CN1452655A - 间充质类干细胞的培养方法 - Google Patents

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CN1452655A CN01815299A CN01815299A CN1452655A CN 1452655 A CN1452655 A CN 1452655A CN 01815299 A CN01815299 A CN 01815299A CN 01815299 A CN01815299 A CN 01815299A CN 1452655 A CN1452655 A CN 1452655A
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Abstract

本发明提供可以得到与以往培养方法相比多得多的间充质类干细胞的新的间充质类干细胞的培养方法。该培养方法的特征是向培养基中添加了作为能保持间充质类干细胞的多分化能力，而且刺激他的增殖能力，延长寿命的物质的成纤维细胞增殖因子(FGF)，不仅可以将间充质类干细胞培养至30代以上，而且与以往培养方法相比可以得到是以往105～106倍的细胞。

Description

间充质类干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及新的间充质类干细胞的培养方法和使用该方法得到的具有多分化能力的间充质类干细胞。在本发明中，间充质类干细胞是指至少具有分化为软骨细胞或成骨细胞的分化能力的未分化间充质类细胞(间充质干细胞)。
背景技术
脊椎动物、特别是哺乳动物的组织，在细胞再生系统中，例如在针对由于伤害、疾病、或年龄增长引起的细胞、组织的损失的再生系统中，含有具有使细胞、组织再生的能力的干细胞。因此在这样的组织内或起着干细胞贮存库作用的其它组织内都有干细胞。作为干细胞贮存场所可以举出主要例如骨髓和骨膜。
众所周知，骨髓是发育成熟的生物的造血干细胞的主要供给源，该造血干细胞是具有多能性的未分化的细胞，所有的血液细胞(例如红细胞、白细胞、淋巴细胞等)都是由该造血干细胞分化来的。有关造血干细胞的培养、分化已经进行了很多研究，人们已经知道了对造血干细胞的培养、对造血干细胞向各个血液细胞(成分)分化、诱导有作用的许多物质(增殖因子)。
另外，在骨髓和骨膜等中还含有不同于造血干细胞的其他干细胞、即间充质干细胞，它们对骨、软骨、肌肉、韧带、腱、脂肪和间质等的间充质组织类的再生起着重要的作用。间充质类干细胞(间充质干细胞)作为未分化的细胞进行增殖，而且保持着诸如可以分化成脂肪细胞、软骨细胞或成骨细胞等的多能性。该干细胞可以很容易地从骨髓和骨膜中分离出来，表现出作为干细胞的稳定的表现型和细胞形态。例如来自骨髓的间充质类干细胞在体外培养中保持着单层的性质(Pittenger M.F.等，Science 284，143-147，1999)。
因此，有提案认为对间充质类干细胞进行大量培养，从得到的未分化细胞分化诱导软骨组织或骨组织等，这些组织可用于移植治疗。该提案的第1阶段是尝试对来自骨髓的间充质类干细胞进行培养。然而如果用以往的培养方法由于在15代前后该干细胞的增殖停止或极其缓慢，所以存在着不能获得足够数量的间充质类干细胞的问题。另外还出现向软骨细胞或成骨细胞的分化能力消失的问题。为了由间充质类干细胞诱导软骨或骨组织，然后用于移植治疗，需要大量的作为起始材料的该干细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供与以往的培养方法相比可以显著增多所得间充质类干细胞的新的间充质类干细胞的培养方法。
另外本发明的目的还在于提供使用这样的方法得到的具有多能性的间充质类干细胞。
本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发现如果在含有成纤维细胞增殖因子(FGF)的培养基中培养间充质类干细胞，可以进行25代以上的传代培养，由此完成了本发明。
所以本发明提供哺乳动物的间充质类干细胞的培养方法，其特征在于在培养基中添加能刺激间充质类干细胞的增殖能力的物质。在该培养方法中，作为刺激间充质类干细胞的增殖能力的物质，FGF是有用的。培养基中的FGF的浓度通常为0.01～100ng/ml，优选为0.04～10ng/ml，更优选为0.1～1ng/ml。
在本发明的方法中，FGF若是具有刺激哺乳动物的间充质类干细胞的增殖能力的物质，可以不考虑其来源的使用，优选来自哺乳动物的FGF，例如FGF-1(aFGF)或FGF-2(bFGF)。bFGF市售的有来自人、来自牛的bFGF，可以容易得到。来自哺乳动物的其他FGF由于与受体是共通的，在本发明中也可以使用。
以bFGF为代表的各种FGF与其他增殖因子一样可以用于各种各样细胞的培养，例如可以用于造血干细胞(特开平11-103856号公报)、软骨细胞(Y.Kato & D.Gospodarowicz，J.Cell Biol.，vol100，477-485，1985年)的培养。然而，人们还不知道FGF对来自骨髓、骨膜的间充质类干细胞多分化能力的保持、体外寿命(LifeSpan)的延长和增殖次数的增加具有显著效果。
间充质类干细胞
在本发明中，间充质类干细胞来自骨髓和/或骨膜，而且是具有能够分化为间充质组织类的组织，例如脂肪组织、软骨组织或骨组织的多能性的未分化的细胞。间充质类干细胞可以从含有该细胞的任意的骨髓或骨膜中采集，由于细胞可大量采集以及采集容易，所以优选从大腿骨、胫骨和骨盆(髂骨)采集。至于人以外的哺乳动物也可以从髂骨和胫骨等采集间充质类干细胞。
作为来自骨髓的间充质类干细胞的采集方法，可以使用公知的方法，例如在医疗中使用的任意的采集方法。在从人以外的哺乳动物的骨髓采集该干细胞时，作为实验室方法如将骨(大腿骨、胫骨)的两端切去，用适于间充质类干细胞培养的培养基清洗骨内，从洗出的该培养液可以得到间充质类干细胞。具体采集方法如下：
(1)将兔的大腿骨、胫骨的两端切去。然后用培养基(例如DMEM培养基)，根据需要用添加了抗生素(青霉素、链霉素等)和肝素的培养基清洗骨内。
如果是人髂骨则从该髂骨的骨髓采集骨髓液。
(2)将洗出的培养基于300×g下离心分离3分钟左右，回收沉淀的骨髓细胞。用适当的培养基(例如含有10％FBS的DMEM培养基)将得到的细胞稀释到适当的浓度，然后接种到细胞培养皿中。培养3天后，附着在培养皿的细胞作为来自骨髓的间充质类干细胞。
从骨膜采集该干细胞，可以使用公知的方法[M.Iwasaki etal.，Endocrinology 132，1603-1608(1993)；J.Fang &B.K.Hall，Developmental Biol.180，701-712(1996)；S.Bahramiet al.，The anatomical Record 259，124-l30(2000)]。例如可以使用下述方法获得：
(1)将兔的大腿骨、胫骨的结缔组织等软组织等剥离，使骨膜露出，然后切成适当大小进行采集。将采集的骨膜细细切碎后，在37℃下用胶原酶进行处理。
(2)然后用移液管吹打等使细胞游离，经过滤或离心分离收集细胞。对所得细胞进行计数，用适当的培养基(例如含有10％FBS的DMEM培养基)稀释到适当的浓度，然后接种到细胞培养皿中。培养3天后，附着在培养皿的细胞作为来自骨膜的间充质类干细胞。
使用这样的方法可以得到104～105个左右的间充质类干细胞。分离到的间充质类干细胞可以直接接种进行培养，但通常都是在适当的培养基中培养10～20天左右之后再使用。另外也可以将该细胞冷冻保存。
间充质类干细胞的培养方法
象上述那样得到的干细胞可以在添加了bFGF的适于该细胞培养的任意培养基中进行培养，添加的bFGF浓度通常为0.01～100ng/ml，优选为0.04～10ng/ml，更优选为0.1～1ng/ml，例如添加1ng/ml。培养可以在适于哺乳动物细胞培养的任意条件下进行，一般优选在37℃，有5％CO2存在下进行培养，例如可以如下述那样进行培养：
(3)如上述那样将附着在培养皿中的间充质类干细胞于适当的培养基(例如含有10％FBS的DMEM培养基)中在37℃，有5％CO2存在下进行培养。
(4)培养基3天换一次。bFGF例如可以从第5天开始按照1ng/ml添加到培养基中。
另外，干细胞的传代培养可以使用在该细胞培养领域内公知的合适的方法进行。例如从接近汇合的(confluent)初代培养的培养板收集细胞，将其接种到适当的含有bFGF的培养基中，在与初代培养相同的条件下进行培养，然后在细胞接近汇合之前进行传代培养。具体来说可以如下述那样进行传代培养：
(5)上述(4)的初代培养在10天前后接近汇合程度。将该培养板用胰蛋白酶(例如0.05％)+EDTA(例如0.2mM)进行处理，然后从培养板中回收细胞，对得到的细胞进行计数。
(6)将培养的干细胞以5×103个细胞/cm2的密度接种到含有bFGF(1ng/ml)的培养基中进行培养，在细胞接近汇合之前进行传代培养。
(7)反复进行上述(6)的操作，进行传代培养。
使用本发明的培养方法，间充质类干细胞的增殖可以超过15代、优选超过25代，更优选超过30代，传代培养期在16天以上、优选在20天以上，较优选在30天以上，更优选在40天以上，最优选在50天以上都不停止，可以得到非常多的干细胞。另外培养的该干细胞能够分化成间充质类的各种组织，例如软骨组织或骨组织。
为了从培养的间充质类干细胞获得软骨细胞(组织)，用胰蛋白酶对该干细胞进行处理，然后经离心分离等分离后，移至悬浮培养系统、琼脂糖培养系统或海藻酸培养系统中，使用适于诱导软骨分化的培养基、例如使用M.F.Pittenger等，Science 284，143-147，1999年中记载的培养基可以诱导软骨细胞。
另外为了从间充质类干细胞获得骨细胞(组织)，用胰蛋白酶对该干细胞进行处理，然后经离心分离等分离后，使用适于诱导骨分化的培养基、例如使用上述M.F.Pittenger等人报道的培养基可以诱导骨细胞。
附图的简单说明
图1是通过[细胞数/培养天数]表示FGF添加组中细胞增殖的曲线。
图2是通过[代数/培养天数]表示FGF添加组中细胞增殖的曲线。
图3是由于添加bFGF引起的软骨分化诱导前的组织的显微镜照片。
图4是由于添加bFGF引起的软骨分化诱导后的组织的显微镜照片。
图5是表示在bFGF(1ng/ml)存在或不存在下兔间充质类干细胞(来自髂骨(I)，来自胫骨(T)细胞)(A，B)和人间充质类干细胞(C)的细胞增殖图。
图6是表示FGF对间充质类干细胞的软骨分化能力的影响的图，在FGF存在(A-C)或不存在下(D)进行培养的间充质类干细胞的软骨分化诱导2天(A)、4天(B)和8天(C，D)的间充质类干细胞的培养板，以及在FGF存在下经3、6、9、12次传代培养的细胞培养板的显微镜照片。
图7是表示于FGF(+)或FGF(-)中进行传代培养的间充质类干细胞的软骨分化能力的图，表示软骨诱导的间充质类干细胞的葡糖胺聚糖含量(A)、碱性磷酸酶活性(B)和软骨特异基因(II型胶原，X型胶原)的表达(C)。
图8是表示于FGF(+)或FGF(-)中进行传代培养的间充质类干细胞的骨分化能力的图，表示高密度或低密度接种的间充质类干细胞的钙含量(A，B)、碱性磷酸酶活性(C)和骨特异基因(骨唾液蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OP)和骨钙素(OC))的表达(D)。
图9是表示于FGF(+)或FGF(-)中进行传代培养的间充质类干细胞的脂肪细胞分化能力的图，表示向脂肪细胞分化的FGF(+)细胞(A)、FGF(-)(B)细胞的显微镜照片，以及脂肪细胞特异基因(PPAR-γ2)的表达(C)。
以下通过实施例进一步详细地说明本发明。但本发明并不限定于这些实施例。
具体实施方式
实施例
实施例1间充质类干细胞的培养
1)间充质类干细胞的采集
1-1)从骨髓采集干细胞
从4周龄兔的大腿骨、胫骨除去肌肉和韧带等，并切去两端。然后用DMEM培养基(含有32单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素和6000单位/ml肝素)洗骨髓内部。将洗出的培养基离心分离(300×g，3分钟)，将沉淀的骨髓细胞用含有10％FBS的DMEM培养基稀释后，接种到2×108个细胞(含红细胞)/10cm培养皿中。细胞于37℃，有5％CO2存在下培养3天，附着的细胞(约2000个细胞/培养皿)作为来自骨髓的间充质类干细胞。
1-2)从骨膜采集干细胞
将4周龄兔的大腿骨、胫骨的结缔组织等软组织等剥离，使骨膜露出，然后切出约5×5毫米大小的骨膜。除去附着在骨膜的软组织后，细细切碎，于37℃下用0.1％胶原酶处理120分钟。然后通过用移液管吹打等使细胞游离，经过滤收集细胞，用PBS洗3次。将细胞用含有10％FBS的DMEM培养基稀释后，对细胞进行计数，接种到2×105个细胞/10cm培养皿中。细胞培养3天，附着的细胞作为来自骨膜的间充质类干细胞。
2)间充质类干细胞的培养
将从骨髓采集的间充质类干细胞于含有10％FBS的DMEM培养基中进行培养，每3天换一次培养基。对于来自骨膜的细胞从第2天开始，对于来自骨髓的细胞从第5天开始按照1ng/ml向培养基中添加bFGF，对照组什么也不添加。两组都在10天前后大致接近汇合。将这些培养板用0.05％胰蛋白酶+0.2mM EDTA处理5分钟，分离增殖的干细胞。用Coulter计数器(Z1シンダル，コ-ルタ-公司生产)对得到的细胞进行计数，然后以5000个细胞/cm2的密度接种细胞。在进行传代培养时也1ng/ml浓度添加bFGF。图1(细胞数/培养天数)和图2(代数/培养天数)的曲线给出了添加bFGF组和对照组的间充质类干细胞的培养结果。
如果用没有添加bFGF的过去的培养法(对照组)，虽然到培养10天为止(15代前后)一直可急剧增殖，但此后细胞增殖停止。与此相对，本发明的培养法，不但20天前后看不到增殖速度有一点降低，即使培养30天(约30代)后还继续增殖。另外使用本发明的培养方法在培养50天后可以得到是对照组105倍的间充质类干细胞(参照图1和2)。
实施例2软骨分化的诱导
对实施例1培养的间充质类干细胞(培养后16天的添加bFGF组、对照组)用0.05％6胰蛋白酶+0.2mM EDTA处理5分钟，分离培养的间充质类干细胞。然后将2.5×105个细胞移至15ml试管(聚丙烯制)，于1000×g下离心分离5分钟，除去含有FBS的DMEM培养基。向分离的细胞中添加下述组成的软骨分化诱导培养基，进行离心管培养。
                 软骨分化诱导培养基
高葡萄糖αMEM培养基
10ng/ml TGFβ1
100nM地塞米松
50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸
100μg/ml丙酮酸钠
ITS-+6.25μg/ml转铁蛋白
     6.25μg/ml胰岛素
     6.25ng/ml硒酸
     5.33μg/ml亚油酸
     1.25mg/ml牛血浆白蛋白
将间充质类干细胞于上述培养基中在37℃、5％CO2存在下进行培养。在培养开始24小时后，细胞形成球状的丸。每隔2天换一次培养基，培养14天。
制备培养前和培养后的丸状的样品，进行甲苯胺蓝染色。结果在bFGF添加组，由于作为细胞块的形态和细胞外基质的蛋白多糖的染色性，可以看到诱导前虽然处于未分化状态(图3)，但在培养后诱导出软骨组织(图4)。而在对照组没有观察到软骨细胞。另外软骨分化诱导前的间充质类干细胞的细胞形态，在bFGF添加组仍保持着该干细胞的形态，但在对照组可以观察到成纤维细胞样的细胞等。这些结果被归纳在下表。
                       表1
             保持分化诱导前         软骨分化诱导
             干细胞的形态       软骨分化    比率(％)
bFGF添加组       ++               +++         100
对照组           -                -           0
实施例3骨化的诱导
与实施例2同样收集培养后16天的间充质类干细胞(bFGF添加组、对照组)，然后移至下述组成的骨分化诱导培养基。
               骨分化诱导培养基
    αMEM培养基
    10％FBS
    100nM地塞米松
    10mMβ甘油磷酸
    50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸
将干细胞于上述培养基中在37℃、5％CO2存在下进行培养。每隔2天换一次培养基，培养12天。
对培养后的细胞用茜素红染色进行观察，结果表明在bFGF添加组正在钙化。而在对照组虽然也观察到钙化，但其水平与bFGF添加组相比要低得多。这些结果被归纳在下表。
                         表2
                   骨分化诱导
bFGF添加组            +++
对照组                +
实施例4  在各种间充质类干细胞增殖中的作用
与实施例1同样得到来自兔髂骨和胫骨骨髓的间充质类干细胞。来自人胫骨骨髓的间充质类干细胞从BioWhittakerInc.(Walkersville，MD)得到。来自兔的间充质类干细胞接种到2×108个细胞(含红细胞)/10cm培养皿中，来自人的间充质类干细胞以103个细胞/cm2接种，于bFGF存在(1ng/ml)或不存在下进行培养。传代如果是来自兔的间充质类干细胞以5×103个细胞/cm2接种，如果是来自人的间充质类干细胞则以103个细胞/cm2接种。(参照实施例1)。有关各间充质类干细胞的培养独立地进行2次。结果如图5所示。
在图5中，可观察到来自兔髂骨(I)和胫骨(T)的间充质类干细胞的增殖率都因bFGF而增加，寿命延长(参照A和和B)。如果是来自人胫骨的间充质类干细胞，在含有人血清的培养基(C)中可以观察到增殖率的增加和寿命的延长。
另外在来自狗髂骨的间充质类干细胞中也可以得到同样的结果(结果没有给出)。
实施例5培养间充质类干细胞的软骨分化能力的验证
1) 组织化学分析
使从4周龄兔采集的间充质类干细胞在FGF(bFGF)存在(FGF(+))或不存在下(FGF(-))增殖，进行3次传代培养，然后移至实施例2中使用的软骨分化诱导培养基，培养2、4、8天，然后进行甲苯胺蓝染色。其结果表明，bFGF软骨分化诱导2天还观察不到软骨细胞的分化(图6-A)，诱导4天，在丸状物的表面可观察到球状细胞(软骨细胞)(图6-B)。诱导8天，所有FGF(+)的间充质类干细胞都成球状(图6-C)。与此相对，在FGF(-)的间充质类干细胞中，与FGF(+)的细胞相比较，软骨分化显著变慢(图6-D)。
另外将经3、6、9和12次传代的FGF(+)的间充质类干细胞同样移至软骨分化诱导培养基培养16天，进行甲苯胺蓝染色。结果表明，进行3～9次传代培养虽然在几乎所有的细胞中都可以观察到间质样组织(图6-E～G)，但随着传代数的增加，甲苯胺蓝染色的软骨蛋白多糖的量也减少。进行12次传代培养，只有一部分细胞变成软骨细胞(图6-H)。
这些结果表明FGF虽然促进间充质类干细胞的软骨分化，但该分化能力随着传代而下降。
2) 通过生物化学和标记基因进行分析
就于FGF(+)和FGF(-)中进行3、6、9和12次传代的间充质类干细胞，在对葡糖胺聚糖含量和碱性磷酸酶活性进行测定的同时也对作为软骨的分子标记的II型胶原和X型胶原的mRNA量进行分析。
(1)方法
葡糖胺聚糖含量按照Bitter和Muir(Anal.Biochem.4(1962)，330-334)的方法进行测定。培养细胞中的碱性磷酸酶活性的测定按照Bessey等(J.Biol.Chem.164(1946)，321-329)方法进行。各mRNA如下述那样通过RT-PCR进行检测。
RT-PCR
使用ISOGEN(Nippon Gene，Tokyo，Japan)从培养细胞提取总RNA。然后第一条链cDNA使用SUPERSCRIPT II RNase H-逆转录酶(Life Technologies，Inc.Rockville，MD)由总RNA 1μg合成。以合成的cDNA为模板，进行25～30循环的PCR扩增，每一循环的PCR条件为：在94℃下变性30秒，然后于65℃下进行引物延伸反应1.5分钟，得到的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行检测。在PCR中使用如下引物组。
引物
兔II型胶原：
    5’-CATACCGGTAAGTGGGGCAAGACTG-3’(SEQ ID NO：1)和
    5’-TGCCCAGTTCAGGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO：2)
兔X型胶原：
    5’-CCCAACACCAAGACACAGTT-3’(SEQ ID NO：3)和
    5’-ATCACCTTTGATGCCTGGCT-3’(SEQ ID NO：4)
GAPDH：
    5’-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3’(SEQ ID NO：5)和
    5’-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3’(SEQ ID NO：6)
(2)结果
作为软骨基质的葡糖胺聚糖含量在FGF(+)和FGF(-)的间充质类干细胞培养物中随着传代数的增加而减少。但FGF(+)的间充质类干细胞培养物中的葡糖胺聚糖含量与FGF(-)的比较要多得多(图7-A)。
同样碱性磷酸酶活性在FGF(+)和FGF(-)的培养物中，随着传代数的增加而减少，但FGF(+)培养物中的碱性磷酸酶活性与FGF(-)的比较水平显著高(图7-B)。
为软骨细胞的分子标记的II型胶原和X型胶原的mRNA量在FGF(+)和FGF(-)中都随着传代而减少，但II型胶原和X型胶原的mRNA量在FGF(+)中的水平比在FGF(-)中高(图7-C)。
这些结果表明FGF在显著增强体外间充质类干细胞的软骨分化能力的同时还抑制由于传代引起的该分化能力的下降。
实施例6培养间充质类干细胞的骨分化能力的验证
验证于FGF(+)和FGF(-)中进行传代培养的间充质类干细胞的骨分化能力。
(1)方法
将人间充质类干细胞以高密度(5000个细胞/cm2)或低密度(1000个细胞/cm2)接种，于FGF存在或不存在下进行3、6和9次传代培养，然后移至实施例3记载的骨诱导培养基进行培养。在对这些培养物中的钙含量、碱性磷酸酶活性进行测定的同时，也对作为成骨细胞中的特征基因的骨唾液蛋白(BSP)、骨桥蛋白和骨钙素的mRNA量进行了分析。
细胞培养物中碱性磷酸酶活性的测定与实施例5相同。钙含量按照Gitelman(Anal.Biochem.18(1967)，521-531)的方法进行测定。
骨唾液蛋白(BSP)、骨桥蛋白和骨钙素的mRNA量使用下述的引物组按实施例5那样通过RT-PCR进行分析。
引物
人骨唾液蛋白(BSP)
    5’-CATTTTGGGAATGGCCTGTG-3’(SEQ ID NO：7)和
    5’-ATTGTCTCCTCCGCTGCTGC-3’(SEQ ID NO：8)
人骨桥蛋白：
    5’-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3’(SEQ ID N0：9)和
    5’-CAGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3’(SEQ ID NO：10)
人骨钙素：
    5’-CCACCGAGACACCATGAGAG-3’(SEQ ID NO：11)和
    5’-CCATAGGGCTGGGAGGTCAG-3’(SEQ ID NO：12)
GAPDH：
    5’-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3’(SEQ ID NO：5)和
    5’-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3(SEQ ID NO：6)
(2)结果
细胞以高密度接种时，细胞的钙含量和碱性磷酸酶活性在传代数或FGF(+)或FGF(-)没有观察到显著的差异(图8-A，C)。但在以低密度接种细胞时，钙含量在FGF(+)比FGF(-)高，并随着传代进行而减少(图8-B)。
另外骨唾液蛋白(BSP)、骨桥蛋白和骨钙素的mRNA量于FGF(+)或FGF(-)中，3次传代和6次传代之间没有显著变化，但在经9次传代的FGF(-)间充质类干细胞培养物中这些mRNA水平减少了(图8-D)。
这些结果表明FGF抑制体外的间充质类干细胞的骨分化能力的下降。
比较例 培养间充质类干细胞的脂肪细胞分化能力的验证
于FGF(+)或FGF(-)中进行传代培养的间充质类干细胞的脂肪细胞分化能力的验证。
将于FGF(+)或FGF(-)中进行4、6、9次传代的细胞移至下述的脂肪细胞诱导培养基中，培养25天，将间充质类干细胞分化诱导为脂肪细胞。
                 脂肪分化诱导培养基
αMEM培养基(高葡萄糖)
10％FBS
1μM地塞米松
0.2mM 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤
向脂肪细胞的分化通过油红染色、以及通过RT-PCR分析作为脂肪细胞分化的分子标记的PPAR-γ2的mRNA来进行验证。RT-PCR使用下述引物组按照实施例5方法进行。
引物
人PPAR-γ2
    5’-CATTCTGGCCCACCAACTT-3’(SEQ ID NO：13)和
    5’-CCTTGCATCCTTCACAAGCA-3’(SEQ ID NO：14)
GAPDH：
    5’-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3’(SEQ ID NO：5)和
    5’-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3’(SEQ ID NO：6)
于FGF(+)和FGF(-)中进行传代培养的间充质类干细胞都同样用油红染色(图9-A，B)。作为脂肪细胞分化的标记的PPAR-γ2的mRNA经9次传代几乎是同样水平。
这一结果表明FGF的有无对间充质类干细胞向脂肪细胞分化没有影响。
使用以往的培养方法在15代前后细胞的增殖就停止了，使用本发明的培养方法，间充质类干细胞可以培养30代以上。另外与以往的培养方法相比得到的细胞数是以往的105～106倍。另外可以抑制每重复传代要下降的多分化能力的下降。通过本发明培养的间充质类干细胞由于保持着向软骨细胞、成骨细胞的分化能力，延长寿命，所以可以供给大量软骨细胞或骨细胞供软骨组织或骨组织的移植用。这对于软骨或骨的移植治疗是非常重要的。
             序列表<110>KATO Yukio<120>间充质类干细胞的培养方法<130>FP1021<141>2001-09-12<150>JP2000-276971<151>2000-09-12<160>14<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1cataccggta agtggggcaa gactg 25<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2tgcccagttc aggtctctta  20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>3cccaacacca agacacagtt  20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4atcacctttg atgcctggct  20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>5gtcaaggccg agaatgggaa 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>6gcttcaccac cttcttgatg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>7cattttggga atggcctgtg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>8attgtctcct ccgctgctgc  20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>9ctaggcatca cctgtgccat acc  23<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>10cagtgaccag ttcatcagat tcatc  25<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>11ccaccgagac accatgagag  20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12ccatagggct gggaggtcag  20<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13cattctggcc caccaactt  19<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>14ccttgcatcc ttcacaagca  20

Claims (10)

1.哺乳动物的间充质类干细胞的培养方法，其特征在于在培养基中添加刺激间充质类干细胞的增殖能力的物质。
2.权利要求1记载的方法，其中，上述物质是成纤维细胞增殖因子(FGF)。
3.权利要求2记载的方法，其中，培养基中添加的FGF的浓度范围为0.04～10ng/ml。
4.权利要求3记载的方法，其中，培养基中添加的FGF的浓度范围为0.1～1ng/ml。
5.权利要求1～4的任一项记载的方法，其中，间充质类干细胞来自于人。
6.使用权利要求1～5的任一项记载的方法获得的保持多分化能力的间充质类干细胞。
7.权利要求6记载的间充质类干细胞，其具有分化成软骨细胞的多分化能力。
8.FGF作为间充质类干细胞的增殖能力刺激物质的用途。
9.间充质类干细胞，其经15代以上传代培养，保持多分化能力。
10.间充质类干细胞，其经16日以上传代培养，保持多分化能力。
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