CN104498570A - 海洋鱼蛋白肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋鱼蛋白肽及其制备方法，所述方法步骤为：将鱼肉依次用碱性盐水、水漂洗，加水升温至85-95℃，加热10-25min，快速降温至2-5℃，静置，弃去上液和油脂，得蛋白；调至体系中蛋白浓度为30-50％w/v，后升温至45-60℃，按蛋白的重量依次添加胰蛋白酶100-150U/g，枯草芽孢杆菌蛋白酶250-450U/g，控制固形物浓度为10-15％，灭酶，将水解产物离心，得酶解液；再经陶瓷膜、有机超滤膜、纳滤膜过滤。该方法打破了传统的鱼胶原蛋白制备模式与技术，设备简单，易操作，适合大规模生产；制得的蛋白肽，产品活性好，质量高，品质稳定，且具有良好的免疫调节、抗疲劳、抗氧化的功效。

Description

海洋鱼蛋白肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及海洋生物制品与生物技术加工领域，特别是涉及一种海洋鱼蛋白肽及其制备方法。

背景技术

蛋白肽(IGF-1)，又名人类生长因子，是一种活性蛋白多肽物质，介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，主要由2～10个氨基酸组成，它是人体内肝细胞、肾细胞、脾细胞等十几种细胞自分泌和旁分泌的产物，具有十分重要的生物学意义，其具体功能包括：降血糖、降血脂、舒张血管、促进骨的合成代谢保持其正常结构功能、促生长、促细胞分化、创伤修复等。近年来，随着蛋白肽的价值越来越受到重视，国内外对不同原料来源的蛋白肽的功能活性、制备工艺等各个方面进行了广泛研究，市场上较为成熟的蛋白肽类产品如大豆蛋白肽、乳清蛋白肽、玉米蛋白肽、小麦蛋白肽、猪皮(骨)胶原蛋白肽、驴皮(骨)胶原蛋白肽、鱼皮(鳞/骨)胶原蛋白肽等。

海洋鱼蛋白肽是从海洋鱼中提取的一类纯天然营养物质，相对分子质量在5000Da以下，容易吸收，且吸收效率非常高，一方面提供人体生长发育所需的营养物质，另一方面对人体生命活动发挥着极其重要的作用，作为高档营养食品、特殊医学用途配方食品和保健食品基料，市场前景非常广阔。

目前，市场上的鱼蛋白肽基本都是以鱼皮、鱼鳞、鱼骨为原料制备的鱼胶原蛋白肽，偏重于美容护肤功能，产品种类单一。绝大部分制备原理都是先通过酸碱浸泡提取胶原蛋白然后通过水解方式制备胶原蛋白肽，这是目前国内外应用最广泛、工艺最成熟的方法，得到的产品质量较好、品质稳定，但是在提胶过程采用酸碱处理会存在极大的安全风险，同时会产生大量的盐，增加后续脱盐工序和生产成本。部分方法是通过直接酶解手段制备胶原蛋白肽，简化了生产工艺，但与上述先提胶后制备蛋白肽的工艺相比而言产品质量不高、品质不稳定，且得率较低。还有部分方法是通过菌种发酵手段来制备胶原蛋白肽，功能活性较高，但菌种筛选与培育、蛋白肽的分离都对生产条件和设施提出了较高的要求，同时培养基如不能做到清洁处理也会对环境造成较大污染。除此之外，少数制备特定活性蛋白肽如高F值寡肽方面的专利因得率极低，目前只能作为理论研究用而无法真正实现产业化。

而我们知道，全球海洋鱼类资源极其丰富，其是非常重要的蛋白质来源。而从营养学角度来讲，海洋鱼类蛋白质是完全蛋白质，含量高达18％-25％，且蛋白质所含氨基酸种类齐全，8种必需氨基酸比例均衡，适合人体需要，容易被消化吸收，利用率高达85％-98％。但目前，海洋鱼蛋白资源深加工比例较低，资源浪费严重。在鱼蛋白深加工产业中，鱼胶原蛋白肽是目前较为成熟的一类产品，但其开发利用的部分是细胞外蛋白质——肌基质蛋白中的胶原蛋白，而对于含有活性成分较高的细胞内蛋白质——肌原纤维蛋白和肌浆蛋白并没有被开发利用，主要原因在于细胞内蛋白质油脂脱除、腥苦味脱除以及色泽等问题一直存在着技术瓶颈，故制得的海洋鱼蛋白肽制品品质不能达到现有市场要求，从而导致较难以产业化。因此，开发其他能够被市场所广泛接受认可的海洋鱼蛋白肽制品对于促进我国海洋鱼类资源深加工产业和海洋生物制品产业发展以及改善国民健康具有重要的现实意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种海洋鱼蛋白肽的制备方法。

解决上述技术问题的具体技术方案如下：

一种海洋鱼蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将海洋鱼鱼肉用碱性盐水漂洗，后用水漂洗；所述碱性盐水是由体积比为0.9-1.1:0.9-1.1的浓度为0.13-0.17％w/v的碳酸氢钠水溶液和浓度为0.08-0.12％w/v的氯化钠溶液混合而成；

(2)将经步骤(1)处理的鱼肉加水升温至85-95℃，加热10-25min，后快速降温至2-5℃，静置，弃去上液和油脂，得蛋白；

(3)于蛋白中加水，调至体系中蛋白的浓度为30-50％w/v，后升温至45-60℃，按蛋白的重量添加胰蛋白酶100-150U/g，水解25-35min，再按蛋白的重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶250～450U/g，水解170-190min，控制固形物的浓度为10-15％w/v，灭酶，得水解产物；

(4)将水解产物于4500-5500r/min的速度下离心，得酶解液；

(5)将酶解液经50nm陶瓷膜微滤，后经10kDa的有机超滤膜进行分级纯化，再经150-180Da的纳滤膜进行纳滤。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述碱性盐水漂洗的具体方法为：按重量比为1:3-5，将海洋鱼鱼肉用碱性盐水于频率为32-38K/HZ的条件下超声漂洗10-20min。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述水漂洗的具体方法为：按重量比为1:5-8，将经碱性盐水漂洗过的海洋鱼鱼肉用水于频率为32-38K/HZ的条件下超声漂洗25-35min。

在其中一些实施例中，步骤(2)中将经步骤(1)处理的鱼肉加水升温至90-95℃，加热10-20min。

在其中一些实施例中，步骤(3)中按蛋白的重量添加胰蛋白酶140-150U/g，水解30-35min。

在其中一些实施例中，步骤(3)中按蛋白的重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶440-450U/g，水解178-182min。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述的碱性盐水是由体积比为1:1的浓度为0.15％w/v的碳酸氢钠水溶液和浓度为0.1％w/v的氯化钠溶液混合而成。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述的灭酶的温度为95-100℃，时间为10-15min。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述静置的时间为15-30min。

在其中一些实施例中，还包括步骤(6)浓缩和喷雾干燥；所述喷雾干燥的条件为：进料温度180～200℃，出风温度75～85℃，控制水分≤6.0％。

在其中一些实施例中，所述浓缩为：浓缩至固形物的浓度为20-25％w/v。

本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的海洋鱼蛋白肽。

本发明所述的海洋鱼蛋白肽及其制备方法具有以下优点和有益效果：

(1)本发明经发明人大量的实验和研究，得出：以海洋鱼鱼肉为原料，采用碱性盐水漂洗鱼肉，有效去除了海洋鱼鱼肉中的油脂和色素，并利用加热致蛋白变性的原理，同时严格控制加热温度和时间及采用快速降温的方式，实现了对蛋白(即肌原纤维蛋白和肌浆蛋白)的沉降分离，再采用分步酶解，同时严格控制所添加酶的种类和酶解时间，再经过滤，即可获得平均分子量为256-384的小分子蛋白肽；该方法打破了传统的鱼胶原蛋白制备模式与技术，且其设备简单，易操作，适合大规模生产；采用该方法制得的蛋白肽，产品活性好，质量高，品质稳定，且具有良好的免疫调节、抗疲劳、抗氧化的功效；该蛋白肽还具有丰富了海洋生物制品种类，消费者认可度高，市场前景广阔的优点；

(2)本发明所述制备方法中还进一步采用超声漂洗方式，同时严格控制漂洗过程中鱼肉和碱性盐水或水的比例，及漂洗时间和超声频率，在该条件下，可高效去除海洋鱼鱼肉中的部分油脂和色素类物质，避免了产品的氧化哈败，色泽的变化；

(3)本发明所述制备方法中采用分步酶解，添加适宜比例的胰蛋白酶及酶解时间，可获得10k-50kDa的大分子蛋白肽类产物；再进一步通过适宜比例的枯草芽孢杆菌蛋白酶进行适度内切，进而获得小分子蛋白肽产物；

(4)本发明所述制备方法中采用陶瓷膜微滤，可有效除去悬浮物、菌体、大分子蛋白杂质；有机超滤膜可除去大于10kDa分子量的大分子蛋白、色素等杂质，提高产品纯度；纳滤可有效脱除料液中的一价盐；

(5)本发明所述制备方法制得的蛋白肽，其为呈乳白色粉末状，无异味；总氮(以干基计，g/100g)≥14.0；肽含量(以干基计，g/100ml)≥70；相对分子质量小于5000u的蛋白质水解物所占比例(％)≥85；水分(％)≤6.0；灰分(％)≤7.0；无机砷(以As计，mg/kg)≤0.5；铅(以Pb计，mg/kg)≤1.0；甲基汞(mg/kg)≤0.5；镉(以Cd计，mg/kg)≤0.1；多氯联苯a(mg/L)≤0.5；菌落总数(cfu/g)≤10000；大肠菌群(MPN/100g)≤40；霉菌/(CFU/g)≤50；致病菌未检出。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所述胰蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

实施例1

本实施例所述海洋鱼蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)以150kg的沙丁鱼为原料，去除鱼头和内脏(由于鱼头、内脏和黑膜等含有较高油脂和腥苦味物质，故去除)，流水清洗血污、黑膜等物，沥干称重，计算得率；

(2)将上述预处理原料鱼经采肉机采肉，鱼皮鱼骨作为胶原蛋白肽原料回收，采肉的目的主要是利用鱼肉的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白；

(3)将上述鱼肉用碱性盐水按重量比为1:3的比例在超声波清洗槽中进行漂洗15min，频率32K/HZ，然后用清水按肉的水的重量比为1:5的比例在超声波清洗槽中进一步漂洗30min，频率32K/HZ，通过高频率超声振动和漂洗方式高效率去除鱼肉中的部分油脂和色素类物质；所述碱性盐水为：0.15％w/v碳酸氢钠:0.1％w/v食盐水＝1:1(v/v)；

(4)将上述经漂洗的鱼肉加水升温至90℃，加热25min，然后经板式换热器，将温度快速降温至3℃，静置沉降15min，将上液及油脂部分去除，得到无腥味色素的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白；

(5)将上述目标鱼细胞内蛋白加水调至底物(蛋白)浓度50％(料液比，W/V)，然后升温至50℃，按原料(蛋白)的重量添加胰蛋白酶150U/g，水解30min，进一步按原料(蛋白)的重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶450U/g，水解180min，控制固形物浓度15％w/v，酶解结束后，升温至95℃，灭酶15min，获得水解产物；

(6)将上述水解产物经碟片离心机5000r/min，除掉未酶解完全的不溶性蛋白和油脂，获得小分子蛋白肽的酶解液；

(7)将上述酶解液经50nm陶瓷膜系统进行微滤，除掉悬浮物、菌体、大分子蛋白杂质，滤液的澄清；

(8)将上述澄清的滤液通过10K Da分子量有机超滤膜系统进行分级纯化，除掉大于10K Da分子量大分子蛋白、色素等杂质，提高产品纯度；

(9)通过150～180Da分子量纳滤膜系统进行纳滤，脱除料液中的一价盐，同时对产品进行浓缩，固形物浓度达到25％；

(10)将上述截留液，经喷雾干燥，进料温度200℃，出风温度85℃，控制水分≤6.0％，得到鱼蛋白肽成品。

经检测：本实施例所制得的蛋白肽具有以下特征：

(1)外观：粉末状；

(2)色泽：乳白色；

(3)滋味、风味：具有本品特有的滋味和气味，无异味；

(4)技术指标：总氮(以干基计，g/100g)≥14.0；肽含量(以干基计，g/100ml)≥70；相对分子质量小于5000u的蛋白质水解物所占比例(％)≥85；水分(％)≤6.0；灰分(％)≤7.0；无机砷(以As计，mg/kg)≤0.5；铅(以Pb计，mg/kg)≤1.0；甲基汞(mg/kg)≤0.5；镉(以Cd计，mg/kg)≤0.1；多氯联苯a(mg/L)≤0.5；菌落总数(cfu/g)≤10000；大肠菌群(MPN/100g)≤40；霉菌/(CFU/g)≤50；致病菌不得检出。

经高效液相色谱仪检测(检测依据：GB/T22492-2008)：得出本实施例所制得的蛋白肽的分子量分布结果参见表1，从表1可知：该蛋白肽的平均分子量为346。

表1 沙丁鱼蛋白肽分子量分布结果

分子量范围	峰面积百分比(％，λ22nm)	数均分子量	重均分子量
				>5000	0.12	6412	6645
5000-3000	0.29	3655	3731
				3000-2000	0.49	2396	2428

2000-1000	2.53	1254	1302
				1000-500	16.74	616	639
500-180	52.39	257	282
				<180	27.44	/	/

实施例2

本实施例所述海洋鱼蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)以100kg的蓝圆鲹为原料，去除鱼头和内脏(由于鱼头、内脏和黑膜等含有较高油脂和腥苦味物质，故去除)，流水清洗血污、黑膜等物，沥干称重，计算得率；

(2)将上述预处理原料鱼经采肉机采肉，鱼皮鱼骨作为胶原蛋白肽原料回收，采肉的目的主要是利用鱼肉的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白；

(3)将上述鱼肉用碱性盐水按重量比为1:4的比例在超声波清洗槽中进行漂洗10min，频率36K/HZ，然后用清水按鱼肉和水的重量比为1:6.5在超声波清洗槽中进一步漂洗25min，频率36K/HZ；所述碱性盐水为：0.15％碳酸氢钠:0.1％食盐水＝1:1(v/v)；

(4)将上述经漂洗的鱼肉加水升温至85℃，加热20min，然后经板式换热器，将温度快速降温至5℃，静置沉降30min，将上液及油脂部分去除，得到无腥味色素的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白；

(5)将上述目标鱼细胞内蛋白加水调至底物浓度40％(料液比，W/V)，然后升温至60℃，按原料重量添加胰蛋白酶120U/g，水解25min，进一步按原料重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶350U/g，水解170min，控制固形物浓度12％，酶解结束后，升温至95℃，灭酶12min，获得水解产物；

(6)将上述水解产物经碟片离心机5000r/min，除掉未酶解完全的不溶性蛋白和油脂，获得小分子蛋白肽的酶解液；

(7)将上述酶解液经50nm陶瓷膜系统进行微滤，除掉悬浮物、菌体、大分子蛋白杂质，滤液的澄清；

(8)将上述澄清的滤液通过10KDa分子量有机超滤膜系统进行分级纯化，除掉大于10K Da分子量大分子蛋白、色素等杂质，提高产品纯度；

(9)通过150～180Da分子量纳滤膜系统进行纳滤，脱除料液中的一价盐，同时对产品进行浓缩，固形物浓度达到22％；

(10)将上述截留液，经喷雾干燥，进料温度190℃，出风温度80℃，控制水分≤6.0％，得到鱼蛋白肽成品。

经检测：本实施例所制得的蛋白肽具有以下特征：

(1)外观：粉末状；

(2)色泽：乳白色；

(3)滋味、风味：具有本品特有的滋味和气味，无异味；

(4)技术指标：总氮(以干基计，g/100g)≥14.0；肽含量(以干基计，g/100ml)≥70；相对分子质量小于5000u的蛋白质水解物所占比例(％)≥85；水分(％)≤6.0；灰分(％)≤7.0；无机砷(以As计，mg/kg)≤0.5；铅(以Pb计，mg/kg)≤1.0；甲基汞(mg/kg)≤0.5；镉(以Cd计，mg/kg)≤0.1；多氯联苯a(mg/L)≤0.5；菌落总数(cfu/g)≤10000；大肠菌群(MPN/100g)≤40；霉菌/(CFU/g)≤50；致病菌不得检出。

经高效液相色谱仪检测(检测依据：GB/T22492-2008)：得出本实施例所制得的蛋白肽的平均分子量为352。

实施例3

本实施例所述海洋鱼蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)以100kg的鳀鱼为原料，清洗予以割开腹或开背，去除鱼头和内脏(由于鱼头、内脏和黑膜等含有较高油脂和腥苦味物质，故去除)，流水清洗血污、黑膜等物，沥干称重，计算得率；

(2)将上述预处理原料鱼经采肉机采肉，鱼皮鱼骨作为胶原蛋白肽原料回收，采肉的目的主要是利用鱼肉的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白；

(3)将上述鱼肉用碱性盐水按重量比为1:5的比例在超声波清洗槽中进行漂洗20min，频率38K/HZ，然后用清水按肉和水的重量比为1:8的比例在超声波清洗槽中进一步漂洗35min，频率38K/HZ；该步骤中是通过高频率超声振动和漂洗方式高效率去除鱼肉中的部分油脂和色素类物质，由于油脂含有腥味物质，且极易造成产品氧化哈败，而色素类物质是影响产品色泽的主要因素；所述碱性盐水为：0.15％w/v碳酸氢钠:0.1％w/v食盐水＝1:1(v/v)；

(4)将上述经漂洗的鱼肉加水升温至95℃，加热10min，然后经板式换热器，将温度快速降温至2℃，静置沉降20min，将上液及油脂部分去除，得蛋白，该蛋白为无腥味色素的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白，为鱼细胞内蛋白；

(5)将上述蛋白加水调至底物浓度30％(料液比，W/V)，然后升温至45℃，按原料重量添加胰蛋白酶100U/g，水解35min，进一步按原料重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶250U/g，水解190min，控制固形物浓度10％，酶解结束后，升温至95℃，灭酶10min，获得水解产物；胰蛋白酶适度水解获得10k～50kDa大分子蛋白肽类产物，进一步通过枯草芽孢杆菌蛋白酶进行内切，获得小分子蛋白肽产物；

(6)将上述水解产物经离心速度为5000r/min的碟片离心机离心，以除掉未酶解完全的不溶性蛋白和油脂，获得小分子蛋白肽的酶解液；

(7)将上述酶解液经50nm陶瓷膜系统进行微滤，除掉悬浮物、菌体、大分子蛋白杂质，得澄清的滤液；

(8)将上述澄清的滤液通过10KDa分子量的有机超滤膜系统进行分级纯化，除掉大于10KDa分子量大分子蛋白、色素等杂质，提高产品纯度；

(9)通过150～180Da分子量纳滤膜系统进行纳滤，得截留液；纳滤的主要目的在于脱除料液中的一价盐，同时对产品进行浓缩，固形物浓度达到20％；

(10)将上述截留液，经喷雾干燥，进料温度180℃，出风温度75℃，控制水分≤6.0％，得到鱼蛋白肽成品。

经检测：本实施例所制得的蛋白肽具有以下特征：

(1)外观：粉末状；

(2)色泽：乳白色；

(3)滋味、风味：具有本品特有的滋味和气味，无异味；

(4)技术指标：总氮(以干基计，g/100g)≥14.0；肽含量(以干基计，g/100ml)≥70；相对分子质量小于5000u的蛋白质水解物所占比例(％)≥85；水分(％)≤6.0；灰分(％)≤7.0；无机砷(以As计，mg/kg)≤0.5；铅(以Pb计，mg/kg)≤1.0；甲基汞(mg/kg)≤0.5；镉(以Cd计，mg/kg)≤0.1；多氯联苯a(mg/L)≤0.5；菌落总数(cfu/g)≤10000；大肠菌群(MPN/100g)≤40；霉菌/(CFU/g)≤50；致病菌不得检出。

经高效液相色谱仪检测(检测依据：GB/T22492-2008)：得出本实施例所制得的蛋白肽的平均分子量为338。

对比例1

本对比例所述海洋鱼蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤(3)中将鱼肉用碱性盐水按重量比为1:7的比例在超声波清洗槽中进行漂洗15min，频率45K/HZ，然后用清水按肉的水的重量比为1:10的比例在超声波清洗槽中进一步漂洗30min，频率45K/HZ，通过高频率超声振动和漂洗方式高效率去除鱼肉中的部分油脂和色素类物质；所述碱性盐水为：0.2％w/v碳酸氢钠:0.2％w/v食盐水＝1:1(v/v)。

经检测：本对比例所制得的蛋白肽为灰色，且腥味较浓烈。

对比例2

本对比例所述海洋鱼蛋白肽的制备方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于：步骤(5)中胰蛋白酶的添加量为200U/g，水解40min，进一步按原料(蛋白)的重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶460U/g，水解200min。

经高效液相色谱仪检测(检测依据：GB/T22492-2008)：得出本对比例所制得的蛋白肽的平均分子量为223。

实施例4 功效评价

一、实验目的

通过对比分析评价实施例1所制得的沙丁鱼蛋白肽粉增强免疫力功能的作用。

二、实验方法

2.1 供试品

2.1.1 名称：沙丁鱼蛋白肽粉；

2.1.2 性状：乳白色粉末；

2.1.3 保存条件：密封2～8℃。

2.2 对照品

2.2.1 名称：乌鸡人参口服液(购自：北京同仁堂健康药业股份有限公司)；

2.2.2 性状：棕色液体；

2.2.3 规格：10mL/支；

2.2.4 保存条件：常温、密封。

2.3 试验用溶媒：纯净水，广东省医学实验动物中心自制。

2.4 试验动物

2.4.1 种属品系和级别：BALB/c小鼠、Hartley豚鼠，SPF级；

2.4.2 数量及性别：BALB/c小鼠280只，雄性；Hartley豚鼠5只，雄性；

2.4.3 试验开始时体重：小鼠18.0～22.0g；Hartley豚鼠355.6～472.2g；

2.4.4 提供单位：广东省医学实验动物中心，小鼠质量合格证明编号：44007200008675、4007200008403、44007200008471、44007200008584；豚鼠质量合格证明编号：44007200009223；

2.4.5 识别方法：采用被毛染色法。使用饱和苦味酸对动物进行编号，在动物体表不同部位的被毛涂染斑点，以示不同号码。以动物皮肤染色和笼具编号双重标记识别；

2.4.6 选用理由：根据《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》推荐使用。

2.4.7 动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2013-0002。动物饲养条件：4～5只/箱，群养，饲养温度与湿度：20～26℃，40～70％，采用10h:14h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。自由进食和饮水，颗粒饲料和纯净水均由广东省医学实验动物中心提供；

2.4.8 检疫：对购入小鼠检疫3～5天，每天观察小鼠，未发现不健康的小鼠；据试验方案，将小鼠按14只/组分组进行试验，其余淘汰。

2.5 主要试验仪器与试剂

2.5.1 主要仪器：

Multiskan GO全波长酶标仪：Thermo Fisher Scientific金司产品；CKX41型倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；SW-CJ-2FD型超净工作台：苏州净化有限公司；7093508型打孔器：Harris us Pat产品；LMQ.C型全自动灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司产品；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司产品；HWS-28型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；TGL-16B型小型台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂产品；MIKR020型台式小容量离心机：德国Hettich产品；5418台式高速离心机：德国EPPENDORF产品；TDL-5-A型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；KDC-2046型低速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司产品；BS-3000A型电子天平：上海友声衡器有限公司产品；MS3digital型振荡器：德国IKA公司产品。ACS系列电子天平：精度0.1g，中山市衡新电子有限公司产品；CCL-170B-8-UV型C02培养箱：ESCO产品；MS 3digital型振荡器：德国IKA公司产品。FACSAria型流式细胞仪：(FACS Calibur)为美国Becton Dickinson公司严品。

2.5.2 主要试剂：

RPMI1640培养基：批号：8113342、GIBCO公司产品，胎牛血清(fetalbowne serum，FBS)：批号：1227693，GIBCO公司产品；青/链霉素双抗：批号：13122301，杭州吉诺生物医药有限公司产品；Hank’s：批号：13111303，杭州吉诺生物医药有限公司产品；ConA：批号：666k7031；台盼兰：由广州威佳科技有限公司提供；印度墨汁：批号：BM201012，齐云生物技术有限公司；Na₂CO₃：批号：200710128，广州市番禺力强化工厂产品；琼脂糖：批号：100315，北京陆桥技术有限责任公司；SRBC：广州鼎国生物科技有限公司；巴比妥酸：批号：091110，国药集团化学试剂有限公司；氯化镁：批号：091110，广州市中南化学试剂有限公司；氯化钠：批号：20070914，天津市福晨化学试剂厂；氯化钙：批号：20081052901，广州化学试剂工厂；巴比妥钠：SBH-BIO；D-葡萄糖：批号：20110303，天津市福晨化学试剂厂；乳酸锂、硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Triton均由广州威佳科技有限金司提供；

2.5.2.1 主要试剂的配制：

RPMI1640完全培养液：在500mL RPMI1640液体培养液中加入5.6mL青霉素一链霉素溶液(100×)，胎牛血清56mL，混匀。

0.1％Na₂CO₃溶液配制：取0.4g Na₂CO₃溶于蒸馏水，定容至400mL。

表层培养基：1g琼脂糖加双蒸水至100mL。

LDH基质液：将5×10^-2mol/L乳酸锂、6.6×10^-4mol/L硝基氯化四氮哗(INT)、2.8×10^-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、1.3×10^-3mol/L氧化型辅酶I(NAD)溶于0.2mol/LTris-HCl缓冲液中(pH8.2)，现配现用。

2.6 剂量设计和样品配制

2.6.1 剂量设计：

根据委托方提供的剂量设计资料，剂量设计：根据委托方提供的剂量设计资料，受试物高、中、低剂量组的剂量分别为3g·kg^-1·d^-1、1.5g·kg^-1·d^-1、0.75g·kg^-1·d^-1。乌鸡人参口服液，小鼠按5mL·kg^-1·d^-1剂量给药。

2.6.2 供试品和对照品配制方法：

用电子天平分别准确称6.75g供试品于无菌离心，加入纯净水，得45mL浓度为150mg/mL的高剂量溶液，取20mL高剂量溶液加人纯净水，得40mL浓度为75mg/mL的中剂量溶液，取15mL中剂量溶液加入纯净水，得30mL浓度为37.5mg/mL的低剂量溶液。

2.6.3 乌鸡人参口服液配制：

准确量取一定体积的乌鸡人参口服液原液置于量筒中，向量筒内加入适量的纯净水(即乌鸡人参口服液原液：加入的纯净水体积比为1:3)，得浓度为25％的乌鸡人参口服液用于乌鸡人参口服液组。

2.7 实验方法

2.7.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

BALB/c小鼠70只，SPF级，雄性，实验开始时体重：18.0～19.8g。检疫合格后，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，14只/组，共5组。各组小鼠每天按0.2mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/天，连续30天。每天观察记录动物的日常情况1次；每周称量小鼠体重1次。于末次给药后1h，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用1mL注射器轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3.0×10⁶个/mL。将每一份脾细胞悬液分成6个孔加入96孔培养板中，每孔100μL。三孔加10μL ConA液(相当于5μg/mL)，另三孔作为对照，置5％CO₂，37℃培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔加入50μ/L(5mg/mL)MTT，继续培养4h。1000r离心10min。每孔加入180μL DMSO，摇床处理10min使晶体充分溶解，酶标仪检测各孔吸光度值，测定波长为570nm。

2.7.2 抗体生成细胞测定试验

2.7.2.1 补体的制备

采集豚鼠血，分离出血清(5只豚鼠的混合血清)，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清液，分装，-80℃保存(d28)。用时以SA缓冲液按1:8稀释。

2.7.2.2 BALB/c小鼠70只，SPF级，雄性，实验开始时体重：18.0～20.8g。检疫合格后，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，14只/组，共5组。各组小鼠每天按0.2mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/天，连续30天。SRBC免疫小鼠：给药d25，取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，压积SRBC用生理盐永配成2％(V/V)的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2mL。SRBC免疫小鼠4天后(d30)，末次给药1h，称重，颈椎脱臼处死，取脾脏进行抗体生成细胞检测。将脾脏放在盛有Hank's液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目晒网过滤，用Hand's洗2遍，最后将细胞悬浮在5mLRPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4，2倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，20μL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的薄片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1～1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。

2.7.3 小鼠碳廓清试验

2.7.3.1 单核一巨噬细胞吞噬功能及免疫器官重量的测定试验

BALB/c小鼠70只，SPF级，雄性，实验开始时体重：18.0～20.8g。检疫合椿后，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，14只/组，共5组。各组小鼠每天按0.2mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/天，连续30天。末次给药满1h，按10mL/kg体重从尾静脉注射稀释的印度墨汁(25％印度墨汁:生理盐水＝1:3)，待墨汁注射完毕，立即计时。注入墨汁后2min和10min，分别从眼眶静脉丛采血20μL，立即加入到2mL 0.1％Na₂CO₃溶液中，以Na₂CO₃溶液作空白对照，用分光光度计在600nm波长处测定OD值，计算吞噬指数a，并测定脾脏指数、肝脏指数和胸腺指数。

$K=\frac{\lg {\mathrm{OD}}_1-\lg {\mathrm{OD}}_2}{t_2-t_1}$

2.7.4 NK细胞活性测定试验

BALB/c小鼠99只，SPF级，雄性，实验开始时体重：19.5～22.4g。检疫合格后，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，14只/组，共5组。各组小鼠每天按0.2mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/天，连续30天。每天观察记录动物的日常情况1次；每周称量小鼠体重1次。

脾细胞悬液制备：末次给药1h，解剖小鼠，无菌取出胸腺、脾脏，并称量其重量，计算脏器系数。同时将脾脏置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目晒网过滤。弃上清，将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank's液及8mLHank's液，1000rpm，10min离心，用1mL RPMI 1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台盼兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。

NK细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH墓质液100μL，室温反应5min，每孔加入1mol/L的HC130μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。

2.8 统计分析及结果判定

2.8.1 对小鼠的体重、淋巴细胞转化光密度差值、小鼠吞噬指数a、NK细胞活性、脾脏指数、肝脏指数和胸腺指数进行统计处理并列表说明；将原始数据以均数加减标准差表示采用SPSS21.0方差分析样品组与对照组间的差异显著性检验。

2.8.2 淋巴细胞增殖力：若受试样品组的光密度差值显著高于模型对照组的光密度差值，可判定ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验结果阳性。

2.8.3 抗体生成细胞测定：用空斑数/10⁶脾细胞表示，受试样品组的空斑数显著高于模型对照组的空斑数，可判定该项试验结果阳性。

2.8.4 小鼠碳廓清试验：若受试样品组的吞噬指数显著高于模型对照组的吞噬指数，可判定该项试验结果阳性。

2.8.5 NK细胞活性测定：受试样品组的NK细胞活性显著高于模型对照组的NK细胞活性，即可判定该项试验结果阳性。

2.8.6 综合判定：

2.8.6.1 增强免疫力功能判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力功能。

2.8.6.2 细胞免疫功能结果判定：细胞免疫功能测定项目中的小鼠淋巴细胞转化试验两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。

2.8.6.3 体液免疫功能结果判定：体液免疫功能测定项目中的抗体生成细胞两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。

2.8.6.4 单核一巨噬细胞功能结果判定：单核一巨噬细胞功能测定项目中的小鼠碳廓清的两个剂量组结果阳性，可判定单核一巨噬细胞功能结果阳性。

2.8.6.5 NK细胞活性结果判定：NK细胞活性测定试验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。

三、实验结果

3.1 细胞免疫功能的测定结果(见表2)

3.1.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(见表2)

淋巴细胞转化率：与阴性对照组相比，乌鸡人参口服液组小鼠的脾淋巴细胞转化OD值显著性升高(P<0.05)；供试品高剂量组小鼠的脾淋巴细胞转化OD值显著性增加(P<0.05)；供试品中、低剂量组小鼠的脾淋巴细胞转化OD值与阴性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。

综合以上试验结果，沙丁鱼蛋白肽粉高剂量(3g·kg^-1·d^-1)、乌鸡人参口服液(5mL·kg^-1·d^-1))对小鼠脾淋巴细胞转化试验结果为阳性。

3.2 体液免疫功能的测定结果(见表3)

3.2.1 抗体生成细胞试验

脏器指数：乌鸡人参口服液组，供试品低、中、高剂量组小鼠的脾脏指数均高于阴性对照组。但各组间的胸腺指数、脾脏指数均无统计学差异(P>0.05)。

与阴性对照组相比，乌鸡人参口服液组小鼠的空斑数极显著性升高(P<0.01)，供试品三个剂量组小鼠的空斑数均显著性增加(P<0.01)。

结果表明，乌鸡人参口服液，沙丁鱼蛋白肽粉三个剂量对F常小鼠抗体生成细胞测定试验结果为阳性。

3.3 单核-巨噬细胞功能测定结果(见表4)

3.3.1 小鼠碳廓清试验

脏器指数：各组间的胸腺指数、脾脏指数和肝脏系数均无统计学差异(P>0.05)。

吞噬指数：各组间的的吞噬指数无统计学差异(P<0.05)。

实验结果表明，乌鸡人参口服液、沙丁鱼蛋白肽粉对正常小鼠单核一巨噬细胞功能结果为阴性。

3.4 NK细胞活性测定结果(见表5)

与阴性对照组相比，乌鸡人参照组小鼠的NK细胞活性显著性升高(P<0.05)，供试品高剂量组小鼠的NK细胞活性显著性增加(P<0.05)；供试品中、低剂量组小鼠的NK细胞活性与阴性对照组相比无统计学差异(p>0.051。

实验结果表明，乌鸡人参口服液、沙丁鱼蛋白肽粉高剂量(3g·kg^-1·d^-1)对正常小鼠NK细胞活性测定结果为阳性。

四、结论

在本试验条件下，沙丁鱼蛋白肽粉对正常小鼠抗体生成细胞试验结果和NK细胞活性试验结果均为阳性。依据《保健食品检验与评价技术规菹》(2003版)增强免疫力的判断标准，沙丁鱼蛋白肽粉具有增强免疫力功能的作用。

表2 沙丁鱼蛋白肽粉对正常小鼠的ConA诱导脾淋巴细胞转化试验的影响

注：“*”表示与阴性对照组比较有极显著性差异P<0.05。乌鸡人参口服液的剂量单位为“mL·kg^-1·d^-1”

表3 沙丁鱼蛋白肽粉对正常小鼠的抗体生成测定试验的影响

注：“*”表示与阴性对照组比较有显著性差异P<0.01。乌鸡人参口服液的剂量单位为“mL·kg^-1·d^-1”

表4 沙丁鱼蛋白肽粉对正常小鼠的碳廓清试验的影响

注：“*”表示与阴性对照组比较有显著性差异P<0.05。乌鸡人参口服液的剂量单位为“mL·kg^-1·d^-1”

表5 沙丁鱼蛋白肽粉对正常小鼠的NK细胞活性测定试验的影响

注：“*”表示与阴性对照组比较有显著性差异P<0.05。乌鸡人参口服液的剂量单位为“mL·kg^-1·d^-1”

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将海洋鱼鱼肉用碱性盐水漂洗，再用水漂洗；所述碱性盐水是由体积比为0.9-1.1:0.9-1.1的浓度为0.13-0.17％w/v的碳酸氢钠水溶液和浓度为0.08-0.12％w/v的氯化钠溶液混合而成；

(2)将经步骤(1)处理的鱼肉加水升温至85-95℃，加热10-25min，后快速降温至2-5℃，静置，弃去上液和油脂，得蛋白；

(3)于蛋白中加水，调至体系中蛋白的浓度为30-50％w/v，后升温至45-60℃，按蛋白的重量添加胰蛋白酶100-150U/g，水解25-35min，再按蛋白的重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶250～450U/g，水解170-190min，控制固形物的浓度为10-15％w/v，灭酶，得水解产物；

(4)将水解产物于4500-5500r/min的速度下离心，得酶解液；

(5)将酶解液经45-50nm陶瓷膜微滤，后经10kDa的有机超滤膜进行分级纯化，再经150-180Da的纳滤膜进行纳滤。

2.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述碱性盐水漂洗的具体方法为：按重量比为1:3-5，将海洋鱼鱼肉用碱性盐水于频率为32-38K/HZ的条件下超声漂洗10-20min。

3.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述水漂洗的具体方法为：按重量比为1:5-8，将经碱性盐水漂洗过的海洋鱼鱼肉用水于频率为32-38K/HZ的条件下超声漂洗25-35min。

4.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将经步骤(1)处理的鱼肉加水升温至90-95℃，加热10-20min。

5.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中按蛋白的重量添加胰蛋白酶140-150U/g，水解30-35min。

6.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中按蛋白的重量添加枯草芽孢杆菌蛋白酶440-450U/g，水解178-182min。

7.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱性盐水是由体积比为1:1的浓度为0.15％w/v的碳酸氢钠水溶液和浓度为0.1％w/v的氯化钠溶液混合而成。

8.根据权利要求1所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的灭酶的温度为95-100℃，时间为10-15min。

9.根据权利要求1-8任一项所述的海洋鱼蛋白肽的制备方法，其特征在于，还包括步骤(6)浓缩和喷雾干燥；所述喷雾干燥的条件为：进料温度180～200℃，出风温度75～85℃，控制水分≤6.0％。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的海洋鱼蛋白肽。