CN1246316C - 大豆异黄酮主要单体组分的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种大豆异黄酮主要单体组分的分离方法,以含量不低于40%的大豆异黄酮的混合物为原料,以硅胶为吸附剂,以氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤有:样品溶液制备;吸附剂的处理与装柱;上样,样品溶液的加入量为分离柱有效体积的5~15%;洗脱,控制洗脱液流速为每分钟柱有效体积的0.5~1.5%,分段收集洗脱液;定性检测,分别对所收集的洗脱液定性检测,并与对照品进行比较;单体组分的获取,合并相同组分的洗脱液,分别真空浓缩和真空干燥,即得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分。经高效液相色谱法检测,各单体组分的含量均可达到90%以上。
Description
技术领域
本发明涉及从大豆异黄酮中分离得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种主要单体组分的方法。
背景技术
大豆异黄酮是大豆的次生代谢产物,是由多种单体组分构成的混合物。根据化学结构的不同,大豆异黄酮可分为游离型的苷元和结合型的糖苷两大类,其中苷元约占其总量的2~5%,主要包括染料木黄酮和大豆苷元;糖苷约占其总量的95~98%,主要以染料木苷和大豆苷的形式存在。大豆异黄酮四种主要单体组分的化学结构式如下。
染料木黄酮 染料木苷
大豆苷元 大豆苷
大豆异黄酮具有多种生物活性,如抑制脂质过氧化、清除活性氧自由基、防癌抗癌、改善妇女更年期综合症、预防骨质疏松等。近年来的研究表明,大豆异黄酮的生物活性主要体现在染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷这四种单体组分上,而且其不同单体组分的生物活性不同。一般而言,大豆异黄酮的苷元较之糖苷的生物活性强,如在抗脂质过氧化、清除活性氧自由基、类雌激素活性、抗癌作用等方面,染料木黄酮的生物活性大于染料木苷,大豆苷元的生物活性大于大豆苷。同是大豆异黄酮的苷元,染料木黄酮的抗氧化、类雌激素及抗癌活性强于大豆苷元,而大豆苷元的抗溶血能力强于染料木黄酮。
据了解,有关大豆异黄酮提取分离的专利报道较多。例如:USP 5932221发明了丙酮萃取豆粕,再用冰水沉淀分离萃取物中染料木苷的方法,但该技术无法分离得到大豆异黄酮的其它单体组分。USPA 20010010930公开了以脱脂大豆等为原料,经酶解、超滤、离心、酸洗等步骤制备大豆异黄酮苷元的方法,但该法不能得到大豆异黄酮的糖苷,且工艺复杂,条件难以控制。CN 1375492A公开了以大豆胚轴为原料,采用不同溶剂分别萃取大豆异黄酮糖苷和苷元的方法,但其无法使不同糖苷或不同苷元之间得到分离。CN 1174839A公开了从大豆废糖蜜中回收大豆异黄酮的方法,但该方法的主要目的是分离大豆异黄酮的苷元。CN 1349987A公开了用极性大孔树脂法吸附大豆异黄酮的粗提液,以乙醇溶液解吸来纯化大豆异黄酮的方法,CN 1284503A公开了从大豆粕中分离并精制大豆异黄酮的方法,但该两种方法所得产品均为大豆异黄酮多种单体组分的混合物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种分离大豆异黄酮中主要单体组分的方法,此种方法可同时得到纯度较高的染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种单体,为大豆异黄酮在医疗和保健食品等领域的更加精细化利用奠定基础。
本发明的技术方案:以含量不低于40%的大豆异黄酮的混合物为原料,以硅胶为吸附剂,以氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解,配制成浓度为1.0~2.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸洗和碱中和后,水洗至中性,加热(105~115℃)活化,并用洗脱体系溶液浸泡平衡后,常规湿法装入分离柱。
3、上样
将样品溶液加入分离柱,加入量为柱有效体积的5~15%。
4、洗脱
控制洗脱液流速为每分钟柱有效体积的0.5~1.5%,分段收集洗脱液。
5、定性检测
分别对所收集的洗脱液定性检测,并与所需分离的大豆异黄酮主要单体组分的对照品进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液,分别真空浓缩(温度40~60℃)和真空干燥(温度60~80℃),即得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分。
上述方法中,硅胶的优选粒度为37~49μm;洗脱体系中氯仿与甲醇的优选配方为氯仿∶甲醇=5∶1(体积比);分离柱的柱径∶柱高=1∶10~20。
上述方法分离得到的染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分采用高效液相色谱法检测,色谱条件:Agilent 1100 series高效液相色谱仪,色谱柱为Hypersil ODS C18(4.0mm×250mm,5μm),进样量为20μL,流动相为15~40%甲醇(0~10min)和40~55%甲醇(11~40min),流速为0.6ml/min,柱温为25℃,检测波长为254nm。分析结果表明,各单体组分的含量均可达到90%以上。
本发明具有如下有益效果:
1、本发明所述的方法可以使大豆异黄酮中的染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷得到有效分离,各单体组分的含量均可达到90%以上。
2、本发明所述的方法操作简单,设备要求低,条件温和,能有效地保留各单体组分的生物活性。
3、本发明所述方法采用硅胶为吸附剂,并对硅胶的粒度进行了优选,因而在常压下即可使大豆异黄酮的四种主要单体组分得到有效分离,此外硅胶可再生重复使用,有利于降低分离成本。
4、本发明所述方法确定的氯仿-甲醇洗脱体系具有理想的分离大豆异黄酮四种主要单体组分的效果。
5、本发明所述方法确定了样品浓度、上样量、洗脱液流速、分离柱的径高比等工艺参数,有利于保证大豆异黄酮四种主要单体组分的分离效果。
6、本发明所述方法的实施可以促进大豆异黄酮的更加精细化利用。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细说明本发明,但不应对本发明的实施范围构成任何限制。
实施例1
本实施例中,以含量为40.75%的大豆异黄酮的混合物为原料,以37~49μm硅胶为吸附剂,以氯仿∶甲醇=5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解,配制成浓度为1.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后,水洗至pH 6.8,110℃活化2h,再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后,常规湿法装入分离柱。分离柱为φ24×300mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液10ml加入分离柱。
4、洗脱
以1.5ml/min的流速洗脱,分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测,并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液,分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分,即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测,检测结果为:染料木黄酮含量92.3%、大豆苷元含量91.6%、染料木苷含量90.7%、大豆苷含量90.2%。
实施例2
本实施例中,以含量为62.52%的大豆异黄酮的混合物为原料,以37~49μm硅胶为吸附剂,以氯仿∶甲醇=5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解,配制成浓度为1.5mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后,水洗至pH 6.8,110℃活化2h,再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后,常规湿法装入分离柱。分离柱为φ24×300mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液10ml加入分离柱。
4、洗脱
以1.5ml/min的流速洗脱,分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测,并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液,分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分,即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测,检测结果为:染料木黄酮含量93.5%、大豆苷元含量92.3%、染料木苷含量91.5%、大豆苷含量91.8%。
实施例3
本实施例中,以含量为79.32%的大豆异黄酮的混合物为原料,以37~49μm硅胶为吸附剂,以氯仿∶甲醇=5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解,配制成浓度为2.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后,水洗至pH 6.8,110℃活化2h,再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后,常规湿法装入分离柱。分离柱为φ24×300mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液10ml加入分离柱。
4、洗脱
以1.5ml/min的流速洗脱,分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测,并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液,分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分,即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测,检测结果为:染料木黄酮含量95.6%、大豆苷元含量95.2%、染料木苷含量93.8%、大豆苷含量92.1%。
实施例4
本实施例中,以含量为62.52%的大豆异黄酮的混合物为原料,以37~49μm硅胶为吸附剂,以氯仿∶甲醇=5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解,配制成浓度为1.5mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后,水洗至pH 6.8,110℃活化2h,再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后,常规湿法装入分离柱。分离柱为φ28×500mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液30ml加入分离柱。
4、洗脱
以3.0ml/min的流速洗脱,分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测,并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液,分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分,即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测,检测结果为:染料木黄酮含量91.8%、大豆苷元含量91.0%、染料木苷含量90.2%、大豆苷含量90.4%。
Claims (5)
1、一种大豆异黄酮主要单体组分的分离方法,其特征在于以含量不低于40%的大豆异黄酮的混合物为原料,以硅胶为吸附剂,以氯仿-甲醇溶液为洗脱体系,工艺步骤如下:
(1)样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解,配制成浓度为1.0~2.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液,
(2)吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸洗和碱中和后,水洗至中性,加热活化,并用洗脱体系溶液浸泡平衡后,常规湿法装入分离柱,
(3)上样
将样品溶液加入分离柱,加入量为柱有效体积的5~15%,
(4)洗脱
控制洗脱液流速为每分钟柱有效体积的0.5~1.5%,分段收集洗脱液,
(5)定性检测
分别对所收集的洗脱液定性检测,并与所需分离的大豆异黄酮主要单体组分的对照品进行比较,
(6)单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液,分别真空浓缩和真空干燥,即得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分。
2、根据权利要求1所述的大豆异黄酮主要单体组分的分离方法,其特征在于硅胶的粒度为37~49μm。
3、根据权利要求1或2所述的大豆异黄酮主要单体组分的分离方法,其特征在于洗脱体系中的氯仿与甲醇的体积比为5∶1。
4、根据权利要求1或2所述的大豆异黄酮主要单体组分的分离方法,其特征在于分离柱的柱径∶柱高=1∶10~20。
5、根据权利要求3所述的大豆异黄酮主要单体组分的分离方法,其特征在于分离柱的柱径∶柱高=1∶10~20。
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