CN102120984B - 一种大豆抗原蛋白过敏细胞模型及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆抗原蛋白过敏细胞模型及其应用。本发明提供大豆抗原蛋白过敏细胞模型，通过如下步骤获得：将肥大细胞与IgE抗体共孵育，孵育后的细胞，即为大豆抗原蛋白过敏细胞模型。本发明的实验证明，本发明的大豆抗原蛋白体外肥大细胞活化模型可以特异性检测大豆抗原蛋白抗原活性的，可满足饲料行业、食品行业相关企业单位高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品中大豆抗原蛋白抗原活性的需要，以及应用于筛选和鉴定抗大豆抗原蛋白过敏的有效药物/添加剂的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆抗原蛋白过敏细胞模型及其应用。
背景技术
大豆作为人和动物优质的植物蛋白和油脂来源，具有极高的营养价值。其所含蛋白质约占大豆籽粒的40％。但是，大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、凝集素、异黄酮、抗原蛋白等多种抗营养因子。其中大豆抗原蛋白是大豆中能引起人和畜禽过敏反应的一类蛋白质，主要包括：大豆疏水蛋白(免疫学命名为Gly m1)、大豆壳蛋白(Gly m2)、大豆抑制蛋白(Gly m3)、大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白(glycinin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)等。目前研究证实，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是含量最丰富，免疫原性较强的大豆抗原蛋白，两者共占大豆籽实总蛋白的65-80％。
研究表明，在大豆抗原蛋白分子上有IgE抗原决定簇，被人和动物食入后，可引起致敏人群或动物体内IgE抗体升高，从而导致过敏反应的发生。此外，值得重视的是，某些种类的大豆抗原蛋白如大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白具有热稳定特性，普通的热处理对其破坏作用较小。例如，烘烤大豆粉中具有抗原活性的大豆抗原蛋白残留量仍高达18％，这个量足以引起婴儿的过敏反应。
由于抗原活性的存在，大豆抗原蛋白对仔猪、犊牛及其它幼龄畜禽的生长和健康造成了一定的危害。因此，将大豆进行适当的加工处理以减少或消除大豆抗原蛋白的抗原活性成了当前科学界的一个重要研究目标。目前已证实，豆粕、膨化大豆、发酵豆粕、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白等大豆制品的抗原活性低于生大豆。但是，在大豆加工参数和大豆抗原蛋白抗原活性的致敏临界值方面还没有一个统一的认识，其原因主要是大豆抗原蛋白种类繁多，抗原活性的定量检测技术非常薄弱。已有的定量检测方法主要以抗血清测定、单克隆抗体ELISA技术、高效液相色谱分析、动物过敏性模型评价为主。这些方法从免疫学角度来看仍存在一定的缺陷，抗血清测定检测的灵敏度较低，而且重复性差；单克隆抗体ELISA技术需要针对每种大豆抗原蛋白分别制备单克隆抗体，然后制备试剂盒，工程复杂而工作量巨大；高效液相色谱分析则无法体现免疫反应性，并且由于前处理过程繁琐和需要昂贵的专门仪器而难以广泛应用于大豆制品的现场检测；同时，以上三种方法作为体外检测方法，检测的结果仅代表某种大豆抗原蛋白的含量，并不能直接显示其抗原性的强弱。过敏性动物模型作为唯一的体内过敏性评价方法，虽然可以直接显示过敏性强弱，但难以定量，同时完成评价需要大量的动物，工作量大，个体差异明显，而且不符合动物保护和动物福利原则。
RBL细胞是1973年由英国学者Eccleston等从嗜碱性白血病大鼠中分离得到的；RBL-2H3细胞系是由美国Barsumian研究小组(1981)将RBL反复克隆获得的亚系。由于RBL-2H3细胞系具有永生化特性，培养方法简单，体外脱颗粒方法容易重复，所以是建立脱颗粒模型的最佳选择。以前认为RBL细胞系是一种嗜碱性细胞，但近些年在对其糖蛋白量、蛋白酶标志和超微结构等的研究后发现，它是一种粘膜型的肥大细胞，现已广泛用于研究肥大细胞体外脱颗粒的研究和运用。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备大豆抗原蛋白过敏细胞模型的方法。
本发明提供的制备大豆抗原蛋白过敏细胞模型的方法，包括如下步骤：
将肥大细胞与大豆抗原蛋白特异性IgE抗体共孵育，孵育后的细胞，即为大豆抗原蛋白过敏细胞模型。
所述大豆抗原蛋白特异性IgE抗体通过如下方法制备：将大豆抗原蛋白免疫动物，得到抗血清，即得到大豆抗原蛋白特异性IgE抗体；
所述大豆抗原蛋白为大豆总抗原蛋白、大豆胰蛋白酶抑制因子、β-伴大豆球蛋白和/或大豆球蛋白。
所述大豆抗原蛋白过敏细胞模型为如下1)-4)中任一所述过敏细胞模型：
1)为通过如下方法制备：将肥大细胞和大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清共孵育，得到孵育后的细胞，即为大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型；
2)为通过如下方法制备：将肥大细胞和大豆总抗原蛋白抗血清共孵育，得到孵育后的细胞，即为大豆总抗原蛋白过敏细胞模型；
3)为通过如下方法制备：将肥大细胞和β-伴大豆球蛋白抗血清共孵育，得到孵育后的细胞，即为β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型；
4)为通过如下方法制备：将肥大细胞和大豆球蛋白抗血清共孵育，得到孵育后的细胞，即为大豆球蛋白过敏细胞模型。
所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清通过如下方法制备：将大豆胰蛋白酶抑制因子免疫动物，分离血清，即得到大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清；
所述大豆总抗原蛋白抗血清通过如下方法制备：将大豆总抗原蛋白免疫动物，分离血清，即得到大豆总抗原蛋白抗血清；
所述β-伴大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备：将β-伴大豆球蛋白免疫动物，分离血清，即得到β-伴大豆球蛋白抗血清；
所述大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备：将大豆球蛋白免疫动物，分离血清，即得到大豆球蛋白抗血清。
所述肥大细胞为RBL-2H3细胞；
所述动物为大鼠，所述大鼠的品种名为Brown Norway。
所述共孵育的温度为37℃，所述共孵育的时间为6小时-12小时，所述共孵育的时间具体为6小时、10小时或12小时。
所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型中，所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清与所述肥大细胞的配比为10ul∶(0.5×105-2×105)个细胞，所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清与所述肥大细胞的配比具体为10ul∶0.5×105个细胞、10ul∶1×105个细胞或10ul∶2×105个细胞；
所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型中，所述β-伴大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比为10ul∶(0.5×105-2×105)个细胞，所述β-伴大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比具体为10ul∶0.5×105个细胞、10ul∶1×105个细胞或10ul∶2×105个细胞；
所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型中，所述大豆总抗原蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比为10ul∶(0.5×105-2×105)个细胞，所述大豆总抗原蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比具体为10ul∶0.5×105个细胞、10ul∶1×105个细胞或10ul∶2×105个细胞；
所述大豆球蛋白过敏细胞模型中，所述大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比为10ul∶(0.5×105-2×105)个细胞，所述大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比具体为10ul∶0.5×105个细胞、10ul∶1×105个细胞或10ul∶2×105个细胞；
所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型的共孵育体系由1×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ul大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清组成；
所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ulβ-伴大豆球蛋白抗血清组成；
所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ul大豆总抗原蛋白抗血清组成；
所述大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ul大豆球蛋白抗血清组成；
所述孵育后的细胞为共孵育结束后48小时内的细胞。
所述β-伴大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104，具体为不低于1∶4×104，尤其优选为1∶4×104；用于检测所述β-伴大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述β-伴大豆球蛋白的量为2μg；
所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104，具体为不低于1∶4×104，尤其优选为1∶1×105；用于检测所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆胰蛋白酶抑制因子，所述大豆胰蛋白酶抑制因子的量为2μg；
所述大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104，具体为不低于1∶4×104，尤其优选为1∶4×104；用于检测所述大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆球蛋白，所述大豆球蛋白的量为2μg；
所述大豆总抗原蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104，具体为不低于1∶4×104，尤其优选为1∶1×105；用于检测所述大豆总抗原蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述大豆总抗原蛋白的量为2μg。
由所述方法制备的细胞模型也是本发明保护的范围。
所述大豆总抗原蛋白是指是大豆中能引起人和畜禽过敏反应的一类蛋白质，包括：大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白。
所述大豆总抗原蛋白通过如下方法制备，也可以商购：
将大豆依次进行脱皮、磨浆、过滤、滤液脱脂、溶解，即得到总抗原蛋白；
所述滤液脱脂为向所述过滤得到的滤液加入乙醚混匀，旋转蒸发去除乙醚，得到脱脂大豆粉；
所述溶解为将所述脱脂大豆粉和含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液混合，得到总抗原蛋白。
所述脱脂大豆粉和含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液的配比为1g∶20ml；
所述含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱和β-巯基乙醇，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述缓冲液中的浓度为0.03M，所述β-巯基乙醇在所述缓冲液中的浓度为10mM。
所述β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白分别通过如下方法制备，也均可以商购：
将上述得到的大豆总抗原蛋白在10,000rpm/min离心30min，收集上清液；HCl调节pH至6.4，10,000rpm/min(4℃)离心30min，分别收集上清液A和沉淀A；
上清液A用HCl调节pH至4.8，15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀；0.03M的Tris-HCl(pH 8.0，10mM β-巯基乙醇)溶解沉淀，调节pH至6.2，15,000rpm/min(4℃)离心30min，取上清液；调节pH至7.6，加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达51％，4℃静置过夜，15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀；溶解于pH 7.6浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达90％，4℃静置过夜，15,000rpm/min(4℃)离心30min，收集沉淀；将沉淀溶于pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，即得到β-伴大豆球蛋白；
沉淀A用磷酸盐缓冲液(向浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中加入β-巯基乙醇，所述β-巯基乙醇在磷酸盐缓冲液中的浓度为10mmol/L，pH为8.0)溶解，离心收集上清液。加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达51％，4℃静置过夜。15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀，溶解于pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达90％，4℃静置过夜。15,000rpm/min(4℃)离心30min，沉淀溶于pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，即得到获得大豆球蛋白。
所述pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配方如下：8.00g NaCl、0.20gKCl、0.20g KH2PO4、1.15g Na2HPO4·12H2O，加蒸馏水至1000mL，用1mol/L的NaOH调PH为7.6。
所述的大豆抗原蛋白过敏细胞模型在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用；
所述的多克隆抗体在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用；以上应用均是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明提供的体外肥大细胞致敏模型，可以特异性检测大豆抗原蛋白抗原活性，克服了传统的SDS-PAGE、多抗血清、单克隆抗体ELISA检测方法不能直接检测抗原活性、灵敏度和准确性低、不同实验室之间不能参比的缺点，客服了传统的过敏性动物评价实验难以定量、需要大量的动物、个体差异明显、不符合动物保护和动物福利原则的缺点。其检测可以定量、准确性和灵敏度高，而成本很低，不同实验室可以参比和重复。应用于种植业、饲料行业、食品行业高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品、豆粕饲料中大豆抗原蛋白抗原活性的定量检测。
具体而言可应用于：
(1)应用于种植业、饲料行业、食品行业高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品、豆粕饲料中大豆抗原蛋白抗原活性的定量检测。
(2)应用该抗体作为研究大豆抗原性的工具，进行大豆种质资源筛选、品种改造；
(3)应用该抗原性评价方法取代动物实验，应用于大豆、豆粕、豆制品、豆粕饲料中大豆抗原蛋白抗原活性的评价和研究；
(4)运用该细胞模型和特异的β-氨基己糖苷酶酶活性分析检测方法，用于临床诊断或辅助诊断对大豆食物过敏的患者/患病畜禽；
(5)运用该细胞模型和酶活性测定方法筛选、评价和鉴定具有抗过敏活性的药物/添加剂；
(6)应用该细胞模型和酶活性测定方法，进行药理学研究，用于治疗大豆抗原蛋白所致过敏性疾病。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析纯化的大豆抗原蛋白样品
图2为不同激发时间RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶的释放率测定
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、细胞模型的制备
一、大豆抗原蛋白的提取和纯化
大豆胰蛋白酶抑制因子购买自Sigma公司，目录号93620；
大豆(拉丁名Glycine max，品种为黑农38，购自北京德宝群兴农业科技有限公司。)脱皮后磨浆，过滤后的滤液用乙醚萃取脱脂，经旋转蒸发除去残留乙醚，制得脱脂大豆粉；在25℃条件下，向脱脂大豆粉中加入0.03M的Tris-HCl(pH 8.0，10mMβ-巯基乙醇)缓冲液(脱脂大豆粉与Tris-HCl的比例为1g脱脂大豆粉：20mlTris-HCl)，溶解，得到大豆总抗原蛋白溶液，即得到大豆总抗原蛋白。
将上述得到的大豆总抗原蛋白溶液在10,000rpm/min离心30min，收集上清液；HCl调节pH至6.4，10,000rpm/min(4℃)离心30min，分别收集上清液A和沉淀A。
上清液A用HCl调节pH至4.8，15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀；0.03M的Tris-HCl(pH 8.0，10mM β-巯基乙醇)溶解沉淀，调节pH至6.2，15,000rpm/min(4℃)离心30min，取上清液；调节pH至7.6，加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达51％，4℃静置过夜，15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀；溶解于pH 7.6浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达90％，4℃静置过夜，15,000rpm/min(4℃)离心30min，收集沉淀；将沉淀溶于pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，即得到β-伴大豆球蛋白粗提液。
沉淀A用磷酸盐缓冲液(向浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中加入β-巯基乙醇，所述β-巯基乙醇在磷酸盐缓冲液中的浓度为10mmol/L，pH为8.0)溶解，离心收集上清液。加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达51％，4℃静置过夜。15,000rpm/min(4℃)离心30min后收集沉淀，溶解于pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液。加入固体(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达90％，4℃静置过夜。15,000rpm/min(4℃)离心30min，沉淀溶于pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液中；获得大豆球蛋白(glycinin)粗提液。
以上β-伴大豆球蛋白粗提液和大豆球蛋白粗提液分别用琼脂糖凝胶Sepharose6B柱纯化。琼脂糖凝胶Sepharose 6B经真空脱气后装柱(100cm×2.6cm)，充分平衡后上样进行凝胶过滤，用pH 7.6的浓度0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱，核酸蛋白检测仪280nm检测，分别收集含有蛋白的洗脱液。将收集到的含有蛋白的洗脱液再经过DEAE-52层析柱(30cm×3.3cm)，用pH 7.6的浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(配方：8.00g NaCl、0.20g KCl、0.20g KH2PO4、1.15g Na2HPO4·12H2O，加蒸馏水至1000mL，用1mol/L的NaOH调PH为7.6)洗脱，收集蛋白洗脱液；将洗脱液于4℃对蒸馏水透析(透析袋的孔径1000D)除盐，冷冻干燥，得到纯化的β-伴大豆球蛋白和纯化的大豆球蛋白。
将上述得到的大豆总抗原蛋白溶液和纯化后的β-伴大豆球蛋白采用SDS-PAGE电泳方法鉴定蛋白纯度、测定分子量，添加SDS的分离凝胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。以低分子量标准蛋白为标准进行电泳，电泳条件为恒压100V。电泳结束后用考马斯亮兰染色液染色6h以上，脱色观察。
结果如图1所示，其中1为分子Marker，2为纯化后的β-伴大豆球蛋白，3为大豆总抗原蛋白，从图中看出，得到了纯化的β-伴大豆球蛋白和大豆总抗原蛋白。
采用同样的方法检测纯化的大豆球蛋白，结果为得到纯化的大豆球蛋白。
二、多抗的制备
试验选用3周龄断奶的雄性BN(Brown Norway)大鼠(购自北京维通利华公司)，体重45-55g。大鼠饲喂在装有空调的房间内，温度维持在23℃，相对湿度为65％左右，昼夜光照交替时间为12/12h。单笼饲养，自由采食和饮水。随机分为2个处理：对照组和大豆抗原蛋白过敏原活化组，每组6只大鼠。试验日粮采用不含大豆及豆制品的玉米-淀粉-酪蛋白型半纯合日粮，配方见表1。
表1无大豆抗原蛋白的半纯合日粮的组成和营养成分
注：a微量元素预混料为每千克日粮提供：铁，45mg；锌，35mg；铜，6mg；锰，10mg；碘，0.2mg；钴，0.7mg；硒，0.17mg；镁，511mg；钾，3,600mg；氯，1,613mg；钠，1,033mg。
b维生素预混料为每千克日粮提供：维生素A，4,000IU；维生素D3，1,000IU；维生素E，75IU；维生素K3，0.86mg；维生素B1，5mg；维生素B2，6mg；维生素B3，15mg；维生素B5，30mg；维生素B6，6mg；维生素B7，0.2mg；维生素B9，2mg；维生素B12，0.025mg。
取一制备的纯化β-伴大豆球蛋白用生理盐水配成5mg/mL，与等量弗氏佐剂混合，利用旋涡混合器使其乳化完全，得到完全佐剂乳化抗原。选取健康雄性BN大鼠，首次免疫为背部随机选取两个位点，注射完全佐剂乳化抗原，选两个位点，每点0.2mL；首免后14d加强免疫，背部随机选取四点，消毒后皮下注射不完全佐剂乳化抗原(将抗原与不完全佐剂超声乳化得到不完全佐剂乳化抗原)，每点0.2mL；以后每隔10d加强免疫一次，连续三次加强免疫。最后一次加强免疫后10d，尾静脉直接注射提纯β-伴大豆球蛋白。对照组大鼠免疫相同剂量的生理盐水。
注射β-伴大豆球蛋白54天后，对大鼠进行心脏采血，分离抗血清，即为β-伴大豆球蛋白抗血清，采用间接ELISA法检测效价，其主要步骤如下：
首先将制备的纯化β-伴大豆球蛋白溶液用pH 9.6，浓度为0.85mol/L碳酸盐缓冲液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，蒸馏水1000ml)进行稀释，调整其浓度为20μg/mL，96孔酶标板每孔加入100μL进行包被(每孔实际用量为2μg)，37℃孵育3h。再以洗板液(50mM Tris，0.14M NaCl，0.05％吐温20，pH 8.0)洗涤三次，每次3min；以5％BSA封板，4℃过夜。将板洗涤三次后，每孔加入100μL 1∶10稀释的抗血清，37℃孵育2h。洗涤后每孔再加入100μL HRP标记的羊抗大鼠IgE抗体(购自Bethyl公司，目录号A110-116)(1∶2,000稀释)，37℃孵育1h。洗涤后每孔加入100μLTMB，37℃孵育20min；最后每孔加入100μL 2M的H2SO4终止反应，并用酶标仪于450nm测其吸光度值。
结果为β-伴大豆球蛋白抗血清的特异性IgE效价为1∶4×104，该抗血清即为β-伴大豆球蛋白多克隆抗体，-80℃保存备用。
采用同样的方法，分别用大豆胰蛋白酶抑制因子、纯化的大豆球蛋白和大豆总抗原蛋白溶液替代β-伴大豆球蛋白免疫得到大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清、大豆球蛋白抗血清、总抗原蛋白抗血清，采用上述间接ELISA法，分别将大豆胰蛋白酶抑制因子、纯化的大豆球蛋白和大豆总抗原蛋白溶液替代β-伴大豆球蛋白包被酶标板，分别检测上述三种抗血清中的特异性IgE效价，结果为大豆球蛋白抗血清的特异性IgE效价为1∶4×104；总抗原蛋白抗血清的特异性IgE效价为1∶1×105；大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清的特异性IgE效价为1∶1×105。
上述获得的大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清、大豆球蛋白抗血清、总抗原蛋白抗血清分别即分别为大豆胰蛋白酶抑制因子多克隆抗体、大豆球蛋白多克隆抗体、总抗原蛋白多克隆抗体。
采用同样的方法，用生理盐水替代纯化的β-伴大豆球蛋白，制得对照血清。
三、细胞模型获得
1、RBL-2H3细胞培养
复苏：准备37℃温水，将从液氮罐中取出RBL-2H3细胞(购自ATCC公司，目录号CRL-2256)迅速在37℃温水中融化，且不断搅动，转移细胞于培养瓶中培养，次日换液。将RBL-2H3细胞接种到75cm2培养瓶中，培养基为MEM(购自Hyclone公司，目录号H10520)，其中含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，细胞密度约为1×106/mL，置于37℃5％CO2培养箱中培养。
传代：细胞长到80％汇合时传代，平均2-3d传代一次。取待传代细胞培养瓶，轻弃培养液，预温浓度0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS少许轻洗一遍，弃去PBS；加少许0.25％胰酶，置于培养箱约1min，镜下观察细胞间隙扩大，细胞突起缩短；弃去消化液，加2-5mL新鲜培养液终止消化，轻轻吹打，待成单细胞悬液后转移至15mL尖底离心管，1,000rpm 4℃离心5min，用1mL新鲜培养液重悬细胞，按一定比例接种至含有培养液的培养瓶中，镜下观察细胞密度并移入培养箱。
冻存：生长对数期细胞约1×106，消化液消化数分钟；2-5mL新鲜培养液终止消化，吹打成单个细胞，1,000rpm离心8～10min；将细胞沉淀悬浮于1mL 10％DMSO冻存液中，转移至冻存管中；4℃放置2h；-20℃放置4h；液氮管口2h，最后放进液氮中。
2、细胞模型的制备
取对数生长期的RBL-2H3细胞500μL(含有MEM培养基和RBL-2H3细胞)接种于24孔培养板中，调整细胞密度为1×105/孔。将其与10μL β-伴大豆球蛋白抗血清，37℃5％CO2培养箱中共孵育12h，孵育后的细胞即为β-伴大豆球蛋白细胞模型；
取对数生长期的RBL-2H3细胞500μL接种于24孔培养板中，调整细胞密度为0.5×105/孔。将其与10μL大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清，37℃5％CO2培养箱中共孵育6h，孵育后的细胞即为大豆胰蛋白酶抑制因子细胞模型；
取对数生长期的RBL-2H3细胞500μL接种于24孔培养板中，调整细胞密度为2×105/孔。将其与10μL大豆球蛋白免抗血清抗血清，37℃5％CO2培养箱中共孵育10h，孵育后的细胞即为大豆球蛋白细胞模型；
取对数生长期的RBL-2H3细胞500μL接种于24孔培养板中，调整细胞密度为1×105/孔。将其与10μL总抗原蛋白抗血清，37℃5％CO2培养箱中共孵育12h，孵育后的细胞即为总抗原蛋白细胞模型；
采用上述方法用商购的大豆总抗原蛋白(购自北京德宝群兴农业科技有限公司)、β-伴大豆球蛋白(购自北京德宝群兴农业科技有限公司)和大豆球蛋白(购自北京德宝群兴农业科技有限公司)，分别获得大豆总抗原蛋白细胞模型1、β-伴大豆球蛋白细胞模型1、大豆球蛋白细胞模型1。
以上细胞模型中孵育后的细胞为共孵育结束后48小时内的细胞。
实施例2、细胞模型的验证和应用(检测大豆蛋白抗原的抗原性)
一、细胞模型的验证
1、提取的抗原验证
将上述共孵育后12小时(48小时内)的β-伴大豆球蛋白细胞模型弃去培养基，用Tyrode buffer(135mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，2mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2，5.6mmol/L glucose，1mg/mL BSA，20mmol/L Hepes)洗涤，去上清液，加入含0.5％胎牛血清的MEM培养基饥饿8-10h；再用Tyrode buffer洗两遍后，分别加入浓度为0、1、5、10和20μg/mL的β-伴大豆球蛋白Tyrode buffer(将纯化的β-伴大豆球蛋白用Tyrode buffer分别稀释为0、1、5、10和20μg/mL)，37℃孵育30min，4℃终止反应，收集上清液，即为β-伴大豆球蛋白待测样本；
向酶标板中分别加50μL β-伴大豆球蛋白待测样本和100μL 5mmol/L ρ-硝基苯基-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷(购自AppliChem公司，该糖苷的作用是作为β-氨基己糖苷酶的底物，用来检测该酶的活性；糖苷溶于0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液，pH4.5)，每样品做三个复孔，37℃孵育1.5h，加入200μL 0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.5)终止反应，在酶标仪上读取405nm的吸光度值。用未刺激的RBL-2H3加0.1％TritonX-100溶解细胞后，取上清液测定β-氨基己糖苷酶总活性。
按下面公式计算样品的β-氨基己糖苷酶释放(％)(细胞脱颗粒以β-氨基己糖苷酶释放率为指标)：
β-氨基己糖苷酶释放(％)＝(被刺激细胞上清液的吸光度值-非刺激细胞上清液的吸光度值)×100/(总细胞裂解液的吸光度值-非刺激细胞上清液的吸光度值)。
β-氨基己糖苷酶释放率直接代表的是致敏活性，对于大多数致敏物质(如本文中提到的4种致敏蛋白：大豆总抗原蛋白、大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白)而言，致敏活性基本等同于抗原活性。
采用上述方法，分别用大豆球蛋白细胞模型、总抗原蛋白细胞模型、大豆胰蛋白酶抑制因子细胞模型检测大豆球蛋白、总抗原蛋白、大豆胰蛋白酶抑制因子的抗原性。
以实施例1的三获得的对照血清为对照。
检测结果如表2所示。
表2RBL-2H3细胞体外脱颗粒的β-氨基己糖苷酶活性测定
注：*与正常血清组比差异显著(P＜0.05)，n＝3。
从上述可以看出，分别对于大豆总抗原蛋白、大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白而言，均建立了高效快捷的特异性过敏细胞模型，其最佳的抗原激发剂量为5-20ug/ml，优选5-10ug/ml。
采用上述方法，在β-伴大豆球蛋白细胞模型的培养孔中加入β-伴大豆球蛋白，终浓度为10μg/ml，37℃分别孵育15、30、45、60和90min，收集上清液，检测β-氨基己糖苷酶总活性。以对照血清为对照组。
结果如图2所示，从图中看出，β-伴大豆球蛋白细胞模型(大豆抗原蛋白)的肥大细胞脱颗粒最强的时间点为在45-90分钟，为了节约时间，45-60分钟优选。
采用同样的方法分别检测大豆球蛋白细胞模型、总抗原蛋白细胞模型、大豆胰蛋白酶抑制因子细胞模型中肥大细胞脱颗粒最强的时间点，结果与β-伴大豆球蛋白细胞模型无显著差异。
上述实验表明，检测到β-氨基己糖苷酶释放率可以直接评价待检样品中所含大豆抗原蛋白所致的致敏性。β-氨基己糖苷酶释放率超过基础水平，即可认为待检样品含有的大豆抗原蛋白具有致敏性。β-氨基己糖苷酶释放率的高低，代表了抗原致敏性的强弱；β-氨基己糖苷酶释放率的数值，可用于定量评价抗原致敏性。
2、商购抗原验证
按照1中的方法，向处理好的β-伴大豆球蛋白细胞模型中加入20μg/mL大豆抗原总蛋白样品(大豆抗原总蛋白购自北京德宝群兴农业科技有限公司，用Tyrodebuffer稀释为20μg/mL)，采用上述方法检测，结果与1无显著差异。
按照1中的方法，向处理好的β-伴大豆球蛋白细胞模型中加入20μg/mL β-伴大豆球蛋白(β-伴大豆球蛋白购自北京德宝群兴农业科技有限公司，用Tyrode buffer稀释为20μg/mL)，采用上述方法检测，结果与1无显著差异。
按照1中的方法，向处理好的大豆球蛋白细胞模型中加入20μg/mL大豆球蛋白(大豆球蛋白购自北京德宝群兴农业科技有限公司，用Tyrode buffer稀释为20μg/mL)，采用上述方法检测，结果与1无显著差异。
采用上述方法，检测大豆总抗原蛋白细胞模型1、β-伴大豆球蛋白细胞模型1、大豆球蛋白细胞模型1，结果与大豆总抗原蛋白细胞模型、β-伴大豆球蛋白细胞模型、大豆球蛋白细胞模型无显著差异。
二、细胞模型的应用
1、样品前处理：
待检大豆样品黑农40和黑农44，均购自北京德宝群兴农业科技有限公司，具体流程如下：
大豆样品(黑农40和黑农44)分别脱皮后粉碎到20目，磨浆，过滤后的滤液用乙醚萃取脱脂，经旋转蒸发除去残留乙醚，制得脱脂大豆粉；在25℃条件下，向脱脂大豆粉中加入0.03M的Tris-HCl(pH 8.0，10mM β-巯基乙醇)缓冲液(脱脂大豆粉与Tris-HCl的比例为1g脱脂大豆粉：20ml Tris-HCl)，溶解，并将待测样品稀释为浓度1mg/mL的溶液，分别得到黑农40待检样品溶液和黑农44待检样品溶液。
2、大豆致敏细胞模型检测
将上述黑农40待检样品溶液和黑农44待检样品溶液，分别加入到按照一的1中处理得到的大豆抗原总蛋白过敏细胞模型、大豆球蛋白过敏细胞模型、β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型、大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型中。每孔加入体积为10μL，各加3个复孔。以对照组血清的细胞模型作对照。37℃孵育60min，收集上清液，检测β-氨基己糖苷酶总活性。方法同一中所述。结果如表3所示。
表3大豆过敏细胞模型应用举例
从以上实验结果可以看出，黑农44的大豆总抗原蛋白致敏活性显著强于黑农40；黑农40的总致敏活性主要是来源于该大豆中的胰蛋白酶抑制因子，黑农44的总致敏活性主要是来源于该大豆中的胰蛋白酶抑制因子和β-伴大豆球蛋白。
Claims (6)
1.一种制备大豆抗原蛋白过敏细胞模型的方法，为如下1)-4)中任一所述过敏细胞模型：
1)将RBL-2H3细胞和大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清于37℃共孵育6小时，得到孵育后的细胞，即为大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型；所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型的共孵育体系由0.5×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ul大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清组成；所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清是将大豆胰蛋白酶抑制因子免疫雄性BN大鼠，分离血清，即得到大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清；
2)将RBL-2H3细胞和大豆总抗原蛋白抗血清于37℃共孵育12小时，得到孵育后的细胞，即为大豆总抗原蛋白过敏细胞模型；所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ul大豆总抗原蛋白抗血清组成；所述大豆总抗原蛋白抗血清是将大豆总抗原蛋白免疫雄性BN大鼠，分离血清，即得到大豆总抗原蛋白抗血清；所述大豆总抗原蛋白通过如下方法制备：将大豆依次进行脱皮、磨浆、过滤、滤液脱脂、溶解，即得到总抗原蛋白；所述滤液脱脂为向所述过滤得到的滤液加入乙醚混匀，旋转蒸发去除乙醚，得到脱脂大豆粉；所述溶解为将所述脱脂大豆粉和含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液混合，得到总抗原蛋白；所述脱脂大豆粉和含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液的配比为1g∶20ml；所述含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱和β-巯基乙醇，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述缓冲液中的浓度为0.03M，所述β-巯基乙醇在所述缓冲液中的浓度为10mM；
3)将RBL-2H3细胞和β-伴大豆球蛋白抗血清于37℃共孵育12小时，得到孵育后的细胞，即为β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型；所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ulβ-伴大豆球蛋白抗血清组成；所述β-伴大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备：将β-伴大豆球蛋白免疫雄性BN大鼠，分离血清，即得到β-伴大豆球蛋白抗血清；
4)将RBL-2H3细胞和大豆球蛋白抗血清于37℃共孵育10小时，得到孵育后的细胞，即为大豆球蛋白过敏细胞模型；所述大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由2×105个RBL-2H3细胞、500μL MEM培养基、10ul大豆球蛋白抗血清组成；所述大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备：将大豆球蛋白免疫雄性BN大鼠，分离血清，即得到大豆球蛋白抗血清。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述β-伴大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104；用于检测所述β-伴大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述β-伴大豆球蛋白的量为2μg；
所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104；用于检测所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆胰蛋白酶抑制因子，所述大豆胰蛋白酶抑制因子的量为2μg；
所述大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104；用于检测所述大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆球蛋白，所述大豆球蛋白的量为2μg；
所述大豆总抗原蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶2×104；用于检测所述大豆总抗原蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述大豆总抗原蛋白的量为2μg。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述β-伴大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶4×104；用于检测所述β-伴大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述β-伴大豆球蛋白的量为2μg；
所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶4×104；用于检测所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆胰蛋白酶抑制因子，所述大豆胰蛋白酶抑制因子的量为2μg；
所述大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶4×104；用于检测所述大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆球蛋白，所述大豆球蛋白的量为2μg；
所述大豆总抗原蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1∶4×104；用于检测所述大豆总抗原蛋白抗血清中的特异IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述大豆总抗原蛋白的量为2μg。
4.权利要求1-3中任一项所述方法制备的细胞模型。
5.权利要求1-3中任一项所述方法在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用。
6.权利要求4所述的细胞模型在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用。
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