MXPA04003782A - Cultivos de mastocitos de puerco y sus usos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo de obtencion de cultivos puros de mastocitos de puerco al colocar en cultivo celulas germinales emitidas de higado y medula osea en la presencia de IL-3 y SCF. La invencion se refiere igualmente a lineas de mastocitos de puerco emitidas de estos cultivos.

Description

CULTIVOS DE MASTOCITOS DE PUERCO Y SUS USOS La invención se refiere a los cultivos de mastocitos de puerco y a sus usos. Los mastocitos son células del sistema inmune, que intervienen en la respuesta inflamatoria , notablemente en los fenómenos de alergia e hipersensibilidad . Se localizan en el tejido conjuntivo, notablemente al nivel de la piel, tracto digestivo y respiratorio, y en las mucosas intestinales y respiratorias. Existe igualmente un número pequeño de mastocitos en la médula ósea y en los órganos linfoides. Los mastocitos maduros, cualquiera que sea su ubicación , tienen en común ciertas características tales como la presencia de numerosas granulaciones intracitoplásmicas metacromáticas. Se trata de células redondas de un diámetro de 13 a 22 µp?; poseen un núcleo redondo, único, central o la mayoría excitado. El citoplasma se llena completamente de granulaciones, la abundancia de granulaciones recubriendo algunas veces una parte del núcleo. Estas granulaciones encierran diferentes substancias químicas sintetizas por los mastocitos, entre las cuales se citarán notablemente la histamina, serotonina , proteoglicanos, tales como heparina o condroitina sulfato, enzimas, notablemente proteasas, citoquinas, tales como TNF-alfa, y los factores "quimioatrayentes" de esinófilos y neutrófilos (ABRAHAM Y MALIVIYA, Infection and Immunity, 65, 3501 , 1997). Estas substancias pro-inflamatorias se liberan brutalmente (fenómeno denominado "degranulación") cuando la activación mastocitana. En un - -segundo momento se coloca una respuesta secundaria, enlazada a la síntesis de novo de mediadores tales como leucotrienos, prostaglandinas, PAF (factor de activación de plaqueta), pero también interleukinas (IL4, IL5, IL6, IL 10, IL 12 , IL 1 3), de citoquinas (TGF-beta, I FN-gamma , GM-CSF) y quimioquinas (MCP-1 , IL8, RANTES) (BEFUS, Reg . Immunol. 2, 176, 1 989; OQBEL eí al., Immunology, 60, 425, 1987). El ensamble de estos factores participa activamente en el enganche de un proceso inflamatorio y emplear una respuesta inmunitaria especifica dependiente de los linfocitos T. Los mastocitos constituyen de hecho una población celular muy heterogénea. Dos subpoblaciones mastocitarias distintas que presentan características bioquímicas y funcionales muy diferentes se han caracterizado: los mastocitos mucos y los mastocitos serosos. Estas dos subpoblaciones pueden diferenciarse por las substancias activas elaboradas y almacenadas en los granulos. Así, en el ratón los mastocitos mucosos producen principalmente histamina, quimasa y condroitina sulfato A y E, y los mastocitos serosos producen principalmente histamina, serotonina, quimasa, triptasa y heparina. En el hombre, los mastocitos mucoso igualmente denominados MCT (triptasa +) producen principalmente histamina, triptasa, heparina, y condroitina sulfato A y E, y los mastocitos serosos igualmente denominados MCTc (triptasa + y quimasa +) producen además quimasa. Los mastocitos se derivan de precursores hematopoyéticos (GALLI , Lab. Invest. 62, 5-33, 1990). Las poblaciones de mastocitos se han obtenido a partir de cultivos de médula ósea de ratón (RAZIN, ef al., J . Biol. Chem. 257, 7229-7236, 1982; DAYTON et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 569-572, 1988) en presencia de medios acondicionados o en presencia de IL3. A partir de una suspensión de células hematopoyéticas de ratón, se obtiene una población pura de mastocitos en 3 semanas. La obtención de cultivos in vitro de mastocitos humanos se comprueba más difícil. Los cultivos de células de médula ósea o de codón umbilical en presencia de IL3 han conducido a la aparición de gran ulocitos basófilos (TADOKORO et al., J. Exp. ed. , 158, 857-871 , 1983. El co-cultivo de células de cordón umbilical humano con fibroblastos 3T3 de ratón ha permitido, sin embargo, obtener mastocitos maduros después de cuatro semanas de cultivo (ISHIZAKA ef al. , Current Opinión in Immunology, 5, 937-343, 1993; FURITSU eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10039-10043, 1989). Se ha mostrado enseguida (IZHIZAKA eí al., publicación precitada) que la diferenciación y la proliferación de mastocitos humanos in vitro depende del kit de ligando c (igualmente denominado SCF para : "Factor de las Células Germinales" ) producido por las células 3T3. Los cultivos de mastocitos constituyen una herramienta útil para el estudio de mecanismo implicados en diferentes fenómenos inflamatorios y/o inmunitarios, por ejemplo, en el cuadro de la respuesta alérgica, o de la respuesta inmunitaria a la agresión por diversos patógenos, notablemente parásitos. Sin embargo, hasta ahora hemos conseguido diferenciar y mantener in vitro los cultivos de mastocitos que en el caso de células humanas o de roedor; además no disponemos - -actualmente más que de un número pequeño de líneas de mastocitos. La presente invención tiene por objeto proporcionar los cultivos de mastocitos que provienen del puerco, y las líneas de mastocitos emitidas de estos cultivos. En efecto , además de su interés económico, el puerco constituye un modelo cada vez más utilizado en el cuadro de los estudios fisiológicos y clínicos. Por otra parte, el puerco aloja parásitos transmisibles al hombre (Trichinella, cistisercos, toxoplasma), y el estudio del papel jugado por los mastocitos en los mecanismos de defensa frente a aquellos, presenta un gran interés desde el punto de vista de la salud animal y de salud pública (profilaxis médica).

Los estudios precedentes han mostrado que el establecimiento de líneas de mastocitos humanos y de roedores únicamente aislados a partir de tumores (mastocitomas) necesitarán la presencia de una sola citoquina específica en el medio de cultivo. La presencia de mastocitomas de puerco es una eventualidad extremadamente rara , ya que ha prohibido hasta ahora , la obtención de líneas de mastocitos de esta especie. Los inventores hasta ahora han llevado a cabo un método de cultivo, en presencia de 2 citoquinas específicas, permitiendo la obtención , a partir de los precursores hematopoyéticos de h ígado y médula ósea, una población pura de mastocitos porcinos, y su mantenimiento en cultivo durante una duración muy larga. Además han llegado a obtener, a partir de este cultivo, células inmortalizadas, que conservan las características de los mastocitos de origen.

- - La presente invención tiene un consecuencia como objeto, un método de obtención de un cultivo de mastocitos porcinos caracterizado porque comprende el poner en cultivo las células de cepa obtenidas del h ígado o de la médula ósea, de un feto de puerco, en un medio que comprende al menos 0.2 ng/ml, ventajosamente de 0.5 a 10 ng/ml, de preferencia de 1 a 5 ng/ml, y de manera más preferida aproximadamente 2 ng/ml de IL-3 porcina, y al menos 8 ng/ml, ventajosamente de 20 a 200 ng/ml, de preferencia de 40 a 1 20 ng/ml , y de manera más preferida aproximadamente 80 ng/ml de SCF porcina. Según un modo de empleo preferido de la presente invención , las células se cultivan en este medio durante al menos 60 a 70 d ías para obtener 100% de mastocitos. Según otro modo de empleo preferido de la presente invención, dicho método comprende además la transformación de dicho cultivo por un oncógeno imortalizado. La presente invención , tiene ig ualmente por objeto todo cultivo de mastocitos porcinos susceptible de obtenerse por el método conforme a la invención. Al menos 90%, de preferencia al menos 95% , y de manera más preferida al menos 99% de las células de este cultivo presentan las siguientes características: - encierran las granulaciones que contienen la histamina y la heparina; expresan el kit de receptor c y el receptor de IgE . La presente invención abarca completamente toda la - -subpobiación, línea, o clon de mastocítos que pueden obtenerse a partir de cultivos de mastocítos porcinos conforme a la invención . El término "cultivo" designa aquí, de manera general , una célula o un conjunto de células cultivadas in vitro. Un cultivo desarrollado directamente a partir de una muestra celular o de tejido efectuada sobre un animal se denomina "cultivo primario". El término "línea" se emplea a partir del momento en donde al menos un pasaje, y generalmente varios pasajes consecutivos en subcultivo se han efectuado con éxito, y designa todo cultivo que se emite. El término "clon" designa un conjunto de células emitidas de una sola célula de un cultivo primario o de una linea (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91 -101 , 1 990). La presente invención tiene también particularmente por objeto: - una línea de mastocítos emitida de las células germinales de h ígado fetal de puerco, depositada ante CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, insitut Pasteur, 26 rué du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France) el 17 de Octubre de 2001 , bajo el número I-2375. - u na línea de mastocítos emitida de las células germinales de hígado fetal de puerco y transfectada por el oncógeno T de virus SV40, depositada ante CNCM el 17 de Octubre de 2001 , bajo el número 1-2736. - una línea de mastocítos emitida de las células germinales de la médula ósea de un feto de puerco y transfectada por el conógeno T del virus SV40, depositada ante CNCM el 17 de octubre de 2001 , bajo el - -número 1-2734. Todas las células pueden cultivarse en las condiciones definidas anteriormente. El mantenimiento en cultivo, sin embargo, no necesita la presencia de IL-3 y SCF puede utilizarse en las dosis más reducidas que aquellas utilizadas para la obtención de cultivos. Así, se puede utilizar SCF en concentraciones a partir de 2 ng/ml, de preferencia a las concentraciones de 5 a 100 ng/ml, ventajosamente de 8 a 800 ng/ml. Estas células pueden igualmente mantenerse en cultivo en la ausencia de SCF e IL-3 durante aproximadamente 2 meses. Los mastocitos conforme a la invención pueden notablemente utilizarse como modelos para estudiar la activación mastocítaria en respuesta a un alérgeno, o a un parásito. Presentan un interés muy particular como modelo in vitro para el estudio de mecanismos inmunitarios que se implican en la adquisición de una inmunidad protectora frente a nemátodos parásitos. A manera de ejemplo, se citará el estudio de los mecanismos implicados en la colocación de una inmunidad local después de la infestación de células epiteliales intestinales por Trichinella. Los mastocitos conforme a la invención puede igualmente utilizarse para identificar los antigenos que intervienen en la activación de mastocitos no solamente en el puerco, sino que igualmente en otros animales, incluidos el hombre, en particular en el cuadro de cribado de antigenos potencialmente utilizables para la obtención de vacunas o de reactivos de diagnóstico. Se puede notablemente probar también los - -antígenos recombinantes o sintéticos, sobre la base de su capacidad de activar in vitro estos mastocitos. En el caso de Trichinella por ejemplo, estos antígenos pueden tener aplicaciones para el diagnóstico de triquineiosa en animales (diagnóstico precoz de la triquineiosa de suidos), o para el desarrollo de vacunas (por ejemplo, vacunación por vía mucosal). La presente invención se comprenderá mejor con la ayuda del complemento de la descripción siguiente, que se refiere a los ejemplos ni limitativos que describen la obtención de cultivos y de líneas de mastocitos porcinos conforme a la invención . EJEMPLO 1 : AISLAMIENTO DE POBLACIONES PURAS DE MASTOCITOS A PARTIR DE MÉDULA O HÍGADO DE FETOS DE PUERCO. Muestra v colocación en cultivo de células Las muestras se han realizado a partir de 7 fetos de un cerda en el día 77 de gestación; 7 h ígados y 8 fémures se han tomado. Recolección de las células de hígado Los hígados se han molido y las células individualizado con 20 mi de tripsina, 0.5% de EDTA 4 mM, en un baño maría a 37°C durante 15 mn . Después de la incubación , una filtración sobre gasas estériles se ha realizado , al efectuar varios enjuagues con el medio DMEM (GIBCO) , complementado en SVF a 15%, Penicilina/Estreptomicina 100 U/ml , Glutamina 2 mM (medio DMEM completo). Después de una centrifugación de 5 mn a 1 000 g, un gradiente de ficoll se ha utilizado a fin de eliminar las hematíes; el resto se toma en 25 mi de medio DMEM para 17 mi de ficoll. Una centrifugación se ha - -efectuado a 1500 g durante 25 mn, el anillo de células blancas se toma enseguida y enjuaga dos veces en medio D EM completo. El resto se ha recuperado en seguida en 10 mi de medio MEM a (GIBCO) y una numeración celular se ha realizado (es decir 2.106 células/ml). Las células se han sembrado, en razón de 4.106 células/ml, en un frasco con 5 mi de medio MEM a complementado en SVF (suero de bovino fetal) a 1 5%, Penicilina/Etreptomicina 1 00 U/ml , Glutamina 2 mM, PGE2 (prostaglandina E, Sigma) a 1 µ? final (medio MEM a completo), en presencia de IL3 (2 ng/ml) y SCF (80 ng/ml) porcinos recombinantes (BIOTRANS PLANTE). Recolección de las células de la médula ósea Los fémures de fetos se han cortado con la ayuda de tijeras en cada extremidad y la médula ósea se ha recolectado por perfusión con la ayuda de una jeringa que contiene PBS . Una vez enjuagados en PBS, las células se han sembrado, en razón de 2.4.106 células/ml, en un frasco con 20 mi de medio MEM a completo en presencia de IL3 porcina (2 ng/ml) y SCF porcino (80 ng/ml). Cultivo de células Los frascos se colocan en la estufa a 37°C en presencia de C02 (a 5%). Las células se vuelven a sembrar todas las semanas en razón de 10e células/mL, en el medio MEM a completo en presencia de IL3 porcina (2 ng/ml) y SCF porcina (80 ng/ml) . Las muestras se toman a intervalos regulares para efectuar - -una numeración celular, después de citocentrifugación y coloración con azul de toluidina, el porcentaje de mastocitos se obtiene por conteo en el microscopio. Los resultados se reportan en la tabla I a continuación . TABLA I La cinética de cultivos, cualquiera que sea su origen de tejido, revela que después de un periodo de 60 días (médula ósea) y de 67 días (hígado fetal), la población celular sufre un crecimiento sensible, notablemente para las células de origen medular. Este crecimiento corresponde al pasaje de un cultivo mixto a una población homogénea 100% de mastocitos. Las células permanecen capaces de multiplicarse después de congelación/descongelación . A la fecha, después de 714 d ías de cultivo, los mastocitos son viables y continúan multiplicándose. Caracterización de las células - - Los mastocitos se ponen en evidencia por coloración con azul de toluidina y coloración de May Grünwald y Giemsa. La heparina y la histamina de granulaciones se revelan por coloración con sulfato de berberina y con azul acian-safranina. Los mastocitos en cultivo aparecerán redondos con un rendimiento nucleo-citoplásmico elevado. El núcleo es redondo, la mayoría central o excitado no segmentado; en el citoplasma las granulaciones son numerosas, el color violeta se pone rojo; el número y tamaño de las granulaciones varía : son pequeñas y poco numerosas en las células consideradas como inmaduras; son numerosas y voluminosas en las células consideradas como maduras. Después de la coloración con sulfato de berberina, se observa en el microscopio una fluorescencia de las granulaciones coloreadas en el citoplasma de mastocitos, que corresponde a los gránulos que contienen heparina . La cantidad de heparina aparecerá variable de una célula a otra; esta variación puede ser en relación con el estado de maduración de las células. Después de la coloración con azul alcina-safranina, los granos de heparína se colorean de rojo por la safranina y los granos de histamina de azul por azul alcian . Se observa en ciertas células una fuerte marca de heparina, como en el caso de la coloración por berberina. La caracterización morfológica se ha completado por una observación en microscopio electrónico. Los mastocitos de puerco observados son células de gran tamaño (16 µ??). Tienen un núcleo claro grueso, en su mayoría excitado, - -con contorno regular, con una cromatina ligeramente marginada. En el núcleo, se observa dos nucléolos voluminosos en posición central. El citoplasma es demasiado abundante , contiene ribosimas, numerosas mitocondrias voluminosas, y numerosas granulaciones. Las granulaciones aparecerán rodeadas de una membrana simple, que contiene un material más o menos denso de electrones, de aspecto irregular con las partículas pequeños o medias, tal vez de estructuras en forma de palos más o menos regulares. Estas granulaciones son del mismo tipo que aquellas descritas en los mastocttos humanos en cultivo (EGUCHI, Electron. icrosc. Rev. , 4(2), 293-318, 1 991 ) . Evidencia del kit de receptor c y del receptor de IgE La presencia de estos receptores se pone en evidencia por inmunohistoquímica. Receptor del kit c Este receptor se ha detectado al utilizar los anticuerpos policlonales C19 kit anti-conejo c humano (TEBU), que reconoce igualmente el kit de receptor c porcino. Las marcas indirectas en diferentes momentos del cultivo se han realizado sobre las hojas después de la citocentrifugación de células. Dos anticuerpos policlonales se han utilizado: 1 ero) anticuerpos C19, 2do) anticuerpos de caballo anti-conejo FITC (fluoresceina) (TEBU). Las células HMCI (que provienen de un mastocitoma humano) se han utilizado como testigo positivo. - Después de la citocentrifugación las células se fijan con - -metanol durante 5 mn . - Se secan enseguida con aire y enjuagan 2 veces en PBS+BSA 1 % durante 5 mn. - Incuban enseguida con suero de caballo a 5% durante 20 mn a temperatura ambiente y cámara húmeda . - 2 enjuagues de 5 mn en PBS+BSA al 1 %. - Incuban con los 1 eros anticuerpos (c 19 a 1 /50) 1 h30mn a 37°C en cámara húmeda. - 2 enjuagues en PBS+BSA al 1 % (2 x 5 mn). - Incuban con los segundos anticuerpos (caballo anti-conejo FITC en 1 /200) 1 h30mn a 37°V en cámara húmeda. - 2 enjuagues de 5 mn en PBS. - Las hojas se montan en mowiol. La lectura se efectúa en el microscopio con fluorescencia. Se observa un marcado positivo de membrana sobre casi la totalidad de células; este marcado es idéntico a aquel observado sobre las células testigo HMCI , que muestra que las células analizadas que poseen el kit de receptor c. Receptor de IgE Los marcados directos en diferentes momentos del cultivo se han realizado en citometría de flujo sobre los mastocitos en cultivo con un anticuerpo anti IgE de ratón FITC. Se ha utilizado como testigo positivos las células RBL (línea de basofilos de rata transformada en mastocitos). - Se utiliza 1 mi de células en cultivo a aproximadamente 1 0° células/ml para cada tubo.

- - - Las células se centrifugan para eliminar el medio de cultivo.

- Los restos se toman en 1 mi de PBS+BSA al 1 %, e incuban durante 30 mn a +4°C. - Los tubos se centrifugan y los restos se toman en 100 µ? de anticuerpos anti IgE de ratón FITC diluidos en 4/1 00, incubados 1 h30mn a +4°C. - Se efectúa un enjuague en 2 mi de PBS, después los tubos se centrifugan. - Los restos se recolectan en 1 mi de PBS- La lectura se hacen en FACS. A partir de J60 para los cultivos emitidos de la médula ósea, y de J67 para los cultivos emitidos de hígado, 99% de las células se marcan ; el marcado es idéntico sobre las células testigo RBL. Aparecerá entonces las células analizadas poseen el receptor de IgE . En J639, los perfiles de FACS muestran, para los mastocitos de hígado, dos poblaciones celulares; una población que expresa débilmente los receptores a IgE (17.5%) y una población que expresa fuertemente los receptores a IgE 82.5% . Análisis de ADN genómico de células 20 microsatélites del panel diversificado de genoma de puerco se han analizado a partir de ADN de células en cultivo (tomadas 489 días después de la colocación en cultivo) y aquel los padres, verraco y la cerda, de 7 fetos sobre los cuales se han tomado el hígado y la médula ósea. Los marcadores elegidos son muy polimorfos y se reparten sobre casi la totalidad de los cromosomas.

- - Los resultados obtenidos son los siguientes: - La verificación mendeliana es satisfactoria, las células provienen bien del feto del cual los padres se identifican; - Para 4 marcadores principales identificados, IGFI, S0026, S0226 y SW240, los tamaños observados corresponden a los átelos mayoritarios; - Cualquiera que sea el marcador, los genotipos de diferentes muestras de ADN de cultivos de mastocitos de hígado fetal, y de médula fetal son idénticos. ADN genómico de células no se ha modificado durante el cultivo (al menos durante 489 días, fecha de la preparación de muestras de ADN). Aislamiento de poblaciones puras de mastocitos a partir de médula o de hígado de feto de puerco de raza Blanca Grande Las muestras se han realizado a partir de 7 fetos de un cerda Blanca Grande en el día 77 de gestación; 7 hígados y 8 fémures se han tomado. Las células se han aislado y colocado en cultivo, a partir del hígado o de la médula, como se describe anteriormente para las células fetales de raza Meishan Los cultivos puros de mastocitos de médula ósea o de mastocitos de hígado se han obtenido después de 1 12 días de cultivo. EJEMPLO 2: OBTENCIÓN DE LÍNEAS DE MASTOCITOS DE PUERCO TRANSFECTADAS POR UN ONCOGENO Inmortalización de células en cultivo - - Una muestra de 2.105 mastocitos de hígado fetal en 202 días de cultivo se ha transfectado por lipofección al utilizar el vector pLM13, previamente alineado por la enzima de restricción, Sca1 asociada con una liposoma artificial. FuGENE6 (BOEHRINGER-MANNHEIM). El vector Plm13 comprende las secuencias que se codifican para un mutante termosensible del oncógeno T (Tts) de virus simien vacuolisant SV40 y aquellas que se codifican para el gen neo (resistencia a la geneticina). Estas secuencias se encuentran bajo control de un promotor de citomegalovirus. La presencia del oncógeno Tts en ADN genómico de células transfectadas se ha observado por PCR. La expresión de Tts se ha revelado por RT-PCR a partir de una preparación de mensajeros de ARN de las mismas células. Crecimiento de mastocitos transfectados Una curva de crecimiento se ha realizado sobre las células no transfectadas y sobre las células transfectadas de J470 a J51 1 , es decir durante 41 días de cultivo. A partir de una concentración inicial de 5.105 células/ml, las células se han contado todos los días y reportado en esta concentración inicial, para evaluar el número de divisiones. Los resultados se ilustran por la figura 1. En abscisa, el tiempo de cultivo (en días); ordenan el número de divisiones. Se observa una diferencia de crecimiento entre los mastocitos de hígado no transfectados (?) y transfectados (?). El tiempo de división para los mastocitos no transfectados en promedio es de 6 días, cuando es de 5 días para los mastocitos de los hígados transfectados (figura 1 ). Caracterización de líneas obtenidas - - Los cultivos de mastocitos transfectados presentan, al nivel de su morfología y de la presencia de heparina, las mismas características que los cultivos de mastocitos no transfectados. Poseen igualmente las mismas características del kit de receptor c. Sin embargo, en lo que concierne al receptor de IgE, en lugar de dos poblaciones celulares observadas en J639 en el caso de cultivos de mastocitos de hígado no trasfectados, se observa una sola población. EJEMPLO 3: PRODUCCIÓN DE HISTAMINA POR LOS MASTOCITOS EN CULTIVO Dosificación de histamina en los mastocitos: Las dosificaciones de histamina se han realizado sobre las tres líneas celulares CNCM I-2735 (hígado), CNCM I-2736 (hígado transfectado por el oncógeno Tts de SV40) y CNCM I-2734 (médula ósea transfectada por el oncógeno Tts de SV40) en 976 días de cultivo. Las células se colocan en el medio ME a completo sin suero. 1 ) Preparación de células: 50000 células de cada línea se han activado durante 30 minutos a 37°C en presencia de 5% de C02, por 500 µ? de yonoforo cálcico A23187 y 5 µ? de PMA (forbol miristato de acetato). El mismo número de células de cada línea se ha colocado a 37°C para servir de control no activo. Las células se centrifugan enseguida y los sobrenadantes como los restos se recuperan y congelan a -80°C hasta el momento de dosificación de la histamina. 2) Dosificación de la histamina: La dosificación de histamina se ha realizado en los sobrenadantes y los restos según la técnica descrita por LEBEL (Ann. Biochem. 133, 16-29, 1983) . Los resultados se ilustran por la Tabla II a continuación. TABLA II Todas las células contienen la histamina. La concentración de histamina en los sobrenadantes es más importante en las células activas que en las células no activas. El porcentaje de liberación de histamina por las células activas se calcula al utilizar la siguiente fórmula : % de liberación=S-S control x 1 00 (S+P) - S control en la cual: S= histamina en el sobrenadante C= histamina en el resto.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES 1. Método de obtención de un cultivo de mastocitos porcinos, caracterizado porque comprende el poner en cultivo las células germinales obtenidas a partir de un hígado o de la médula ósea de un feto de puerco, en un medio que comprende al menos 0.2 ng/ml de IL-3 porcina y al menos 8 ng/mol de SCF porcino.
2. 2. Método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dichas células se mantienen en cultivo en dicho medio durante al menos 60 a 70 días.
3. 3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque comprende además la transformación de células de dicho cultivo por un oncógeno inmortalizante.
4. 4. Cultivo de mastocitos porcinos susceptibles de obtenerse por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Cultivo de mastocitos porcinos según la reivindicación 4. elegido entre: - la línea depositada ante CNCM el 17 de octubre de 2001 , bajo el número I-2735; - la línea depositada ante CNCM el 17 de octubre de 2001 , bajo el número I-2736; - la línea depositada ante CNCM el 17 de octubre de 2001 , bajo el número I-2734;
6. 6. Uso de un cultivo de mastocitos porcinos según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 como modelo de estudio de la activación mastocitaria.
7. 7. Uso de un cultivo de mastocitos porcinos según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, para el cribado in vivo de antígenos capaces de inducir la activación de mastocitos.