6～10号。

实验1：分别从6～10号中各取样4mL，加入5mL离心管中，台式离心机4000rpm离心3分钟，将6～10号按顺序垂直摆放于试管架上，发现所有样品均分为三层，上层为一层薄薄的白色膜状物，厚度依次变薄，手感微滑，类似于脂肪；中间层为清液，颜色从深红棕色至微黄色渐变，透光度依次增加，液面高度递减；下层为细胞残渣，厚度依次增厚。

上述结果说明：随着溶液的pH值增大，在相同处理条件下，祛除细胞残渣的效果逐渐提高，以第10号为最佳。

实验2：分别从6～10号中各取样50mL加入100mL烧杯中，每号别重复取样5次。将6号的5组样品一字排开，分别标记为6-1、6-2、6-3、6-4和6-5，按质量体积比的1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2%，称量自来水处理中作为絮凝剂使用的聚氯化铝，分别用5mL注射用水充分溶解，按顺序加入6-1～6-5样品中，搅拌均匀，室温静置半小时，而后各从液面高度的中间部位取样4mL，加入5mL离心管中，台式离心机4000rpm离心3分钟，发现所有样品均分为二层，上层为清液，颜色从微红棕色至微黄色渐变，液面高度依次递减；下层为细胞残渣，厚度依次增厚。用带针头的1mL注射器吸出每样品中的清液，转入干净的离心管中并计量总体积，6-1～6-5样品的清液总体积分别为3.10mL、3.05mL、2.97mL、2.95mL和2.93mL。按上述方法，分别处理7～10号，7-1～7-5样品的清液总体积分别为3.05mL、3.02mL、2.95mL、2.93mL和2.90mL；8-1～8-5样品的清液总体积分别为3.02mL、3.00mL、2.94mL、2.90mL和2.85mL；9-1～9-5样品的清液总体积分别为3.00mL、2.98mL、2.92mL、2.85mL和2.80mL；10-1～10-5样品的清液总体积分别为2.96mL、2.90mL、2.85mL、2.80mL和2.74mL。

将上述上清液分别吸入5mL注射器，用加有0.22μm滤膜的针孔过滤器分别过滤，发现6-1～6-5样品上清液、7-1～7-5样品上清液和8-1～8-5样品上清液均不能完全通过滤膜；9-1～9-5样品上清液只有9-5能通过滤膜，但需要稍加压力；10-1～10-5样品上清液有10-4和10-5能通过滤膜，但10-4需要稍加压力,10-5则非常顺利通过滤膜。

按照10-4和10-5方法，各重新制备50mL上清液，用比浊法检测其澄明度。结果显示，10-4样品上清液的比浊度介于1～2之间，10-5样品上清液的比浊度为1。

结果：NaOH能使细胞组织液变性、沉淀，从而提高离心祛除残渣的效果，提高滤液澄清度，其作用在本节的实验1中得到了验证。聚氯化铝是一种阳离子型高分子电解质，具有吸附活性高，悬浮物易成团，沉淀速度快，澄清处理时间短，适宜pH范围宽(5～9)，应用时不需助凝剂，不受水温影响等特点，被广泛应用于净化饮用水。本技术方案中用聚氯化铝为絮凝剂来絮凝、沉淀脾脏细胞残渣。并经0.22μm滤膜过滤和比浊法检测溶液澄明度，验证了本发明的效果可靠。

因此根据脾脏细胞残渣的祛除实验的结果，实验2中编号为10-5方案为实验室最佳祛除脾脏细胞残渣工艺，以下简称“2号方案”。

规模化生产中祛除细胞残渣工艺的优化

将本发明的1号方案生产的脾脏匀浆液，用胶体磨进行第二次匀浆，同时调节胶体磨磨齿间距为9μm，用2mol/L NaOH溶液调节pH值为7.2，分成2份。

实验1：将第1份脾脏匀浆液导入经消毒的、温度设置为冷藏档的500L冰柜中，按照2号方案中的剂量添加聚氯化铝，聚氯化铝先用注射用水溶解；开启管式离心机，调节蠕动泵转速为150rpm，将匀浆液导入管式离心机离心，离心液导入另外一个经消毒的、温度设置为冷藏档的500L冰柜中，待离心机转鼓内充满了脾脏细胞残渣后停机，卸下转鼓，清除其内残渣，转鼓装机后再进行离心，待匀浆液离心完30%时停机，检测经离心后的溶液内细胞残渣祛除效果，结果发现溶液中仍然残留较大比例的残渣，溶液不澄清，无法用滤板精滤，进而导致无法进行后续处理。

通过对管式离心机工作原理的研究发现，如果连续用蠕动泵不间断地输送匀浆液，匀浆液在离心机转鼓内停留时间过短随即经出液口排出，虽然离心机转速高达15000rpm，也不能有效祛除细胞残渣。于是更改蠕动泵工作程序为每输入5L溶液（离心机转鼓容量为6L）后停机30秒，如此反复，祛除残渣效果明显改善，但溶液任然不澄清，直至所有溶液重复进行5次离心时，离心液的比浊度才达到2～3，用板框过滤器加10块滤板（规格为直径30cm）1次可过滤150L溶液，而后再更换滤板重新过滤。

实验2：将第2份脾脏匀浆液导入经消毒的、温度设置为冷藏档的500L冰柜中，按照质量体积比的1%在匀浆液中添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟，开启管式离心机，调节蠕动泵转速为150rpm，蠕动泵工作程序为每输入5L溶液后停机30秒，将匀浆液导入管式离心机离心，离心液导入另外一个经消毒的、温度设置为冷藏档的500L冰柜中，直至全部匀浆液离心结束；而后在经过1次离心的离心液中按照质量体积比的0.5%在匀浆液中添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟，重复离心一次，取样检测离心液比浊度为5；按照质量体积比的0.4%在经2次离心的离心液中添加聚氯化铝，离心过滤，离心液的比浊度为2～3；按照质量体积比的0.1%在经3次离心的离心液中添加聚氯化铝，离心过滤，离心液的比浊度为1～2；用板框过滤器加10块滤板过滤400L溶液，离心液1次全部通过滤板得粗滤液，此时的粗滤液比浊度为1；将粗滤液用板框过滤器加10块滤板和过滤精度为0.2μm滤膜精滤，滤液一次通过，经过精滤的溶液呈现出澄清透明的微黄色。

结果表明：在2号方案的基础上，研究了规模化祛除脾脏细胞残渣的方法：即用2mol/L NaOH分别调节脾脏匀浆液的pH值为7.2；调节蠕动泵转速为150rpm，蠕动泵工作程序为每输入5L溶液后停机30秒；按照质量体积比分4次加入总量为2%的聚氯化铝于匀浆液/离心液中，4次离心结束时溶液的比浊度达到1～2，再用板框过滤器粗滤、精滤，溶液达到了澄清透明。

转移因子的规模化生产

在前期实验室和规模化实验的基础上，本发明对转移因子的生产技术方案进行了总结并进行了生产：

1.材料和设备（对重复的材料和设备不再列出）

中空纤维超滤器：DH-UF6000型，河北大城县华泰净化技术工程有限公司；

塔式过滤器及折叠滤芯：海宁盐官创新过滤设备制造厂，过滤精度0.2μm。

2.生产方法

2.1.猪脾脏细胞的破碎

经检疫合格的健康猪脾脏祛除筋膜、脂肪等，用4℃灭菌生理盐水洗涤3次，在无菌室内用绞肉机（75%酒精水溶液浸泡铰刀等与脾脏接触部件30分钟，而后用灭菌注射用水充分洗涤至无酒精残留，本发明中涉及机械、器械消毒的均采用此方法，特殊注明的除外）将脾脏绞碎呈糊状液，称重为240kg，将其倒入经蒸汽消毒容积为1000L的搅拌罐，用4℃的灭菌注射用水按1:1体积稀释，搅拌均匀；调节胶体磨磨齿间距为15μm，打开胶体磨的水冷却系统，将搅拌罐内的脾脏液导入胶体磨盛料斗，10L/次，接通胶体磨电源，匀浆5分钟/批次，直到全部物料匀浆完成。匀浆结束后用温度计检测盛料斗内匀浆液的温度（确保温度低于15℃，如高于此温度，则加大水冷却系统的水流量来降温），而后将匀浆液导入另外一个容积为1000L的搅拌罐，直至匀浆结束；脾脏匀浆液用2mol/L HCl调节pH值至4.0，搅拌均匀，然后将其转入经高压灭菌的50L塑料桶中，在-20℃的冷库中充分冻实，在4℃的流动水中解冻，如此反复冻融6次，取样1mL，进行细胞计数，细胞破碎率为99.58%。

2.2.猪脾脏细胞残渣的祛除

将上述经6次冻融的脾脏匀浆液在胶体磨磨齿间距为9μm的条件下用胶体磨进行第二次匀浆，再用2mol/L NaOH溶液调节pH值为7.2。

从搅拌罐中导入1台经消毒的、温度设置为冷藏档的500L冰柜（I号冰柜）中，按照质量体积比的1%在匀浆液中添加聚氯化铝（用适量注射用水充分溶解，以下同），搅拌均匀，作用30分钟，开启管式离心机，调节蠕动泵转速为150rpm，蠕动泵工作程序为每输入5L溶液后停机30秒，将匀浆液导入管式离心机离心，离心液导入另外1台经消毒的、温度设置为冷藏档的500L冰柜（II号冰柜）中，直至全部匀浆液离心结束。将II号冰柜中的离心液中按照质量体积比的0.5%添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟，离心，离心液导入I号冰柜（经清洗、消毒，以下同）中，取样检测离心液比浊度为5；

将I号冰柜中的离心液按照质量体积比的0.4%添加聚氯化铝，作用30分钟，离心，离心液导入II号冰柜中，检测离心液的比浊度为2～3；

将II号冰柜中的离心液中按照质量体积比的0.1%添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟，离心，离心液导入I号冰柜中，取样检测离心液比浊度介于1～2；

用板框过滤器加10块滤板过滤I号冰柜中的离心液，粗滤液导入II号冰柜中，此时的粗滤液比浊度为1；

将II号冰柜中的粗滤液用板框过滤器加10块滤板和过滤精度为0.2μm滤膜精滤，精滤液导入I号冰柜中储存。

2.3.转移因子的提取

将截留分子量为6000道尔顿的20柱中空纤维超滤器消毒、用灭菌注射用水彻底清洗并检测膜结构完整无破损后将I号冰柜中储存的精滤液导入超滤器盛料斗，开启电源，进行超滤，在超滤过程中进行滤出液的蛋白质检测；检测方法为每隔10分钟取样2mL，加20％磺基水杨酸溶液2mL，混匀，观察10分钟，不得有浑浊或沉淀产生，也就是确保超滤液中没有蛋白质存在。滤出液即为转移因子半成品，转移因子半成品用经高压灭菌的、装有过滤精度为0.2μm折叠滤芯的塔式过滤器过滤除菌，取样、分装即得成品312公斤，成品在-20℃条件下保存。

按照本技术方案，在试生产中，我们配备5名工作人员，4台连续管式离心机和1台20柱子的中空纤维超滤器，可实现生产转移因子1吨/8小时，该技术方案可实现真正意义上的规模化生产转移因子。

整个生产工艺流程如图图1所示。

3.产品的确认和质量检测

3.1.转移因子质量按照《国家药品监督管理局转移因子口服溶液药品标准》WS1-(X-451)-2003Z项下要求检测（以下简称《标准》）；另外按照《中国药典》(2005,三部)，附录41，定量检测了铝残留量。

性状：应为无色至微黄色澄清液体。

本品：无色至微黄色澄清液体，符合标准规定。

鉴别：(1)取本品1ml，加茚三酮试液数滴，加热，溶液应显蓝紫色。

本品：显蓝紫色，符合标准规定。

3.2.取本品，加水制成每1ml中含多肽20μg的溶液，照分光光度法(中国药典2000年版二部附录ⅣA)测定，在251nm(猪脾)或261nm(牛脾)的波长处有最大吸收。在251nm(猪脾)或261nm(牛脾)与280nm波长处吸收度的比值不得低于1.9。

本品：在251nm的波长处有最大吸收（序号6）；定点检测在280nm波长处吸收度为0.232，在251nm与280nm波长处吸收度的比值为2.38，符合标准规定。如图2所示。

3.3.检测：

3.3.1.pH值：应为6.0～7.5(中国药典2000年版二部附录ⅥH)。

本品：pH值为7.2，符合标准规定。

3.3.2.游离氨基酸：取本品适量，用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定，另取相应的氨基酸对照品制成相应浓度的对照品溶液，同法测定。每1mL含游离氨基酸不得少于1.3mg。

本品：取本品适量，用氨基酸分析仪测定，每1mL含游离氨基酸17.8mg，符合标准规定。

3.3.3.活力测定：取本品适量，照T细胞活性测定法-脱E受体法(附一)测定，供试品管的E玫瑰花结百分率与对照管的E玫瑰花结百分率之差不得低于10.0％。

本品：本品E玫瑰花结百分率与对照管的E玫瑰花结百分率之差为26%，符合标准规定。

3.3.4.其他：应符合口服溶液剂项下有关的各项规定(中国药典2000年版二部附录ⅠO)。

本品：符合其他项的各项规定。

3.3.5.铝残留：参照《中国药典》(2005,三部)，附录41项检测，应小于200μg/L。

本品：铝残留量为101.76μg/L，符合标准规定。

3.4.含量测定

3.4.1.多肽：按照福林酚测定法(附二)测定。从回归方程中求出多肽含量。

本品：将本品取样2次，分别检测多肽含量后取平均值，结果为多肽含量10.41mg/mL。《标准》中规定多肽应为标示量的90.0％～110.0％，规格为多肽含量1mg/mL，本品中多肽含量是标准的10.41倍。

3.4.2.核糖：以D-核糖对照品，参照标准中分光光度法，从回归方程中求出核糖含量。

本品：核糖含量为286.78μg/mL。《标准》中规定含核苷酸以D-核糖计不得低于标示量的80.0％，规格为30μg/mL，本品中核糖的含量是标准的9.6倍。

Claims (8)

1.一种祛除脾脏细胞匀浆液中的细胞残渣的方法，步骤包括：脾脏细胞破碎后调节pH值为5-9，然后加入聚氯化铝搅拌均匀，然后过滤残渣或者离心收集清液即得。

2.根据权利要求1所述的一种祛除脾脏细胞匀浆液中的细胞残渣的方法，其特征在于：所述的聚氯化铝加入匀浆后静置半小时。

3.根据权利要求1所述的一种祛除脾脏细胞匀浆液中的细胞残渣的方法，所述的匀浆调节pH值为7.2。

4.一种规模化生产转移因子的方法，包括先将脾脏细胞破碎制备为匀浆液，然后祛除匀浆液中的细胞残渣，然后提取转移因子，其特征在于：所述祛除匀浆液中细胞残渣的步骤包括：

将匀浆液用2mol/L NaOH溶液调节pH值为7.2；

细胞破碎后的脾脏匀浆液按质量体积比1%的比例在匀浆液中添加聚氯化铝，搅拌均匀，作用30分钟；

用离心机离心，保证匀浆液加入后离心时间不少于30秒，收集得到离心液；

按上述方法将离心液再重复离心3次，每次按质量体积比分别加入0.5%、0.4%、0.1%的聚氯化铝，加入聚氯化铝后都搅拌均匀，作用30分钟；

离心液初步过滤得比浊度为1的粗滤液；

粗滤液用过滤精度为0.2μm的滤膜精滤。

5.根据权利要求4所述的一种规模化生产转移因子的方法，其特征在于：所述调节pH值之前用胶体磨进行第二次匀浆，胶体磨磨齿间距为9μm。

6.根据权利要求4或5所述的一种规模化生产转移因子的方法，其特征在于：所述的转移因子的提取步骤包括：

用截留分子量为6000道尔顿的超滤设备将精滤液进行超滤，将精滤液中的蛋白质全部滤除；

超滤液用装有过滤精度为0.2μm的过滤器过滤除菌得产品。

7.根据权利要求6所述的一种规模化生产转移因子的方法，其特征在于：产品在-20℃条件下保存；或者冻干制备成粉剂。

8.根据权利要求4所述的一种规模化生产转移因子的方法，其特征在于：所述的脾脏细胞破碎制备为匀浆液的步骤包括：

用绞肉机将脾脏绞碎呈糊状液；

用4℃的灭菌注射用水按1:1体积稀释，搅拌均匀；

调节胶体磨磨齿间距为15μm，用胶体磨匀浆5分钟，期间保证物料温度不高于15℃；

将匀浆液用2mol/L的HCl溶液调节pH值至4.0；

在-20℃的冷库中充分冻实，在4℃的流动水中解冻，如此反复冻融6次。

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