CN104017100B - 恰玛古多糖提取物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及恰玛古提取技术领域，是一种恰玛古多糖提取物及制备方法；该恰玛古多糖提取物，按下述制备方法得到：第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉。本发明恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量较现有恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量有很大提高，且本发明中使用加热纯净水回流提取，说明本发明恰玛古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，从而降低了生产成本，提高了提取效率，更能满足现有工业化生产的要求。
Description
技术领域
本发明涉及恰玛古提取技术领域，是一种恰玛古多糖提取物及制备方法。
背景技术
从植物中提取的多糖类化合物，具有多种生物学活性，来源广泛，且毒副作用小、质量容易控制等优点，现广泛被作为人体免疫调节剂，如虫草多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、女贞子多糖等的作用已得到临床广泛验证，植物多糖已成为当今药物和功能性食品功效成分研究发展的新方向。
新疆地处欧亚大陆腹地，其特殊的地理环境和气候条件孕育了许多独特的植物资源，其中许多珍稀的药用植物资源在国内仅分布于新疆，许多地方药材品种在成分和功效上也与内地品种不同。恰玛古，学名为芜菁（Brassica rapa L.），为十字花科芸薹属植物，维吾尔语称为“恰玛古”，在全疆各地均有栽培，以肉质根为食用和药用的主要部分，是一种“药食两用”植物。
《中国中草药大全》、《本草纲目》、《维吾尔药志》、《中华人民共和国卫生部药品标准-维吾尔药分册》等药典对恰玛古的植物来源、药材性状(包括块根、叶、花和子)、化学成分、药理作用、功能主治、配方加工等都有详细记载。其中《中华人民共和国卫生部药品标准-维吾尔药分册》中称：“恰玛古子，益肾助阳，健胃消食，散气利尿，用于性欲减退，咳喘气短，腰酸肢软，小便不利，面色无华”。明代医药学家李时珍在《本草纲目》中记载：“恰玛古，苦、温、无毒，主治肿毒、乳痈寒热、急性黄疸，腹结不通等症”。现代的《中国医学大辞典》称：“恰玛古，无毒、治痨虚、通中、益气、利五脏、治热毒风肿、解酒毒”。由此可见，恰玛古具有多种的治疗和保健功能。
现有常用恰玛古的多糖类化合物提取分离方法见（拜年等.新疆医科大学学报，2010，33（11）,1310-1311，）《苯酚 - 硫酸法测定恰麻古儿中多糖的含量》中使用石油醚脱脂、乙醇及沸水回流提取恰玛古中的多糖类化合物，但这种方法存在能耗高、得率低，不能满足现有工业化生产的要求。
发明内容
本发明提供了一种恰玛古多糖提取物及制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有从恰玛古中提取多糖类化合物能耗高、得率低，不能满足现有工业化生产要求的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种恰玛古多糖提取物，按下述方法得到：第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉；第二步，按1克恰玛古干粉中加入10 毫升至30毫升的纯净水计，向恰玛古干粉中加入纯净水回流提取2次至5次，每次回流提取的温度为80℃至100℃、每次回流提取的时间为0.5h至2.5h，每次回流提取后过滤得到滤液，合并滤液得到混合滤液，将混合滤液在水浴中浓缩至浓度为0.1g/ml至0.4g/ml的浓缩液；第三步，在浓缩液中加入1.5倍至18倍浓缩液体积的乙醇水溶液并混合均匀，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60%至90%，在温度为1℃至8℃下醇沉4h至20h，然后在离心机中离心10分钟至15分钟得到沉淀，沉淀经真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入纯净水配置成浓度为0.1mg/ml至5mg/ml的多糖储备液，在多糖储备液中加入1/4倍至1倍多糖储备液体积的sevag试剂，在摇床中振摇1次至4次，每次振摇2分钟至8分钟，振摇后静置10分钟至20分钟取上清液，上清液经水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至质量百分含水量小于12.0%，得到恰玛古多糖提取物。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述恰玛古干片中的质量百分含水量小于等于12.0%；或/和，干燥粉末中的质量百分含水量小于等于12.0%。
上述第二步和第四步中的水浴温度为60℃至100℃；或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥温度为40℃至60℃，真空干燥的压力为-0.09Mpa至-0.06Mpa。
上述sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比为1:1至4:1混匀后得到；或/和，离心机的转速为3000r/min至5000r/min；或/和，恰玛古干粉的粒径为100目至10目；或/和，摇床的振摇频率是100rpm至400rpm。
上述原料恰玛古为完整无病虫害的恰玛古，在原料恰玛古切片前先进行清洗；恰玛古薄片的厚度为0.3厘米至0.8厘米。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种恰玛古多糖提取物的制备方法，第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉；第二步，按1克恰玛古干粉中加入10 毫升至30毫升的纯净水计，向恰玛古干粉中加入纯净水回流提取2次至5次，每次回流提取的温度为80℃至100℃、每次回流提取的时间为0.5h至2.5h，每次回流提取后过滤得到滤液，合并滤液得到混合滤液，将混合滤液在水浴中浓缩至浓度为0.1g/ml至0.4g/ml的浓缩液；第三步，在浓缩液中加入1.5倍至18倍浓缩液体积的乙醇水溶液并混合均匀，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60%至90%，在温度为1℃至8℃下醇沉4h至20h，然后在离心机中离心10分钟至15分钟得到沉淀，沉淀经真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入纯净水配置成浓度为0.1mg/ml至5mg/ml的多糖储备液，在多糖储备液中加入1/4倍至1倍多糖储备液体积的sevag试剂，在摇床中振摇1次至4次，每次振摇2分钟至8分钟，振摇后静置10分钟至20分钟取上清液，上清液经水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至质量百分含水量小于12.0%，得到恰玛古多糖提取物。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述恰玛古干片中的质量百分含水量小于等于12.0%；或/和，干燥粉末中的质量百分含水量小于等于12.0%。
上述第二步和第四步中的水浴温度为60℃至100℃；或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥温度为40℃至60℃，真空干燥的压力为-0.09Mpa至-0.06Mpa。
上述sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比为1:1至4:1混匀后得到；或/和，离心机的转速为3000r/min至5000r/min；或/和，恰玛古干粉的粒径为100目至10目；或/和，摇床的振摇频率是100rpm至400rpm。
上述原料恰玛古为完整无病虫害的恰玛古，在原料恰玛古切片前先进行清洗；恰玛古薄片的厚度为0.3厘米至0.8厘米。
本发明恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量较现有恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量有很大提高，且本发明中使用加热纯净水回流提取，说明本发明恰玛古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，从而降低了生产成本，提高了提取效率，更能满足现有工业化生产的要求。
附图说明
附图1为本发明中液料比对多糖含量的影响曲线图。
附图2为本发明中提取时间对多糖含量的影响曲线图。
附图3为本发明中提取次数对多糖含量的影响曲线图。
附图4为本发明中醇沉中乙醇水溶液的浓度对综合评分的影响曲线图。
附图5为本发明中醇沉时间对综合评分的的影响曲线图。
附图6为本发明中浓缩液浓度对综合评分的影响曲线图。
附图7为本发明中多糖储备液与试剂体积比对除蛋白影响曲线图。
附图8为本发明中三氯甲烷与正丁醇体积比对除蛋白影响曲线图。
附图9为本发明中振摇时间对除蛋白影响曲线图。
附图10为本发明中除蛋白次数对除蛋白影响曲线图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。下面提到的乙醇水溶液的浓度都为体积百分比浓度；纯净水用量按1克恰玛古干粉中加入的纯净水量，纯净水量的单位为毫升。
实施例1，该恰玛古多糖提取物，按下述制备方法得到：第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉；第二步，按1克恰玛古干粉中加入10 毫升至30毫升的纯净水计，向恰玛古干粉中加入纯净水回流提取2次至5次，每次回流提取的温度为80℃至100℃、每次回流提取的时间为0.5h至2.5h，每次回流提取后过滤得到滤液，合并滤液得到混合滤液，将混合滤液在水浴中浓缩至浓度为0.1g/ml至0.4g/ml的浓缩液；第三步，在浓缩液中加入1.5倍至18倍浓缩液体积的乙醇水溶液并混合均匀，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60%至90%，在温度为1℃至8℃下醇沉4h至20h，然后在离心机中离心10分钟至15分钟得到沉淀，沉淀经真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入纯净水配置成浓度为0.1mg/ml至5mg/ml的多糖储备液，在多糖储备液中加入1/4倍至1倍多糖储备液体积的sevag试剂，在摇床中振摇1次至4次，每次振摇2分钟至8分钟，振摇后静置10分钟至20分钟取上清液，上清液经水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至质量百分含水量小于12.0%，得到恰玛古多糖提取物。
实施例2，该恰玛古多糖提取物，按下述制备方法得到：第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉；第二步，按1克恰玛古干粉中加入10 毫升或30毫升的纯净水计，向恰玛古干粉中加入纯净水回流提取2次或5次，每次回流提取的温度为80℃或100℃、每次回流提取的时间为0.5h或2.5h，每次回流提取后过滤得到滤液，合并滤液得到混合滤液，将混合滤液在水浴中浓缩至浓度为0.1g/ml或0.4g/ml的浓缩液；第三步，在浓缩液中加入1.5倍或18倍浓缩液体积的乙醇水溶液并混合均匀，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60%或90%，在温度为1℃或8℃下醇沉4h或20h，然后在离心机中离心10分钟或15分钟得到沉淀，沉淀经真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入纯净水配置成浓度为0.1mg/ml或5mg/ml的多糖储备液，在多糖储备液中加入1/4倍或1倍多糖储备液体积的sevag试剂，在摇床中振摇1次或4次，每次振摇2分钟或8分钟，振摇后静置10分钟或20分钟取上清液，上清液经水浴干燥0.5h或4h后，再真空干燥至质量百分含水量小于12.0%，得到恰玛古多糖提取物。在第二步中，每次回流提取后过滤得到药渣和滤液，然后在药渣中按1克恰玛古干粉中加入10 毫升或30毫升的纯净水计向药渣中加入纯净水进行下次回流提取。
实施例3，作为上述实施例的优化，实施例3中恰玛古干片中的质量百分含水量小于等于12.0%；或/和，干燥粉末中的质量百分含水量小于等于12.0%。
实施例4，作为上述实施例的优化，实施例4的第二步和第四步中的水浴温度为60℃至100℃；或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥温度为40℃至60℃，真空干燥的压力为-0.09Mpa至-0.06Mpa。
实施例5，作为上述实施例的优化，实施例5中sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比为1:1至4:1混匀后得到；或/和，离心机的转速为3000r/min至5000r/min；或/和，恰玛古干粉的粒径为100目至10目；或/和，摇床的振摇频率是100rpm至400rpm。
实施例6，作为上述实施例的优化，实施例6中原料恰玛古为完整无病虫害的恰玛古，在原料恰玛古切片前先进行清洗；恰玛古薄片的厚度为0.3厘米至0.8厘米。
本发明上述实施例中各工艺参数的优选按如下步骤确定：
一、多糖提取（多糖提取中多糖吸光度的测定根据苯酚-硫酸法进行测定）
1．液料比考察
表1为液料比（纯净水和恰玛古干粉之比，即纯净水用量（毫升/克）的平均单因素考察表，按表1中的水平因素进行多糖的提取，然后测定多糖吸光度。
液料比考察平均单因素试验结果：从图1可看出，不同的液料比对本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖的含量有一定的影响，从10:1到20:1这一段来看随着提取纯净水用量的增加，多糖含量增加，但当液料比大于20:1时，多糖含量随着提取纯净水用量的增加而减小，故最佳提取的液料比为20:1。
2.提取时间考察
表2为提取时间的平均单因素考察表，按表2中的水平因素进行多糖的提取，然后测定多糖吸光度。
提取时间考察平均单因素试验结果：多糖溶解于提取介质中需要一定的时间，时间过短，多糖溶解不充分，多糖含量不高。从图2中可看出，提取时间在小于1.5h时，本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖含量随时间的延长而增加；提取时间在超过1.5h后，本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖含量随时间的延长而减小；综合考虑提取时间对多糖结构稳定性的影响；实际提取时间控制在1.5h较为合适。
3.提取次数考察
表3为提取次数的平均单因素考察表，按表3中的水平因素进行多糖的提取，然后测定多糖吸光度。
提取次数考察平均单因素试验结果：原料恰玛古中多糖含量较高，一次性提取不可能将所有水溶性多糖均提取出来，提取次数过少，会造成多糖损失，原料浪费，进而增加成本，而提取次数过多会导致提取液体积过大，增加浓缩步骤的负担，因此选择合适的提取次数，对合理利用恰玛古资源尤为重要。
从图3中可看出，当提取次数低于3次时，本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖含量随着提取次数的增加上升较快，但3次以后，本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖含量上升缓慢，故提取次数控制在3次为宜。
4.正交试验
在单因素试验的基础上，选取液料比、提取时间和提取次数3项作为考察因素，每个因素各取3个水平，进行正交试验设计L9(34)（表4）。以多糖含量为指标，确定最优提取工艺条件，并对最优条件进行验证试验。
正交试验结果：经过正交试验及方差分析得出，3个因素对本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖含量的影响大小依次为C>B>A，即提取次数>提取时间>液料比，最佳提取工艺为A3B3C3，即液料比（V/W）为25:1、提取时间为2h、提取次数为3次。结果见表5和表6。
5.优化工艺的验证
正交试验和单因素试验最佳提取工艺不一样，因此进行优化试验，表7为正交验证试验结果、表8单因素验证试验结果，根据单因素试验分析得出的提取工艺进行3次重复试验，多糖含量平均为44.15%，依据正交试验分析所得出的提取工艺，进行了3次重复试验，多糖含量平均为50.09%，其结果高于前面试验提取得到的多糖含量，表明此优化工艺可行。
6.讨论与结论
正交试验表明，在加热回流提取本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物的工艺中，提取次数是影响多糖提取率的最关键因素，然后依次是提取时间和液料比。试验得出，本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物的最佳工艺条件为液料比（V/W）为25:1、提取时间为2h、提取次数为3次。在最佳条件下，本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖含量平均为50.09%，表明该提取方法稳定可行。
二、多糖醇沉（多糖醇沉中多糖吸光度的测定根据苯酚-硫酸法进行测定）
1.单因素试验
精密吸取浓缩液10ml，共四份，分别选取对多糖醇沉有重要影响的因素：乙醇体积百分比浓度：60%、70%、80%、90%；醇沉时间：4h、8h、14h、20h；浓缩液浓度：0.4g/ml、0.3g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml进行试验，5000r/min离心15min，将沉淀置于恒重过（连续两次称重差异不超过5mg）的蒸发皿中蒸干，恒重（连续两次称重差异不超过5mg），精密称重。研磨成粉末并取0.1g加纯净水至100ml容量瓶中定容，然后测定其多糖吸光度得到多糖含量，算其综合评分。
按照综合评分=（标志性成分/最大标志含量）*30+（浸出物量/最大浸出物量）*70，进行筛选。
1.1醇沉中乙醇水溶液的浓度对多糖醇沉的影响
浓缩液浓度为0.4g/ml，醇沉时间为8h，考察醇沉中乙醇水溶液的浓度对多糖醇沉的影响。测定多糖吸光度，算其综合评分。
醇沉中乙醇水溶液的浓度考察单因素试验结果：从图4中可以看出随着醇沉中乙醇水溶液的浓度的增加，所得干燥粉末综合评分增加，故采取最佳醇沉的乙醇水溶液的体积百分比浓度为90%。
1.2醇沉时间对多糖醇沉的影响
浓缩液浓度为0.4g/ml，醇沉的乙醇水溶液的体积百分比浓度为80%，考察醇沉时间对多糖醇沉的影响；然后测定多糖吸光度，算其综合评分。
醇沉时间考察单因素试验结果：从图5中可以看出随着醇沉时间的增加多糖综合评分增加的并不明显，在8h综合评分最高，故采取最佳的醇沉时间为8h。
1.3浓缩液浓度对多糖醇沉的影响
醇沉的乙醇水溶液的体积百分比浓度为80%，醇沉时间为8h，考察浓缩液浓度对多糖醇沉的影响。测定多糖吸光度，算其综合评分。
浓缩液浓度考察单因素试验结果：从图6中可以看出浓缩液浓度越大，综合评分也高，因此最佳提取浓缩液浓度为0.4g/ml。
2.多糖醇沉正交试验
参考单因素实验结果，选取醇沉的乙醇水溶液浓度、浓缩液浓度、醇沉时间3项作为考察因素，每个因素各取3个水平，进行正交试验设计L9(34)（表9）。以综合评分为指标，确定本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物的最优醇沉工艺条件，并对最优条件进行验证试验。
多糖醇沉正交试验结果：经过正交试验及方差分析得出，3个因素对恰玛古多糖含量的影响大小依次为B>A>C，即醇沉中乙醇水溶液的浓度>浓缩液浓度>醇沉时间，最佳提取工艺为A1B3C2，即浓缩液浓度为0.4g/ml、醇沉中乙醇水溶液的浓度为90%、醇沉时间8h。结果见表10正交试验表和表11方差分析表。
由表10和表11可知最佳实验方案为A1B3C2即浓缩液浓度为0.4g/ml，乙醇水溶液的浓度为90%，醇沉时间为8小时。根据直观分析及方差分析可知，三个因素中只有浓缩液浓度和醇沉中乙醇水溶液的浓度对综合评分影响显著，而醇沉时间因素则可以在三水平中选择更节能、更节省时间的水平，所以醇沉时间也可以选择4h。
3．醇沉验证试验
由正交试验表分析出最优条件为A1B3C2，正交表中没有此条件，需做验证试验（表12），依据正交试验分析所得出的提取工艺综合评分的平均值为98.1795，其结果高于前面试验提取得到的综合评分，表明此工艺可行。
4.结论
在多糖的醇沉过程中，浓缩液浓度和乙醇水溶液浓度是影响多糖醇沉的2个关键因素。提取液中由于多糖起始浓度较低，沉淀多糖前一般都需要进行浓缩处理。随着浓缩过程的进行，浓缩比的增大，溶液黏度变大，使得后续的醇沉分离难度加大，导致多糖得率降低，因此浓缩比不宜过大。
三．多糖除蛋白（多糖除蛋白中蛋白质吸光度的测定根据中华人民共和国药典2010版二部附录Ⅶ蛋白质含量测定方法第五法考马斯亮蓝法进行测定；多糖除蛋白中多糖吸光度的测定根据苯酚-硫酸法进行测定）
1.除蛋白单因素试验
精密称取干燥粉末0.5g，加入纯净水配制成250ml多糖储备液，低温保存，待用。每次精密移取多糖储备液20ml，加入不同体积的sevag试剂、不同的振摇时间及除蛋白次数，取上清液，测多糖吸光度以及蛋白质吸光度。
蛋白去除率(％)=(脱蛋白前蛋白含量一脱蛋白后蛋白含量)／脱蛋白前蛋白含量×100
多糖损失率(％)=(脱蛋白前多糖含量一脱蛋白后多糖含量)／脱蛋白前多糖含量×100
根据以上2个指标考察单因素最佳条件。
1.1多糖储备液与试剂体积比对除蛋白的影响
三氯甲烷：正丁醇（V/V）=4:1、振荡时间6min、除蛋白次数1次，考察多糖储备液与sevag试剂体积比。测定多糖吸光度以及蛋白质吸光度。
多糖储备液与sevag试剂体积比考察单因素试验结果：由图7可知，当多糖储备液与sevag试剂体积比为2:1时，多糖吸光度为0.5855，蛋白的吸光度为0.2697，低于其他体积比的蛋白吸光度，蛋白去除率最高，综合考虑，选取多糖储备液与sevag试剂体积比为2:1。
1.2三氯甲烷与正丁醇体积比对除蛋白的影响
多糖储备液与sevag试剂（V/V）2:1、振荡时间6min、除蛋白次数1次，考察三氯甲烷与正丁醇体积比。然后测定多糖吸光度以及蛋白质吸光度。
三氯甲烷与正丁醇体积比考察单因素试验结果：由图8可知，当三氯甲烷与正丁醇体积比为3：1时，多糖的吸光度为0.5806，相对较低，但蛋白吸光度为0.2765，低于其他体积比的蛋白吸光度，即蛋白去除率最高。综合考虑，三氯甲烷与正丁醇的最优体积比为3:1。
1.3振摇时间对除蛋白的影响
多糖储备液：sevag试剂（V/V）2:1、三氯甲烷：正丁醇（V/V）3:1、除蛋白次数1次，考察振荡时间；然后测定多糖吸光度以及蛋白质吸光度。
振摇时间考察单因素试验结果：由图9知，当振荡时间为4 min时，多糖的吸光度为0.5848，蛋白吸光度为0.3035，低于其他振荡时间的蛋白吸光度，即蛋白去除率最高，综合考虑，选取振荡时间为4min。
1.4除蛋白次数对除蛋白的影响
多糖储备液：sevag试剂（V/V）2:1、三氯甲烷：正丁醇（V/V）3:1、振荡时间4 min，考察除蛋白次数；然后测定多糖吸光度以及蛋白质吸光度。
除蛋白次数考察单因素试验结果：由图10可知，当除蛋白次数为4次时，多糖的平均吸光度为0.4638，蛋白的平均吸光度为0.2369，蛋白的吸光度最低，即蛋白去除率最高，但是考虑到试剂用量大且有毒性，所以选取3次为最佳试验条件。
2.除蛋白正交试验
参考单因素实验结果，选取多糖储备液与试剂体积比、三氯甲烷与正丁醇体积比、振摇时间和除蛋白次数4项作为考察因素，每个因素各取3个水平，进行正交试验设计L9(34)（表13）。以蛋白去除率为指标，确定本发明上述实施例得到的恰玛古多糖提取物的最优除蛋白工艺条件，并对最优条件进行验证试验。
正交试验结果：经过正交试验及方差分析得出，4个因素对蛋白质含量的影响大小依次为A>D>C>B，即多糖储备液与试剂体积比>除蛋白次数>振摇时间>三氯甲烷与正丁醇体积比，最佳提取工艺为A1B1C3 D3，即多糖储备液与试剂体积比为1:1、三氯甲烷与正丁醇体积为2:1、振摇时间为6min、除蛋白次数为3次。试验中，随着除蛋白次数的增加，蛋白的去除率在增加，但多糖的损失也在增加。结果见表14和表15。
3．除蛋白验证试验
由上图可知最优条件为A1B1C3D3，正交表中没有此条件，需做验证试验（表16）。依据正交试验分析所得出的醇沉工艺，蛋白去除率为74.6886%，其结果高于正交试验中的蛋白去除率，表明此工艺可行。
4.结论
sevag法使蛋白质乳化，能够达到除蛋白纯化多糖的目的，而且sevag法除蛋白对多糖的损失小，该试验的结论对大批量多糖除蛋白有一定的指导意义，可作为多糖除蛋白质的参考依据。
根据上述实施例得到的恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量为10.36%至12.67% ，且使用加热纯净水回流提取；而现有从恰玛古中提取多糖的方法中，都是用石油醚脱脂、乙醇及沸水回流进行提取，提取物中多糖的平均质量百分含量为10.18%，经对比：本发明恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量较现有恰玛古多糖提取物中多糖的平均质量百分含量有很大提高，而现有从恰玛古中提取多糖的方法中使用石油醚脱脂、乙醇及沸水回流进行提取的成本较本发明中采用加热纯净水回流提取的成本高，因此说明本发明恰玛古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，从而降低了生产成本，提高了提取效率，更能满足现有工业化生产的要求。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (2)
1.一种恰玛古多糖提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉；第二步，按1克恰玛古干粉中加入10 毫升至30毫升的纯净水计，向恰玛古干粉中加入纯净水回流提取2次至5次，每次回流提取的温度为80℃至100℃、每次回流提取的时间为0.5h至2.5h，每次回流提取后过滤得到滤液，合并滤液得到混合滤液，将混合滤液在水浴中浓缩至浓度为0.1g/mL至0.4g/mL的浓缩液；第三步，在浓缩液中加入1.5倍至18倍浓缩液体积的乙醇水溶液并混合均匀，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60%至90%，在温度为1℃至8℃下醇沉4h至20h，然后在离心机中离心10分钟至15分钟得到沉淀，沉淀经真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入纯净水配置成浓度为0.1mg/mL至5mg/mL的多糖储备液，在多糖储备液中加入1/4倍至1倍多糖储备液体积的sevag试剂，在摇床中振摇1次至4次，每次振摇2分钟至8分钟，振摇后静置10分钟至20分钟取上清液，上清液经水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至质量百分含水量小于12.0%，得到恰玛古多糖提取物；其中：恰玛古干片中的质量百分含水量小于等于12.0%；干燥粉末中的质量百分含水量小于等于12.0%；在第二步和第四步中的水浴温度为60℃至100℃；第一步、第三步和第四步中的真空干燥温度为40℃至60℃，真空干燥的压力为-0.09MPa至-0.06MPa； sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比为1:1至4:1混匀后得到；离心机的转速为3000r/min至5000r/min；恰玛古干粉的粒径为100目至10目；摇床的振摇频率是100rpm至400rpm；原料恰玛古为完整无病虫害的恰玛古，在原料恰玛古切片前先进行清洗；恰玛古薄片的厚度为0.3厘米至0.8厘米。
2.一种恰玛古多糖提取物的制备方法，其特征在于按下述方法进行：第一步，取适量原料恰玛古切成恰玛古薄片，恰玛古薄片经真空干燥后得到恰玛古干片，然后将恰玛古干片粉碎成恰玛古干粉；第二步，按1克恰玛古干粉中加入10 毫升至30毫升的纯净水计，向恰玛古干粉中加入纯净水回流提取2次至5次，每次回流提取的温度为80℃至100℃、每次回流提取的时间为0.5h至2.5h，每次回流提取后过滤得到滤液，合并滤液得到混合滤液，将混合滤液在水浴中浓缩至浓度为0.1g/mL至0.4g/mL的浓缩液；第三步，在浓缩液中加入1.5倍至18倍浓缩液体积的乙醇水溶液并混合均匀，乙醇水溶液的体积百分比浓度为60%至90%，在温度为1℃至8℃下醇沉4h至20h，然后在离心机中离心10分钟至15分钟得到沉淀，沉淀经真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入纯净水配置成浓度为0.1mg/mL至5mg/mL的多糖储备液，在多糖储备液中加入1/4倍至1倍多糖储备液体积的sevag试剂，在摇床中振摇1次至4次，每次振摇2分钟至8分钟，振摇后静置10分钟至20分钟取上清液，上清液经水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至质量百分含水量小于12.0%，得到恰玛古多糖提取物；其中：恰玛古干片中的质量百分含水量小于等于12.0%；干燥粉末中的质量百分含水量小于等于12.0%；在第二步和第四步中的水浴温度为60℃至100℃；第一步、第三步和第四步中的真空干燥温度为40℃至60℃，真空干燥的压力为-0.09MPa至-0.06MPa；sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比为1:1至4:1混匀后得到；离心机的转速为3000r/min至5000r/min；恰玛古干粉的粒径为100目至10目；摇床的振摇频率是100rpm至400rpm；原料恰玛古为完整无病虫害的恰玛古，在原料恰玛古切片前先进行清洗；恰玛古薄片的厚度为0.3厘米至0.8厘米。
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