CN1069903C - 提取大豆中异黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提取大豆中异黄酮的方法，特别是对异黄酮含量高的优质大豆，经溶剂萃取、减压浓缩、柱层析分离等多种生物化学手段，获得高纯度的大豆异黄酮，该方法主要特征在于采用二步水解法，分别提取大豆异黄酮甙、异黄酮甙元、大豆素和染料木素等，用作保健食品和医药品的原料。

Description

提取大豆中异黄酮的方法

一、技术领域

本发明涉及提取大豆中异黄酮的方法，特别是对异黄酮含量高的优质大豆，经溶剂萃取、减压浓缩、水解、柱层析分离等多种生物化学手段，可获得高纯度异黄酮产品。

二、背景技术

近年来，美国科学家研究发现一种特有的防癌物质——三羟基异黄酮(异黄酮水解产物)的结晶体在恶性肿瘤的孕育中可有效地阻滞血管增生的生理过程，断绝养料来源，从而延缓或阻止肿瘤病变的发展。美国的营养和食品学会调查了美国人和日本人的食谱发现，食用豆类食品是日本人癌症发病率低的主要原因，尤其是乳腺癌和前列腺癌的发病率，美国人比日本人高4倍。

大豆中异黄酮是大豆生长过程形成的一类次生代谢产物。至今已发现主要由12种化合物组成，即9种葡萄糖甙和3种相应的配糖体。

我国大豆种质检测结果表明，大豆中异黄酮总含量为0.04-0.5％，差异相当大。异黄酮有许多重要的生理活性，如抗肿瘤、抗雌激素、抗病原菌、抗氧化、抗溶血等活性，尤其是它的抗癌作用，近年来国外研究报道甚多。据最近的医学文献分析和检索系统查询，国外的研究者多将异黄酮作为抗肿瘤药物进行大量的动物和人体实验。他们认为大豆是异黄酮染料木素(Genistein)的重要食物来源。染料木素具有弱雌激素活性，在动物模型中其高浓度可表现出抗雌激素作用。染料木素亦是蛋白酪氨酸激酶的特定抑制剂，它也能抑制DNA拓扑异构酶和其它有关信号传递的关键酶。在离体条件下，染料木素能抑制多种癌细胞生长，其IC₅₀值的范围为5-40μM(1-10mg/ml)。在26次实验性致癌的动物研究中，有17次(占65％)有正效果。[l Messina MJ et al.,Nutr Cancer,1994,21(2):113-31.2Xu X,et al.,J Nutr,1995 sep,125(9):2307-15.3 Barnes S et al.,AdvExp Biol,1996,401:87-100.]特别是异黄酮染料木素可有效防止亚硝基化合物(MNU)所诱导的哺乳动物的乳腺和前列腺癌的发生，并认为作为饮料食用可对癌症病人的化疗后起到保护剂的作用，有效地调节上皮细胞的繁殖和提高抗氧化酶活性。

有些学者还就大豆中的异黄酮在人体中的吸收、循环和转化过程以及其在血液中的浓度进行深入的研究。虽然从大豆食品中所摄取的染料木素水平不足以象对癌症的化学疗法那样抑制成熟的乳腺癌细胞的生长，但此水平已足以调节乳腺上皮细胞的增生，因而起到化学预防的效果。

关于大豆中的异黄酮的研究，国内外近几年已有一些专利申请，主要集中在异黄酮的抗氧化作用(可以用于癌症化疗)，抗骨质疏松和富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清、乳清蛋白及其制备方法等领域。唯有欧洲专利(专利公开号EP101639)中涉及异黄酮的提取工艺，但该提取工艺不足之处有：

1．因用碱液不适用全脂大豆粉的提取；

2．沉淀蛋白质时带走部分异黄酮，回收率偏低；

3．柱层析时用甲醇洗脱，残留甲醇对人体健康有害；

4．产品中一半以上是丙二酰基异黄酮，本发明人检索的国内外有关研究报道，尚未发现其药用价值。

本发明人于1995年12月对大豆中的异黄酮提取工艺进行研究，通过三年来多次实验研究，提出的新工艺，可获得含量95-97％的大豆素、染料木素、大豆甙和染料木甙四种结晶体(可用做HPLC检测标样)；含量大于95％的大豆甙、染料木甙混合物、含量大于95％的大豆素和染料木素混合物(可用做医药原料)及含量30％的大豆甙、染料木甙混合物、含量30％的大豆素、染料木素混合物(可用于食品)等一系列产品。

三、发明的目的

本发明第一个目的在于利用脱脂大豆粉提取异黄酮甙总量为95％以上或异黄酮甙元总量为95％以上的产品用于医药工业原料。

本发明第二个目的在于利用全脂大豆粉或脱脂大豆粉提取异黄酮甙总量为30％或异黄酮甙元总量为30％的产品，用于食品和保健食品工业原料。

本发明第三个目的在于利用脱脂大豆粉提取含量95％以上的大豆素、染料木素和异黄酮甙(即大豆甙和染料木甙混合物)三种产品用于医药工业原料。

四、发明内容

根据上述发明目的，提取大豆中异黄酮的产品及其方法主要内容有：

本发明采用食品级酒精为萃取剂，其优点是提取率高且产品不易变性，适用于全脂豆粉和脱脂豆粉的提取，残渣可用做动物饲料。

本发明采用丙酮为萃取剂，其优点是提取率高，杂质含量少，适用于脱脂大豆粉的提取。此法仅用于医药用纯品单体的提取。

本发明所采用的第一步水解法，其目的是将异黄酮中的丙二酰基异黄酮转化为异黄酮甙，减少柱层析时丙二酰基异黄酮的流失。

本发明所采用的第二步水解法，其目的是将异黄酮甙全部转化为异黄酮甙元，提高产品的药用价值。据国外有关抗肿瘤研究报道，大部分实验材料为异黄酮甙元。

本发明中柱层析所采用的聚酰胺吸附剂比硅胶，纤维素粉、活性炭等其它吸附具有操作简使，再生容易，吸附容量高等优点，特别适用于异黄酮类及其衍生物与水溶性物质的分离。

本发明所采用的液相色谱检测方法具有快速、简便、分离效率高等优点，在流动相的配比、柱温的设定和色谱柱的选择诸方面都做了较大的改进。

大豆中异黄酮的提取技术

根据本发明大豆中异黄酮水解后成份变化及水解物的分类名称如下：

(一)提取：

1、原材料：供试原材料分为两种，一种是全脂大豆粉；另一种是脱脂大豆粉。脱脂方法是将1000克全脂大豆粉置5000ml索氏脂肪提取器中用5000ml正已烷于75℃水浴中加热回流8小时后取出豆粉，挥去残留正已烷即获得脱脂豆粉。

2、提取液的选择：提取黄酮类及其衍生物方法主要有溶剂萃取法，碱提取酸沉淀法等。本发明采用有机溶剂萃取法，它的优点是提取率高且产品不易变性。所选用的有机溶剂为食品级酒精和丙酮两种，前者利用酒精和水的合适配比，适于全脂豆粉和脱脂豆粉的提取，残渣可作为动物饲料；后者用于脱脂大豆提取，残渣不宜作为动物饲料，但萃取液中杂质较少，宜用于医药用纯品单体的提取。

3、提取液成份：第一种提取液：食品级酒精(含量95％)与水的配比为74∶26，(即70％酒精)加0.3％乙酸维持微酸性体系。该提取液既能充分溶解大豆中的异黄酮并使异黄酮在溶液中保持稳定，又尽可能少地溶解大豆蛋白减少干扰物质。第二种提取液为丙酮和0.1M乙酸混合物。

4、相比：实验证明最适合的相比为1∶6(W/V)。表1实验数据表明，占提取液体积83.3％的滤液中，异黄酮浸出总量占79.0％，事实上已有94.8％的异黄酮已溶出，只要加少量新提取液冲洗滤渣，无需再第二次提取。

5、萃取时间与提取物成份：在室温、搅拌和相比为1∶6(W/V)诸条件下，异黄酮的提取率随时间增长而增加，2小时以后已达到最大值(见表2)。实验证明提取时间因搅拌强度不同，以2-2.5小时为宜。

检测结果表明：以豆粉为原料时，提取物中异黄酮甙[大豆甙(daidzin)、黄豆甙(glycitin)和染料木甙(genistin)]占16.28％，丙二酰基异黄酮甙(丙二酰基大豆甙、丙二酰基黄豆甙和丙二酰基染料木甙)占83.72％。未发现异黄酮甙元及乙酰基异黄酮甙。使用工业豆粕为原料时，因榨油工艺所控制的温度不同，提取物中异黄酮组份有所变化，异黄酮甙含量可增至40-50％，而丙二酰基异黄酮甙呈下降趋势。亦未检测出异黄酮甙元和乙酰基异黄酮甙。

(二)浓缩：通常使用减压浓缩，温度可控制在60-65℃，在酒精浓度逐渐降低情况下，温度可上升至75℃以使酒精充分蒸发。待浓缩至相当于原体积的20％时即可停止。实验证明，在减压浓缩过程中，温度可控范围大，异黄酮组分虽随温度上升有所变化，即丙二酰基异黄酮甙含量减少，异黄酮甙含量增加，但异黄酮总含量不变。

(三)第一次水解：根据所获得的产品组分不同，本发明采用二步水解法。第一次水解在柱层析前进行，第二次水解在柱层析后进行。

减压浓度后的溶液(水相)在水浴上水解，温度控制在80+2℃，水解15小时即可。水解前丙二酰基异黄酮甙占80％，异黄酮甙占20％，而水解后丙二酰基异黄酮甙仅占0.4％，水解产物为异黄酮甙(见表3)。

实验证明，由于第一次水解将丙二酰基异黄酮甙转化为异黄酮甙，柱层析分离时，可减少丙二酰基异黄酮甙的流失，提高产品回收率。(见表4.表5)。

实验还证明，由于第一次水解产物经柱层析后去除大量水溶性杂质(主要成分为醣类及水溶性蛋白质等)，第二次水解时不易引起炭化而且溶液颜色较浅，有利于产品的纯化和精制。

本发明之所以特别强调水解方法，其原因是大豆中丙二酰基异黄酮甙可占60-80％。

(四)柱层析分离：

1、层析柱规格：内径3.0×50cm璃璃柱。

2、吸附剂；分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉活性炭等。本发明所用吸附剂为国产聚酰胺吸附剂。其优点是操作简便、再生容易和吸附容量大。据有关资料报道，聚酰胺通过分子中的酰胺羰基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生吸附作用。洗脱时流出先后按母核上酚羟基数目顺序为大豆素(含一个酚羟基)染料木素(含两个酚羟基)。

3、柱层析分离操作步骤：按常规方法装柱后，用水淋洗至无杂质并去除气泡。缓缓倒入水解液，以每分钟5-10ml的速度通过吸附剂，水解液流出后加水淋洗柱子直至流出液无颜色为止。最后用约两倍柱体积的70％酒精洗脱柱子上吸附的异黄酮甙。接收液减压浓缩至干即获得异黄酮甙粗品，经检测该产品异黄酮甙总量为18-30％，可作为食品，保健食品原料。柱层析过程中，大豆中的异黄酮回收率可达95-98％。

(五)第二次水解：将上述柱层析所获得的70％酒精洗脱液，加入适量20％硫酸溶液(三份70％酒精洗脱液加一份20％硫酸溶液)使水解液酒精浓度大于50％，硫酸浓度不超过5％。在80℃±2℃水浴上水解20小时，水解过程中异黄酮组分的变化见表6。

水解液冷却后用10％氢氧化钠或碳酸钠中和，静置一小时过滤，滤液减压浓缩至溶液中无酒精为止。在减压浓缩过程中，随溶液中酒精浓度的降低异黄酮甙元细结晶逐渐析出。悬液静置过夜，过滤，用水洗涤沉淀以去除残留的硫酸钠，60℃烘干后即获得异黄酮甙元含量为30-50％粗品。

(六)纯化：本发明提供三种纯化方法可供选择

1、丙酮萃取法：将异黄酮甙元粗品在50-60℃水浴中搅拌回流一小时，趁热过滤，弃去残渣，滤液减压浓缩至干即得较纯的异黄酮甙元产品。

2、碱溶酸沉淀法：用1％碳酸钠溶液溶解异黄酮甙元粗品，过滤弃去残渣，滤液用5％硫酸溶液中和呈微酸性，析出沉淀静置过夜后过滤，沉淀物用水洗涤至无硫酸钠后烘干即得较纯的异黄酮甙元产品。

3、70％食品级酒精萃取法：将异黄酮甙元粗品在60℃水浴中搅拌回流一小时，趁热过滤，弃去残渣，滤液减压浓缩至干即得较纯的异黄酮甙元产品。

本发明人的实验表明以上三种方法可根据异黄酮甙元粗品中杂质含量不同单独使用或三种方法结合使用。产品中异黄酮甙元含量可达到80-90％。

(七)精制：欲使异黄酮甙元产品含量超过95％，必须进行精制。精制方法是：将纯化后的异黄酮甙元产品，用60％丙酮或60％食品级酒精，在50-60℃水浴中搅拌回流一小时，趁热过滤。滤液冷却后置4℃冰箱中陈化结晶20小时以上，析出的结晶经过滤、洗涤、60℃烘干，以上操作一般重复进行多次，方能获得异黄酮甙元含量为85-95％的纯品。最后用分步结晶法，先得到大豆素结晶，后得到染料木素结晶。二者含量均能达到95以上。

(八)检测：本发明均采用液相色谱法(HPLC)检测原料及不同组分的产品。

1、色谱仪装置：岛津LC-6A泵，CTO-6A恒温柱箱、SPD-6AV紫外-可见光检测器、SIL-6A自动进样器、SCL-6A中央控制系统和C-R6A积分仪。

2、化学品：

(1)标准样品大豆甙(daidzin)染料木甙(genistin)大豆素(daidzein)和染料木素(genistein)均来自美国Sigma公司。

(2)甲醇：优质纯、北京产

(3)乙酸：分析纯、北京产

(4)水：Millipore-Q超纯水

3、色谱条件：

(1)色谱柱：HICHROM Spherisorb S5ODSφ4.9×125mm

(2)流动相：甲醇∶水∶乙酸为25∶70∶5适用于异黄酮甙的检测；

甲醇∶水∶乙酸为30∶65∶5适用于异黄酮甙元的检测。

(3)流速：1ml/min

(4)柱温：60℃

(5)检测器：SPD-6AV

(6)波长：254nm

本发明提供三张附图

图1为本发明实施例1的工艺流程图；

图2为本发明实施例1的工艺流程图；

图3为本发明实施例1的工艺流程图。

实施例1工艺流程参照附图1。

本发明用大豆粉(全脂大豆粉)1000克，用滤布袋装好后放入5000ml索氏脂肪提取器中，在75℃水浴上用5000ml正己烷回流8小时后取出滤布袋，挥去残留的正己烷即为脱脂大豆粉。

称取1000克脱脂大豆粉，装入10000ml烧瓶中，加6000ml 70％酒精0.3％乙酸混合提取液，室温下搅拌提取2小时后过滤，滤渣用少量新提取液清洗三次。滤液在65℃减压浓缩至1000ml后置80℃水浴中水解15小时(第一步水解)，将丙二酰基异黄酮甙全部水解成异黄酮甙。水解液冷却后以5-10ml/min的流速通过φ3.0×50cm聚酰胺层析柱，水解液流完后(注意不要放空，应留0.5cm液层)用水淋洗柱子至流出液为无色透明液体时停止淋洗。用500ml(约两倍柱体积)70％酒精洗脱层析柱。将接收的500ml洗脱液加160ml 20％硫酸溶液置80℃水浴上酸水解20小时(第二步水解)，将异黄酮甙全部水解成异黄酮甙元。取下水解液冷却后缓慢加10％氢氧化钠溶液中和。溶液静置一小时后过滤。再将该滤液于65℃减压浓缩至无酒精为止。悬浊液静置过夜、过滤、用水洗涤沉淀以去除残留的硫酸钠，60℃烘干后获得异黄酮甙元粗品。

产品的纯化、精制方法如上所述。用本实施例可获得95％异黄酮甙元1.25克。

实施例1的工艺特点是：

1、利用70％食品级酒精0.3％乙酸萃取剂，既可应用于脱脂大豆粉的提取又可应用于全脂大豆的提取。提取后的残渣可用做动物饲料。

2、提取液中，可溶性固形物占原料重量的15％，其中可溶性糖占9％，异黄酮甙占1.7％，蛋白质和其它杂质占4.3％，有利于下一步柱层析分离。

3、第一步水解时将全部丙二酰基异黄酮转化为异黄酮甙，柱层析时减少丙二酰基异黄酮的流失。

4、采用吸附容量为2g/100ml对异黄酮类有特异吸附的聚酰胺吸附剂，以减小层析柱的体积。

5、第二步水解时将全部异黄酮甙转化为异黄酮甙元，提高产品药用价值。

6、本实施例所获得的95％异黄酮甙元产品，可达到本发明的第一个目的。

实施例2工艺流程参照附图2

称取1000克脱脂大豆粉，装入10000ml烧瓶中，加6000ml 70％酒精0.3％乙酸混合提取液，室温下搅拌提取2小时后过滤。滤渣用少量新提取液清洗三次，滤液在65℃减压浓缩至1000ml后置80℃水浴中水解15小时(第一步水解)，将丙二酰基异黄酮甙全部水解成异黄酮甙。水解液冷却后以5-10ml/min的流速通过φ3.0×50cm聚酰胺层析柱。水解液流完后用水淋洗柱子至流出液为无色透明液体时停止淋洗。用500ml(约两倍柱体积)70％酒精洗脱层析柱。将接收的500ml洗脱液在65℃下减压浓缩至干即获得30％异黄酮甙产品6.5克(第一种产品)。

如将上述洗脱液加160ml 20％硫酸溶液置80℃水浴上水解20小时(第二步水解)，将异黄酮甙全部水解成异黄酮甙元。取下水解液冷却后缓慢加10％氢氧化钠中和。溶液静置一小时过滤。再将该滤液于65℃减压浓缩至无酒精为止。悬浊液静置过夜后过滤。用水洗涤沉淀以去除残留的硫酸钠。60℃烘干后获得30％异黄酮甙元4克(第二种产品)。

本实施例专为生产异黄酮甙或异黄酮甙元总量为30％的食品和保健食品工业原料而设计的。它具有实施例1中所列举的所有特点。本发明实施例所获得的30％异黄酮甙产品(第一种产品)和30％异黄酮甙元产品(第二种产品)即可达到本发明的第二个目的。

实施例3工艺流程参照附图3。

称取1000克脱脂大豆粉，装入10000ml烧瓶中，加5000ml丙酮0.1M乙酸混合提取液，室温下搅拌提取2小时后过滤，滤渣用少量混合提取液清洗三次。滤液在40℃减压浓缩至干，加500ml 50％酒精溶解固形物，在80℃水浴中水解15小时，水解产物为异黄酮甙。在65℃下减压浓缩至无酒精为止。悬液以5ml/min流速通过φ3.0×50cm聚酰胺层析柱，俟悬浊液流完后用水淋洗柱子至流出液为无色透明液体时停止淋洗。用500ml(约两倍柱体积)70％酒精洗脱层析柱。将接收的500ml洗脱液在65℃下减压浓缩至干即获得异黄酮甙粗品。产品的纯化、精制如上所述，获得含量为95％的异黄酮甙2克。再将异黄酮甙用上述所述的第二步水解法水解，即获得含量为95％异黄酮甙元。最后用分步结晶法，分别获得含量为95％以上的大豆素0.6克和染料木素0.5克。

实施例3的工艺特点是：

利用丙酮和0.1M乙酸为萃取剂，提取物中水溶性杂质(主要为碳水化合物)和影响产品纯化的磷脂类和皂甙类杂质均明显减少，有利于产品的纯化和精制。其它特点与实施例1所列举的特点相同。本实施例所获得的含量为95％的大豆素、染料木素和异黄酮甙(即大豆甙和染料木甙混合物)三种产品，即达到本发明第三个目的。

表1溶剂萃取次数与异黄酮提取率的关系

项目	第一次	第二次	第三次	合计
					豆粉重量提取液体积滤液体积滤液/提取液异黄酮总量提取率	300g1800ml1500ml83.3％1434mg79.0％	-1500ml1430ml79.4％314mg17.3％	-1500ml1490ml82.8％67mg3.7％	300g4800ml4420ml92.1％1815mg100.0％

表2萃取时间与异黄酮提取率的关系

萃取时间	0.5	1.0	1.5	2.0	3.0	4.0	5.0小时
								提取率％	91.30	93.96	96.67	99.02	100	98.18	97.68

表3第一次水解时间与异黄酮组分的变化(单位：ng/10μl)

水解时间(小时)	0	4	8	12	14	15
							大豆甙黄豆甙染料木甙丙二酰基大豆甙丙二酰基黄豆甙丙二酰基染料木甙	1190184163855023625562	3886386424022401722020	5922496581752760520	626752860841353151	63585386166522820	6357537616432611
合计	14438	13044	13342	13096	13162	13098

表4未水解浓缩液*柱层析流出液异黄酮流失率

层析流出液	1	2	3	流失量mg	流失率％
						流出液量	200ml	200ml	100ml
大豆甙染料小甙丙二酰基大豆甙丙二酰基染料木甙流失量mg流失率％	0.16-9.893.3913.440.35	0.92-6.000.587.500.20	1.00-8.101.3010.400.27							2.08-23.995.2731.34	0.05-0.630.130.82

^*浓缩液总量500ml，异黄酮总量3800mg。

表5未水解浓缩液柱层析洗涤液中异黄酮流失率

洗涤液号	1	2	流失量mg	流失率％
					洗涤液量	650ml	200ml
大豆甙黄豆甙染料木甙丙二酰基大豆甙丙二酰基黄豆甙丙二酰基染料木甙流失量mg流失率％	0.6517.71-76.023.0912.48110.002.94	-6.60-43.701.204.9156.411.51						0.6524.31-119.724.2917.39166.41	0.020.65-3.200.110.464.44

表6第二次水解时间与异黄酮组分的变化(单位：ng/μl)

水解时间(小时)	0	8	14	20
					大豆甙染料木甙大豆素染料木素	296.2291.1-5.2	60.055.4154.5128.4	14.312.5172.7144.5	3.6-182.2152.2
合计	592.5	398.9	344.0	338.0

Claims (9)

1．提取大豆中异黄酮的方法，包括全脂大豆粉脱脂、溶剂提取、过滤、滤液水解、柱层析分离、减压浓缩、纯化精制的步骤，其特征在于所述水解采用二步水解法：第一步水解是从大豆中提取异黄酮甙；第二步水解是从异黄酮甙中提取异黄酮甙元。

2．依照权利要求1所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于所述溶剂70％酒精。

3．依照权利要求1或2所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于用所述70％酒精提取后滤液经浓缩进行所述第一步水解，再经所述柱层析分离，将洗脱液进行所述第二步水解，经中和、浓缩、纯化，精制制取纯度可达95％以上的异黄酮甙元。

4．依照权利要求1或2所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于用所述70％酒精提取后的滤液经浓缩进行所述第一步水解，再经所述柱层析分离，将洗脱液进行减压浓缩，制取纯度可达18-30％的异黄酮甙。

5．依照权利要求4所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于将所述异黄酮甙进行第二步水解，经中和、减压浓缩，制取纯度可达18-30％的异黄酮甙元。

6．依照权利要求1所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于所述溶剂为丙酮。

7．依照权利要求1或6所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于将丙酮提取后的滤液进行第一步水解，经柱层析分离，将洗脱液浓缩、纯化、精制，制取纯度可达95％以上的异黄酮甙。

8．依照权利要求7所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于将所述异黄酮甙分步结晶，制取大豆甙和染料木甙。

9．依照权利要求8所述的提取大豆中异黄酮的方法，其特征在于将所述染料木甙进行第二步水解制取其纯度达95％以上的染料木素。

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