CN1379034A - 一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属化学制药领域,具体涉及一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法。本发明结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE Sephadex A-25柱层析,或结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads柱层析、高效液相色谱层析技术,从猪脑中提取、纯化神经节苷脂GM1,纯度达95%以上。本发明减少了传统萃取、纯化方法的环节,降低成本及有害有机溶剂的使用量,制剂过程中保留了神经节苷脂GM1两亲性理化特征,制备过程简单、环保、低成本化,并能提高神经节苷脂GM1制剂的疗效。
Description
技术领域
本发明属生物化学制药领域,具体涉及一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法。
背景技术
神经节苷脂是一类由鞘氨醇、脂肪酸和含唾液酸残基之寡糖而构成的两亲性分子,广泛存在于哺乳类动物细胞膜表面,中枢神经系统含量尤为丰富,是神经细胞膜主要脂质成分之一。神经节苷脂在神经系统发生、分化及生长过程中具有不可或缺的作用,对神经系统损伤后的修复也非常重要,具有促进神经生长和再生、促进突触形成、恢复神经支配功能、保护神经细胞膜等作用。
单唾液酸四己糖神经节苷脂(神经节苷脂GM1)是主要的神经节苷脂之一,能促进各种原因引起的中枢神经系统损伤后的神经重塑与功能恢复,对脑脊髓外伤、脑缺血性损伤及帕金森氏病等具有较好的疗效。由于神经节苷脂组分间结构与特性类同,传统方法分离、纯化单一组分时耗时、费力且需使用大量有害的有机溶剂,目前国内临床应用的同类进口产品价格昂贵。神经节苷脂分子亲水端与疏水端长度相近、极易在水溶液中形成稳定的胶束状态,不利于注射制剂的制备,进口的同类产品采取将其衍生化为钠盐的手段而增加其水溶性,这样不仅增加了制备工序与成本,也因水溶性增加而影响其生物膜及血脑屏障通透性而可能降低疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂(神经节苷脂GM1)制剂的方法。本发明可减少传统萃取、纯化方法的环节、成本及有害有机溶剂的使用量,并在制剂过程中保留神经节苷脂GM1其两亲性理化特征,使制备过程简单、环保、低成本化及提高神经节苷脂GM1制剂的疗效。
本发明采用下述技术方案:
1、取新鲜猪脑组织加入6-20倍体积-30℃冰丙酮后机械匀浆,不锈钢筛分级过滤,制备丙酮粉;
2、丙酮粉加入氯仿∶甲醇∶水(50∶50∶3-10;v/v/v,下同)溶解,去沉渣,上清液加入二分之一量的50mMol/L氯化钠水溶液分提。下层水溶液减压除去有机溶剂,加入蒸馏水后用3000-30万截留分子量的超滤膜超滤,脱盐、浓缩后冰冻干燥得混合性神经节苷脂初提物;
3、上述混合性神经节苷脂初提物经Iatrobeads层析柱层析,得神经节苷脂GM1初纯品,高效薄板层析(HPTLC)后经薄板扫描仪扫描分析,以密度计,神经节苷脂GM1纯度 75%;
上述神经节苷脂GM1初纯品经DEAE Sephadex A-25柱亲和层析,得纯化神经节苷脂GM1,直接由高效液相鉴定、分析,纯度达95%以上;或上述神经节苷脂GM1初纯品经填料为Spherisorb-NH2的高效液相色谱方法纯化,高效液相色谱层析中色谱柱填料为Spherisorb-NH2,直径4.6-10mm,长度150-250mm,流动相为乙腈∶0.1Mol/L磷酸溶液,其比例为65-80∶35-20;流速为0.1-30ml/min;扫描波长为205μm。可得纯度95%以上的神经节苷脂GM1。
4、上述纯化的神经节苷脂GM1冰冻干燥后,精密称量,加入去氧胆酸钠溶液,充分搅拌后得澄清溶液,于3000-10万截留分子量的超滤膜超滤去内毒素及病菌,制备成水针剂,冰冻干燥后成为冻干粉针剂。
用本发明方法,每千克新鲜猪脑组织可获得纯度≥95%的神经节苷脂GM1 300mg左右,丙酮使用量1-2L(回收损耗),氯仿及甲醇使用量各2-3L,最终可制备水溶性或冻干粉针注射剂。本发明利用去氧胆酸钠增溶技术,不对神经节苷脂GM1分子结构作任何修饰,保留其分子的两亲性特征,有效地解决神经节苷脂及神经节苷脂GM1在水中形成胶束状状态、药品制剂困难的问题,从而增加其在体内生物膜、血脑屏障的通透性和临床使用疗效。
本发明采用膜超滤提取技术从猪脑中提取、纯化神经节苷脂GM1,排除了“疯牛病”样致病因子传染的机会(目前尚没有猪感染的报道),减少了制备环节、极大地减少了有机溶剂使用量、提高了制备过程的安全性和环保性,提高了产品的得率和纯度,可进一步制备神经节苷脂GM1去氧胆酸钠助溶新剂型。
具体实施方式
实施例(一):
1、用新鲜猪脑制备丙酮粉:从肉联厂收集新鲜猪脑,去碎骨、剥除脑膜、颅底血管等,蒸馏水清洗,称重后加入10倍冰丙酮于6000转/min匀浆30min,倒入100目不锈钢筛中,收集残渣,滤过液400目不锈钢筛过滤,收集残渣,滤过液继续800目不锈钢筛过滤,收集残渣。汇集全部残渣于40℃水浴下减压旋转蒸发至恒重,得猪脑丙酮粉,得率约为1/8-1/10。回收丙酮蒸馏后可重复利用。
2、总脂提取和分提:
上述丙酮粉称重,首先加入10倍体积氯仿∶甲醇∶水(50∶50∶10,v/v/v,下同)搅拌60min,3000转/min离心10min,收集上清液。沉渣加入5倍体积氯仿∶甲醇∶水(50∶50∶10)搅拌60min,3000转/min离心10min,收集上清液,反复两次。收集所有上清液,加入1/2体积的50mMol/L氯化钠水溶液,搅拌120min,充分混匀后静置分层,取下层水相并在50℃水浴下减压旋转蒸发去有机溶剂。
3、超滤脱盐、去小分子物质:
上述去有机溶剂后的水溶液加入去2倍体积去离子水,用截留分子量为10-30万的超滤膜超滤,浓缩至原体积的1/5时加去离子水至原体积1/4再次超滤,反复三次,最后超滤浓缩至原体积约1/4时冰冻干燥,得混合性神经节苷脂初提物。此步得率约为猪脑湿重的1/100-120。
4、Iatrobeads柱层析初步纯化神经节苷脂GM1:
Iatrobeads干粉200g加入400ml C液搅拌,静止4h,去上清,反复两次后装柱。400ml C液清洗层析柱。10g混合性神经节苷脂初提物加入200ml C液搅拌30min溶解,以300ml/h速度循环上柱,300mlC液洗去硫脂及中性脂。以1500-2500ml D液洗脱,每250ml收集一瓶,HPTLC检测,收集含神经节苷脂GM1的洗脱液,减压旋转蒸发干燥得神经节苷脂GM1初纯品,此步得率约为猪脑湿重的0.5-2.0/1000,以HPTLC板层析后,薄板扫描密度法分析计,神经节苷脂GM1纯度≥75%。
本实施例中C、D液的配制如下:
C液:氯仿∶甲醇为4-9∶1(v/v,下同);
D液:氯仿∶甲醇∶水为50∶50∶3-10。
5、EAE Sephadex A-25柱层析纯化神经节苷脂GM1:
200g DEAE Sephadex A-25干粉加入400ml B液搅拌30min,静止4h,弃上清,然后装柱,400ml A液清洗DEAE Sephadex A-25层析柱。神经节苷脂GM1初纯品10g加入200ml A液磁力搅拌30min,以400ml/h的流速循环上柱,以1500-2500ml E液洗脱,每250ml收集一瓶,经高效液相色谱直接检测,收集含神经节苷脂GM1的洗脱液,减压旋转蒸发干燥,加入50体积的去离子水于10万截留分子量的超滤膜超滤、脱盐,冰冻干燥得神经节苷脂GM1纯品,纯度≥95%,得率约为猪脑湿重的0.3-0.5/1000左右。
本实施例中A、B、E液的配制如下:
A液:氯仿∶甲醇∶水为45∶55∶8-10;
B液:0.45-0.90Mol/L醋酸胺甲醇溶液;
E液:0.05-0.1Mol/L醋酸胺甲醇溶液。
6、去氧胆酸钠水溶液助溶神经节苷脂GM1:精密配制0.8%的去氧胆酸钠水溶液,每毫升去氧胆酸钠水溶液加入上述冰冻干燥的1-50mg神经节苷脂GM1搅拌、混匀,配制成澄清、透明溶液;
7、超滤除菌和热源:上述水溶液于10万截留分子量的超滤膜超滤,除菌及去热源物质,按常规制剂要求分装于棕色安瓿瓶中(2ml或含神经节苷脂GM1 20mg/安瓿),制备成神经节苷脂GM1水溶液制剂;
8、上述神经节苷脂GM1水溶液制剂冰冻干燥即得冻干粉针剂;
9、神经节苷脂GM1的鉴定与定量检测:
A:神经节苷脂高效薄板层析、密度法扫描分析:
a、Gel-60于底线上1cm划出点样线,110℃活化一小时;
b、5μl(含0.1-10μg神经节苷脂GM1或混合性神经节苷脂)样品及标准神经节苷脂溶液点样,真空干燥;
c、氯仿∶甲醇∶0.2%氯化钙(55∶45∶10)展开剂中展开30-50分钟;
d、间苯二酚显色液显色:间苯二酚200mg溶于10ml水中,加入80ml浓盐酸、0.25ml 0.1Mol/L硫酸铜溶液,加水至100ml,喷雾显色;
e、120-150℃显色10分钟;
f、层析板薄板扫描分析:CS-910薄板扫描仪扫描,波长590μm,扫描速度20mm/min,走纸速度20mm/min。以密度法计算神经节苷脂各单组分的百分比含量。B:高效液相色谱(HPLC)方法:
a.色谱柱:填料为Spherisorb-NH2,直径1mm,长度250mm;
b.流动相:乙腈∶0.1Mol/L磷酸溶液,其比例为76∶24;
c.流速:0.1ml/min;
d.扫描波长:205μm;
e.进样体积及样品量:2μl,含0.1-50μg神经节苷脂GM1或混合性神经节苷脂;
f.采用外标法及峰面积比较方法计算神经节苷脂各单组分绝对含量及相对百分含量。
实施例(二):
1、脑制备丙酮粉:
从肉联厂收集新鲜猪脑,去碎骨、剥除脑膜、颅底血管等,蒸馏水清洗,称重后加入6-20倍冰丙酮于6000转/min匀浆30min,倒入100目不锈钢筛中,收集残渣,滤过液400目不锈钢筛过滤,收集残渣,滤过液继续800目不锈钢筛过滤,收集残渣。汇集全部残渣于40℃水浴下减压旋转蒸发至恒重,得猪脑丙酮粉,得率约为1/8-10。回收丙酮蒸馏后可重复利用。
2、总脂提取和分提:
上述丙酮粉称重,首先加入5-20倍体积氯仿∶甲醇∶水(50∶50∶10,v/v/v,下同)搅拌60min,3000转/min离心10min,收集上清液。沉渣加入5倍体积氯仿∶甲醇∶水(50∶50∶10)搅拌60min,3000转/min离心10min,收集上清液,反复两次。收集所有上清液,加入1/2体积的50mMol/L氯化钠水溶液,搅拌120min,充分混匀后静置分层,取下层水相并在50℃水浴下减压旋转蒸发去有机溶剂。
3、超滤脱盐、去小分子物质:
上述去有机溶剂后的水溶液加入去2倍体积离子水,用截留分子量为30万的超滤膜超滤,浓缩至原体积的1/5时加去离子水至原体积1/4再次超滤,反复三次,最后超滤浓缩至原体积约1/5时冰冻干燥,得混合性神经节苷脂初提物。此步得率约为猪脑湿重的1/100-1/120。
4、Iatrobeads柱层析初步纯化神经节苷脂GM1:
Iatrobeads干粉200g加入400ml C液搅拌,静止4h,去上清,反复两次后装柱。400ml C液清洗层析柱。10g混合性神经节苷脂初提物加入200ml C液搅拌30min溶解,以300ml/h速度循环上柱,300mlC液洗去硫脂及中性脂。以1500-2500ml D液洗脱,每250ml收集一瓶,HPTLC检测,收集含神经节苷脂GM1的洗脱液,减压旋转蒸发干燥得神经节苷脂GM1初纯品,此步得率约为猪脑湿重的0.5-2.0/1000,纯度≥75%。
本实施例中C、D液的配制如下:
C液:氯仿∶甲醇为4-9∶1(v/v,下同);
D液:氯仿∶甲醇∶水为50∶50∶10。
5、高效液相色谱纯化神经节苷脂GM1:
色谱柱填料为Spherisorb-NH2,直径4.6mm,长度150mm;流动相:乙腈∶0.1Mol/L磷酸溶液,其比例为65∶35;流速为10ml/min;扫描波长为205μm;进样体积及样品量分别为1ml、含0.5mg上述初纯神经节苷脂GM1;每次运行时间15-20分钟;收集含神经节苷脂GM1的洗脱液,减压旋转蒸发干燥、去乙腈,加入50体积的去离子水于30万截留分子量的超滤膜超滤、去磷酸,冰冻干燥得神经节苷脂GM1纯品,纯度≥95%,得率约为猪脑湿重的0.5/1000左右。
6、氧胆酸钠水溶液助溶神经节苷脂GM1:精密配制0.8%的去氧胆酸钠水溶液,每毫升去氧胆酸钠水溶液加入上述冰冻干燥的10mg神经节苷脂GM1搅拌、混匀,配制成澄清、透明溶液;
7、超滤除菌和热源:上述水溶液于10万截留分子量的超滤膜超滤中除菌及去热源物质后,按常规制备制剂要求分装于棕色安瓿瓶中(2ml或含神经节苷脂GM1 20mg/安瓿),制备成神经节苷脂GM1水溶液制剂;
8、上述神经节苷脂GM1水溶液制剂冰冻干燥即得冻干粉针剂;
9、神经节苷脂GM1的鉴定与定量检测:
A.神经节苷脂高效薄板层析、密度法扫描分析:
a)Gel-60于底线上1cm划出点样线,110℃活化一小时;
b)5μl(含0.1-10μg神经节苷脂GM1或混合性神经节苷脂)
样品及标准神经节苷脂溶液点样,真空干燥;
c)于氯仿∶甲醇∶0.2%氯化钙(55∶45∶10)展开剂中展开30-50
分钟;
d)间苯二酚显色液显色:间苯二酚200mg溶于10ml水中,加
入80ml浓盐酸、0.25ml 0.1Mol/L硫酸铜溶液,加水至
100ml,喷雾显色;
e)120-150℃显色10分钟;
f)层析板薄板扫描分析:CS-910薄板扫描仪扫描,波长590
μm,扫描速度20mm/min,走纸速度20mm/min。以密度法
计算神经节苷脂各单组分的百分比含量。
B:高效液相色谱(HPLC)方法:
a.色谱柱:填料为Spherisorb-NH2,直径1mm,长度250mm;
b.流动相:乙腈∶0.1Mol/L磷酸溶液,其比例为76∶24;
c.流速:0.1ml/min;
d.扫描波长:205μm;
e.进样体积及样品量:2μl,含0.1-50μg神经节苷脂GM1或混合性神经节苷脂;
f.采用外标法及峰面积比较方法计算神经节苷脂各单组分绝对含量及相对百分含量。
Claims (4)
1、一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法,包括神经节苷脂GM1的提取、纯化和制剂制备,具体按下述步骤进行:
(1)取新鲜猪脑组织制备丙酮粉;
(2)丙酮粉加氯仿∶甲醇∶水溶解,去沉渣,氯化钠水溶液分提上清液,下层水溶液减压除去有机溶剂,加蒸馏水后超滤膜超滤,脱盐、浓缩后冰冻干燥得混合性神经节苷脂初提物;
(3)Iatrobeads层析柱层析上述初提物,得神经节苷脂GM1初纯品,
(4)DEAE Sephadex A-25柱亲和层析或高效液相色谱方法纯化初纯品得纯化神经节苷脂GM1,
(5)冰冻干燥纯化神经节苷脂GM1,加去氧胆酸钠溶液,搅拌后溶液于超滤膜超滤去内毒素及病菌,制备成水针剂,冰冻干燥后制成冻干粉针剂。
2、按权利要求1所述的制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法,其特征是所述的制备方法结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE-Sephadex A-25柱层析,或结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads柱层析、高效液相色谱层析技术,从猪脑中提取、纯化神经节苷脂GM1。
3、按权利要求1和2所述的方法,其特征是所述的高效液相色谱层析中色谱柱填料为Spherisorb-NH2,直径4.6-10mm,长度150-250mm,流动相为乙腈:0.1Mol/L磷酸溶液,其比例为65-80∶35-20;流速为0.1-30ml/min;扫描波长为205μm。
4、按权利要求1和2所述的方法,其特征是所述的超滤膜超滤其截留分子量为3000-30万。
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