CN1575335A - 猪肥大细胞培养物及其应用 - Google Patents

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National Institute Of Agronomique
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Abstract

本发明涉及通过在IL－3和SCF存在下培养衍生自肝及胎儿骨髓的干细胞获得猪肥大细胞纯培养物的方法。在本发明还涉及由所述培养物衍生的猪肥大细胞系。

Description

猪肥大细胞培养物及其应用
本发明涉及猪肥大细胞的培养物及其应用。
肥大细胞是炎症反应特别是过敏和超敏现象相关的免疫系统细胞。它位于结缔组织，尤其在皮肤、消化道和呼吸道，小肠和呼吸道粘膜。少量的肥大细胞存在于骨髓和淋巴器官。
成熟的肥大细胞，无论位于何处，都有一些共同的特征，如存在大量胞质内异染粒。它们是直径13到22微米的圆形细胞，具有单一的位于中心或通常偏离中心的圆形细胞核。细胞质中完全充满颗粒物，有时过量的颗粒物覆盖部分细胞核。
这些颗粒物包含多种由肥大细胞合成的化学物质，其中主要由组胺、5-羟色胺、蛋白聚糖如肝素或硫酸软骨素、酶尤其蛋白酶、细胞因子如TNF-α、“化学引诱物”因子、嗜曙红细胞和嗜中性粒细胞(Abraham和Malaviya，Infection and Immunity，65，3501，1997)。这些前炎症物质在肥大细胞活化时被突然释放(所谓的“脱粒”现象)。二次响应随后启动，伴随着调节子如白三烯，前列腺素和PAF(血小板活化因子)、以及白介素(IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13)、细胞因子(TGF-β、γ-IFN、GM-CSF)、以及趋化因子(MCP-1、IL8、RANTES)(Befus Reg，Immunol，2，176，1987；Moqbel等，Immunology，60，425，1987)的重头合成。所有这些因子活性作用于引发炎症响应过程和建立T淋巴细胞依赖的特异免疫响应。
肥大细胞实际上包括不同种类的细胞群。
两种截然不同的肥大细胞亚种群——粘膜肥大细胞和浆膜肥大细胞已被鉴别，它们显示出非常不同的生物化学的和功能的性质。这两个亚种群可以通过颗粒中产生和储存的活性物质来区分。如此，在老鼠中，粘膜肥大细胞主要产生组胺、类糜蛋白酶、硫酸软骨素A和E，而浆膜肥大细胞产生组胺、5-羟色胺、类糜蛋白酶、类胰蛋白酶和肝素。
在人类，粘膜肥大细胞，又称为MCT(类胰蛋白酶+)，主要产生组胺、类胰蛋白酶、肝素、硫酸软骨素A和E，而浆膜肥大细胞，又称为MCTC(类胰蛋白酶+和类糜蛋白酶+)，也产生类糜蛋白酶。
肥大细胞源自造血前体细胞(Galli，Lab.Invest.62，5-33，1990)。在条件培养基或有IL3存在时，已通过鼠骨髓细胞培养获得了肥大细胞群(Razin等，J.Biol.Chem.，257，7229-7236，1982；Dayton等，PNAS，85，569-572，1988)。纯的肥大细胞群在3个星期内从鼠造血细胞悬浮液中获得。
事实证明在体外获得人肥大细胞培养是十分困难的。在IL3存在时培养骨髓细胞或脐带细胞导致嗜碱性粒细胞的出现(Tadokoro等，J.Exp.Med.，158，857-871，1983)。共培养人脐带细胞和鼠3T3成纤维细胞四个星期后可能会获得成熟的肥大细胞(Ishizaka等，currentopinion in immunology，5，937-943，1993；Furitsu等，PNAS，86，10039-10043，1989)。随后表明(Ishizaka等，如前所述出版物)人肥大细胞体外分化和增殖依赖于鼠3T3细胞产生的c-kit配体(也表示为SCF：“干细胞因子”)。
肥大细胞培养建立了一种涉及多种炎症和/或免疫现象的机理研究的工具，例如过敏反应的来龙去脉，或各种病原体尤其是寄生虫侵袭的免疫响应。然而，如今仅在人或啮齿动物细胞的情况中，肥大细胞培养物能够成功的体外分化并维持。此外，目前仅有很少的肥大细胞系能够应用。
本发明的目的是提供源于猪的肥大细胞培养物和得自这些培养物的肥大细胞系。事实上，除了经济效益外，猪构成了用于生理和临床研究领域的模型。此外，猪携带可传给人的寄生虫(旋毛虫，猪囊尾蚴，弓形体)，从动物健康和公众卫生的角度(医学的防御)来看，研究肥大细胞在防御这些寄生虫的机制中的作用是非常有价值的。
以前的研究表明建立仅分离自肿瘤的人和啮齿动物肥大细胞系(肥大细胞体)要求在培养介质中存在单一特定的细胞因子。
猪肥大细胞体(mastocytome)极少出现，致使如今仍未从这个物种中获得肥大细胞系。
本发明者成功地发展了一种培养方法，在两种特定的细胞因子存在下，可能会从肝脏或骨髓的造血前体细胞中获得纯的猪肥大细胞种群，并且能够维持培养相当长的时期。
他们还成功地从培养液中获得保持最初的肥大细胞特性的永生化的细胞。
因此，本发明的主题是获得猪肥大细胞培养物的方法。其特征在于其包括：培养从猪胎肝脏或骨髓获得的干细胞，培养基包含至少0.2ng/ml、较好地0.5到10ng/ml、优选1到5ng/ml、且最优选大约2ng/ml的猪IL-3，和至少8ng/mg、比较好的20到200ng/ml、优选40到120ng/ml、且最优选约80ng/ml猪SCF。
根据本发明优选的实施方案，细胞在培养基中培养至少60到70天以获得100％的肥大细胞。
根据本发明优选的另一个实施方案，所述方法还包括用永生化癌基因转染所述培养物。
本发明的主题是依照本发明使用的方法获得任何猪肥大细胞培养物。
该培养物中至少90％，优选至少95％，且最优选99％以上的细胞有以下特性：
——它们包含含有组胺和肝素的颗粒；
——它们表达c-kit受体和IgE受体。
本发明具体包括能够从根据本发明的猪肥大细胞培养物中获得的任何肥大细胞亚群、系或克隆。
术语“培养物”在此通常指一个或一组在体外培养的细胞。直接从动物获得的细胞或组织样品发展的培养物称为“原代培养物”。术语“系”指成功地进行至少一次传代，且一般为连续地几次传代的传代培养，及任何自其开始的培养物。术语“克隆”指源自原代培养或细胞系中的一个细胞的一组细胞(Schaeffer，In Vitro Cellular and DevelopmentalBiology，26，91-101，1990)。
因此本发明的主题尤其是：
源自猪胎肝干细胞的肥大细胞系，2001年10月17日保藏于CNCM(Collectoion Nationale de Cultures de Micoorganismes[法国国家培养物及微生物保藏中])，编号为I-2735。
源自猪胎肝干细胞的且用SV40病毒T癌基因转染的肥大细胞系，2001年10月17日保藏到CNCM，编号为I-2736。
源自猪胎骨髓细胞的且用SV40病毒T癌基因转染的肥大细胞系。2001年10月17日保藏到CNCM，编号为I-2734。
所有这些细胞皆可以上述条件培养。
维持培养并不需要存在IL3，且SCF的用量也比获得培养物时低。因此，SCF起始浓度可为2ng/ml，优选浓度5到100ng/ml，最优选从8到80ng/ml。这些细胞也可在缺少SCF和IL3的情况下维持培养大约两个月。
根据本发明的肥大细胞尤其用作研究肥大细胞响应于过敏源或寄生虫的活化的模型。它们最好用作涉及寄生线虫相关的获得性保护免疫机理研究的体外模型。作为例子，肠表皮细胞被旋毛虫感染后与局部免疫的建立相关的免疫机理研究将被述及。
根据本发明的肥大细胞还可用来不仅在猪中，而且在其他动物(包括人)中鉴定与肥大细胞活化相关的抗原。特别是筛选能够潜在地用于获得疫苗或诊断试剂的抗原。具体来说，基于重组或合成的抗原体外活化这些肥大细胞的能力，它们可以被具体测试。
以旋毛虫为例，这些抗原可以用于诊断动物旋毛虫病(猪科动物早期旋毛虫病诊断)，或者用于发展疫苗(例如粘膜病疫苗)。
通过下文的进一步叙述，以描述根据本发明获得猪细胞培养物和细胞系的非限制性的实施例作为参考，本发明可以被更清楚地理解。
        实施例1、从猪胎骨髓或肝脏分离肥大细胞纯种群
细胞取样及培养
样品取自Meishan大母猪怀孕第77天的七胞胎；取了7个肝脏和8个大腿骨。
肝细胞收集
将肝研磨，并用20毫升0.5％胰蛋白酶、5mM EDTA37℃水浴15分钟消化分散细胞个体。温育后，通过无菌纱布垫过滤，用加有15％FCS，100U/ml青霉素/链霉素谷氨酰胺(完全的DMEM培养液)的DMEM培养液(GIBCO)漂洗几次。
1000g离心5分钟后，使用菲可梯度除去红细胞；17ml菲可的沉淀用DMEM培养液25毫升溶解。1500g离心25分钟，然后用DMEM培养液溶解漂洗白细胞团两次。
然后用10ml MEMα培养液(GIBCO)回收细胞，并进行细胞计数(即，2×106细胞/毫升)。
在重组猪IL3(2ng/ml)和SCF(80ng/ml)(BIOTRANSPLANT)存在的情况下，以4×106细胞/毫升的浓度将细胞接种至装有5ml MEMα培养液(完全的MEMα培养基)的摇瓶中，其中补充有15％FCS(胎牛血清)、100U/ml青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺和最终浓度为1μM的PGE2(前列腺素E，Sigma)。
骨髓细胞收集
用剪刀切开胎腿骨端部，用含有PBS的注射器灌注以收集骨髓细胞。
用PBS漂洗后，在猪IL3(2ng/ml)和猪SCF(80ng/ml)存在的情况下，以2.4×106细胞/毫升的浓度将细胞接种至含有20ml MEMα培养液的摇瓶中。
细胞培养
摇瓶置于含有5％CO2的37℃培育器中。
每个星期，以106细胞/毫升的浓度将细胞重接种至含有猪IL3(2ng/ml)和猪SCF(80ng/ml)的完全MEMα培养液中。
为了计数，以规则的间隔取样。细胞旋转和用甲苯胺蓝染色后，通过在显微镜下计数得到肥大细胞的百分比。
结果在下面的表I给出：
                                   表I
    培养时间(天)     骨髓细胞(106/毫升)     肥大细胞(％)     肝细胞(106/毫升)     肥大细胞(％)
    51219263340475460     0.70.50.90.40.50.70.30.61.3     0稀少53070808090100     30.60.40.40.30.30.40.40.6     07080808080809090
    677482899097104     1.711.811--     100100100100100--     1.10.81.10.80.71.30.9     100100100100100100100
无论什么组织来源，培养动力学显示60天(骨髓)和67天(胎肝)后，细胞群经历实质增长，尤其是骨髓来源的细胞。这种增加相应于从混合培养改变到100％同种群肥大细胞培养。
冷冻/解冻后，这些细胞保持繁殖能力。
至今，经历714天培养后，肥大细胞存活并继续繁殖。
细胞性质鉴定
肥大细胞通过甲苯胺蓝、May Grünwald和吉姆萨氏染剂显示。颗粒中的肝素和组胺通过硫酸黄连素和爱茜蓝/番红染剂显示。
培养的肥大细胞表现出高细胞核/细胞质比例的圆形。细胞核为圆形，通常位于中心或偏离中心，没有明显的分区；细胞质中有许多深紫色到红色的颗粒；颗粒的数量和大小各不相同：细胞中颗粒小且数量相对少的被认为是不成熟的；细胞中颗粒大且数量多被认为是成熟的。
硫酸黄连素染色后，在荧光显微镜下观察，肥大细胞细胞质中染色的颗粒相应于含有肝素的颗粒。不同细胞间肝素的量各不相同；这种多样性可能与细胞处于不同成熟期有关。
爱茜蓝-番红染色后，肝素颗粒被番红染成红色，组胺颗粒被爱茜蓝染成蓝色。在黄连素染色的情况下，有些细胞中观察到被强烈标记的肝素。
形态学的鉴定通过电子显微镜观察完成。
观察到猪肥大细胞尺寸较大(16μm)。它们有清晰的大细胞核，细胞核经常偏离中心，有规则的轮廓，边缘部分有少许染色质。在细胞核中观察到一个或两个位于中心的大核仁。细胞质相当丰富；它包含核糖体、许多大的线粒体和许多颗粒。
颗粒看起来被单层含或多或少电密度的膜包围，外表不均匀，带有较小或中等尺寸的微粒，有时以或多或少规则的杆状结构出现。这些颗粒与那些在培养的人肥大细胞中所述(EGUCHI，Electron.Microsc.Rev.，4(2)，293-318，1991)为同一类型。
c-kit受体和IgE受体证实
这些受体的存在通过免疫组化证明。
c-kit受体
用兔抗人c-kit多克隆抗体C19(TEBU)检测该受体，前者也能识别猪c-kit受体。
细胞培养的不同时期，细胞旋转后，在片子上进行间接染色。两种多克隆抗体被采用：第1)C19抗体；第2)FITC(荧光)羊抗兔抗体(TEBU)。HMCI细胞(源于人肥大细胞体)用作阳性对照。
-细胞旋转之后，细胞用甲醇固定5分钟；
-然后在空气中晾干，用含1％BSA的PBS 5分钟漂洗两次；
-接着用5％羊血清，在潮湿培养箱室温育20分钟；
-用含1％BSA的PBS 5分钟漂洗两次；
-与第一种抗体(1/50的C19)在潮湿培养箱中37℃共培养一小时三十分钟；
-用含1％BSA的PBS漂洗5分钟两次；
-与第二种抗体(1/200的FITC羊抗兔)在潮湿培养箱中37℃温育一小时三十分钟；
-用PBS 5分钟漂洗两次；
-用MOWIOL封片。
通过荧光显微镜观测。
几乎在所有细胞上观察到阳性膜染色；该染色与在HMCI对照细胞中观察到的情况相符，表明所分析的细胞含有c-kit受体。
IgE受体
用FITC抗鼠IgE抗体直接对不同培养时期的肥大细胞通过流式细胞仪进行染色。RBL细胞(小鼠嗜碱细胞转化成肥大细胞的细胞系)作为阳性对照。
-每个试管取用浓度约为106细胞/毫升的细胞培养液1毫升；
-离心细胞(培养液)以去除培养基；
-所得沉淀转至1毫升含1％BSA的PBS，4℃培养30分钟；
-离心试管，沉淀转至100μl按4∶100稀释的FITC抗鼠IgE抗体中，4℃培养1小时30分钟；
-用2毫升PBS漂洗，并且然后离心试管；
-沉淀收集至1毫升PBS。
通过FACS观测。
源于骨髓的60天培养的细胞和源于肝脏的67天培养的细胞中，99％被染色；染色情况与RBL对照细胞相符。由此表明所分析的细胞含有IgE受体。
第639天，FACS特性显示肝肥大细胞有两种细胞群；一种细胞群表达IgE受体比较弱(17.5％)，另一种强烈的表达IgE受体(82.5％)。
细胞基因组DNA分析
利用培养的细胞(取培养了489天后的细胞)和公猪与母猪(即肝脏和骨髓取样胎儿的亲本)的DNA分析20个来自猪基因组不同模板的微卫星。选用的标记物非常多样化，几乎分布于所有的基因组。
所得结果如下：
-孟德尔验证是令人满意的；培养的细胞来源于鉴定的胎儿亲本；
-对于4个鉴别的主要标记物，即IGFI、S0026、S0226和SW240，观察到的大小与大多数等位基因相符；
-无论什么标记，来源于胎肝和胎骨髓的肥大细胞培养物的不同DNA样品的基因型相同；
在培养过程中(至少489天，即DNA样品制备之日)，细胞基因组DNA未发生改变。
来源于Large White种猪胎骨髓或肝脏的肥大细胞纯种群的分离
样品取自Large White母猪怀孕第77天的七胞胎；取了7个肝脏和8个大腿骨。
根据前面所述Meisan种猪胚胎的方法，细胞从肝脏或骨髓中分离并培养。
培养112天后即可获得骨髓肥大细胞或肝脏肥大细胞纯的培养物。
            实施例2、获得癌基因转染的猪肥大细胞系
永生化培养的细胞
采用脂转染法转染经202天培养的2×105个胎肝肥大细胞样品，利用经Scal内切酶预处理pLM13载体并使用人工脂质体FuGENE6(BOEHRINGER-MANNHEIM)。pLM13载体包含编码猴多瘤病毒sv40的T癌基因(Tts)热敏感性突变体序列和编码新基因(抗geneticin)的序列。这些序列由巨细胞病毒启动子控制。
转染的细胞基因组DNA中Tts癌基因的存在用PCR法观测。从相同的细胞制备mRNA，通过RT-PCR检测Tts的表达。
转染的肥大细胞的生长
制作从第470天到511天的转染和未转染的细胞的生长曲线，即41天的培养。为了评价分裂数量，从最初浓度为5×105细胞/毫升开始，每天进行细胞计数并与初始浓度比较。结果如图1所述。X轴表示培养时间(天)，Y轴表示分裂数。
观察到转染和未转染的肝脏肥大细胞间生长的不同。未转染的肥大细胞的分裂时间平均为6天，而转染的肝脏肥大细胞为5天。
所得细胞系性质鉴定
在形态学和肝素存在方面，转染的肥大细胞显示出与未转染的肥大细胞相同的性质。
它们也有相同的c-kit受体特性。然而，关于IgE受体，只观察到单一的细胞种群，而不像在未转染的情况下培养肝脏肥大细胞639天观察到两种细胞群。
             实施例3、培养的肥大细胞的组胺产生
分析肥大细胞中的组胺
在培养了976天的三种细胞系：CNCM I-2735(肝脏)、CNCM I-2736(SV40 Tts癌基因转染的肝脏)和CNCM I-2734(SV40 Tts癌基因转染的骨髓)中分析组胺。细胞在无血清的纯MEMα培养基中培养。
1)、细胞制备
在5％CO2、500μM钙离子载体A23187和5μM PMA(醋酸肉豆蔻酸佛波醇酯)存在条件下，每个细胞系中50000个细胞在37℃活化30分钟。每个细胞系相同数量的细胞置于37℃作为未活化的对照。
然后离心细胞，上清液和沉淀物回收并在-80℃冻存，直至分析组胺为止。
2)、分析组胺
依据LEBEL描述的技术(Ann.Biochem.，133，16-29，1983)分析上清液和沉淀中的组胺。
结果如下表II所述：
                           表II
  细胞系/处理     上清液中组胺(ng/ml)   细胞沉淀中组胺(ng/ml)     组胺释放(％)
  I-2735未活化     14   1583     48
  I-2735活化     449   466
  I-2734未活化     16   1460     28
  I-2734活化     250   600
  I-2736未活化     23   4380     25
  I-2736活化     593   1706
所有细胞都含有组胺。活化的细胞上清液中组胺的浓度远大于非活化细胞。
活化的细胞释放的组胺百分比按以下公式计算：
释放百分比＝(S-S对照×100)/[(S+P)-S对照]
其中：
S：上清液中的组胺
P：沉淀中的组胺

Claims (7)

1、一种获得猪肥大细胞培养物的方法，其特征在于其包括将从猪胎肝或骨髓获得的干细胞在培养基中培养，所述培养基包含至少0.2ng/ml猪IL3和至少8ng/ml的猪SCF。
2、权利要求1的方法，其特征在于该细胞在所述培养基中维持培养至少60到70天。
3、权利要求1或2任一的方法，其特征在于其还包含用永生化癌基因转化所述培养物的细胞。
4、由权利要求1至3任一的方法可获得的猪肥大细胞培养物。
5、权利要求4的猪肥大细胞培养物，其选自：
2001年10月17日在CNCM保藏的细胞系，编号I-2735；
2001年10月17日在CNCM保藏的细胞系，编号I-2736；
2001年10月17日在CNCM保藏的细胞系，编号I-2734。
6、权利要求4或5任一的猪肥大细胞的应用，作为研究肥大细胞活化的模型。
7、权利要求4或5任一的猪肥大细胞的应用，用于体外筛选能诱导肥大细胞活化的抗原。
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