CN1179421A - 将植物蛋白异黄酮结合物两步转化成异黄酮甙元的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了将植物蛋白原料中的异黄酮结合物转化成异黄酮甙元的方法,该方法为将含有异黄酮结合物的植物蛋白原料制成含水混合物,将异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙,并且将异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元。植物蛋白原料也可以含有被转化成异黄酮甙元的异黄酮葡萄糖甙。在转化过程之前、当中或之后可以从植物原料中脱除存在于植物蛋白原料中的异黄酮结合物、异黄酮葡萄糖甙或异黄酮甙元。

Description

将植物蛋白异黄酮结合物两步转化成异黄酮甙元的方法
本发明涉及将植物蛋白原料中的异黄酮结合物两步转化成异黄酮甙元的方法。本发明还涉及所得的含有异黄酮甙元的产品。
异黄酮类化合物存在于各种豆科植物中，包括如大豆这样的植物蛋白原料。这些化合物包括大豆黄苷、6″-OAc大豆黄苷、6″-OMal大豆黄苷、大豆黄素、染料木苷、6″-OAc染料木苷、6″-OMa l染料木苷、染料木素、黄豆黄苷(glycitin)、6″-OAc黄豆黄苷、6″-OMal黄豆黄苷、黄豆黄素、鸡豆黄素A、刺芒柄花素和拟雌内酯。这些化合物一般与大豆固有的苦味有关。在生产如大豆分离物和浓缩物等市售产品的过程中，关键在于除去这些物质。例如，常规生产大豆分离蛋白的方法是用强碱水溶液提取大豆薄片，其中大部分异黄酮溶解在了提取液中，并且在提取物中保持溶解状态，而该提取液通常在随后的酸沉淀蛋白形成分离物后被弃掉。残存在酸沉淀分离蛋白中的异黄酮也常常通过彻底清洗分离物而除去。
近来人们已认识到，植物蛋白如大豆中所含的异黄酮可以抑制人体癌细胞如乳腺癌细胞和前列腺癌细胞的生长，这些在以下文献中有所描述：Peterson和Barnes在Biochemical and Biophysical Research，Communications(Vol.179，No.1，pp.661-667，1991，8，30)中的“Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast CancerCells，Independence from Estrogen Receptors and the Multi-DrugResistance Gene”；Peterson和Barnes在The Prostate(Vol.22，pp.335-345(1993))中的“Genistein and Biochanin A Inhibitthe Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal GrowthFactor Receptor Tyrosine Autophosphorylation”以及Barnes等人在Mutagens and Carcinogens in the Diet(pp.239-253(1990))中的“Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer”。
上述异黄酮中，有一些是和葡萄糖分子结合，以糖苷即葡萄糖甙形式存在的。其中的一些葡萄糖甙，如6″-OAc染料木苷或6″-OMal染料木苷，分别含有乙酸酯基或丙二酰基，这些基团结合在葡萄糖分子本身的第六位上。这种类型的化合物，即在葡萄糖部分结合有附加部分的化合物，通常称作“结合物”。所有异黄酮，包括其糖苷，都具有医用价值，但最具价值的特定异黄酮是没有结合葡萄糖部分的甙元。这类特定的异黄酮有大豆黄素、染料木素和黄豆黄素。这些甙元具有以下通式：其中R1、R2、R3和R4可以选自基团H、OH和OCH3。因此，本发明涉及的是甙元和富集这些物质的植物蛋白材料。
现有技术已有将葡萄糖异黄酮甙转化成异黄酮甙元的方法，如在Obata等人的JP专利申请特开258,669中有所描述。这些方法仅能达到中等转化程度，因而并不理想，特别是对大规模工业化生产而言。此外，已知方法中，如‘669申请记载了从蛋白原料中除去异黄酮的方法，却没有描述如何制备富含异黄酮甙元的植物蛋白材料。
生产富含特定异黄酮甙元的植物蛋白衍生物如蛋白提取物、蛋白乳清和浓缩蛋白制品的方法也是已知的，该方法是通过将异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元而实现的，如目前正在审查当中的已公开专利申请PCT/US94/10697、PCT/US94/10699和PCT/US94/10696所描述的方法，它们也均属于本申请的受让人。由此可见，本领域需要一种将至少大部分且优选基本上全部的异黄酮结合物转化成异黄酮甙元的方法，以及生产富含异黄酮甙元的植物蛋白材料的方法。
本发明的目的是提供一种富含异黄酮甙元的材料，以及从含有异黄酮结合物的植物蛋白原料中生产该材料的新方法。
本发明提供了将异黄酮结合物转化成异黄酮甙元的方法。该方法为：制成含有异黄酮结合物和水的混合物，并且在pH约6-约13.5和温度约2℃-约121℃下处理该混合物，使大部分异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙。然后再使异黄酮葡萄糖甙和能够裂解异黄酮糖苷键的酶在pH约3-约9温度约5℃-约75℃下接触，以使混合物中的异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元，其中所说的异黄酮葡萄糖甙既包括由异黄酮结合物转化过来的异黄酮葡萄糖甙，又包括混合物中原始存在的异黄酮葡萄糖甙。本发明还包括所述方法的各种改变方式，即在两步转化过程之前、转化当中或之后从植物原料中分别脱除存在于植物蛋白原料中的异黄酮结合物、异黄酮葡萄糖甙或异黄酮甙元。
本发明的新方法是用于至少将大部分异黄酮结合物转化成异黄酮甙元的两步方法。优选转化存在于植物蛋白或植物原料中的异黄酮结合物。现已发现，该方法能够确保将基本上全部异黄酮结合物和异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元。第一步是将异黄酮结合物转化成异黄酮甙，异黄酮甙在这里也称为异黄酮葡萄糖甙。第二步是将异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元，所说的异黄酮葡萄糖甙既包括第一步产生的又包括植物原料原始存在的。在某些植物蛋白原料，特别是大豆蛋白原料中，植物蛋白原料中的所有异黄酮基本上是以异黄酮结合物的形式存在的，因此，在异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元之前先将异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙可以大大增加异黄酮甙元从植物蛋白原料中的可获得量。
本方法优选实施方案中的起始原料是包含异黄酮结合物的任何植物蛋白或植物原料。虽然优选实施方案的方法中相应描述的仅是大豆产品，但本方法还可通用于除大豆或大豆原料外的各种广泛的植物蛋白原料。此外，本发明中“大豆原料”是指大豆或任何类型的大豆衍生物。
本发明的方法有一些不同的实施方案。在第一个实施方案中，在异黄酮化合物保留在植物蛋白原料中的同时将异黄酮结合物转化成异黄酮甙元形式。这样可以把所产生的异黄酮甙元留在植物蛋白原料中，或者也可以将其分离出来。异黄酮的甙元形式一般是通过溶剂或者通过非水溶液浸出或提取法来分离的。适用于这个操作的溶剂包括(但不限于此)丙酮、乙醇和其它类似有机溶剂。在一些应用当中，如果系统的碱性pH足以使甙元形式容易溶解于此，则还可以考虑使用水提取法。
第二个实施方案中，异黄酮结合物被转化成异黄酮葡萄糖甙是在植物蛋白原料中进行的。然后通过水浸出或提取法将异黄酮葡萄糖甙从植物蛋白原料中分离出来。水浸出可以通过浸泡植物原料来实现，另外可以将植物原料置于或浸入水或其它可和水相溶的溶剂如乙醇或其它醇的混合物中，使相对可溶性的异黄酮葡萄糖甙浸出。所得含水系统的pH为约4-约11，特别优选约7。分离出来之后，再将异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元形式。
第三个实施方案中，在进行任何转化过程之前，先将异黄酮结合物从植物蛋白原料中分离出来。由于异黄酮的结合物形式相对可溶于水，可以按前述那样通过水浸出或提取法将异黄酮结合物从植物蛋白原料中分离出来。分离出来之后，再将异黄酮结合物转化成葡萄糖甙形式，然后转化成甙元形式。
根据含异黄酮结合物的植物原料的类型，某些情况下有必要将植物原料加工成细分的形式。最好是使含在植物原料中的异黄酮化合物能够进入第一和第二步中某一步或者两步都使用的各种试剂中，以下再进行更加详细的描述。原料可以磨碎、轧碎，或者通过现有技术已知的常规方法作其它处理。如果植物原料的状态致使其中的异黄酮化合物容易进入外加试剂或反应剂中，例如某些植物的小叶状部分，则可以不需要将植物原料进行这样的处理。
在第一转化步骤或操作中，植物蛋白原料中的异黄酮结合物通过化学反应被转化成异黄酮甙。该反应在特定的pH和温度范围结合下特别快速和有效。优选将植物蛋白原料引入装有足够量水的反应罐或其它合适容器中。只要能够制成相对均匀的植物蛋白原料混合物或分散液，水的量就不必作过多限制。适于第一转化步骤的pH范围优选约6-约13.5。现已发现异黄酮结合物转化异黄酮葡萄糖甙是碱性催化的，所以最优选使用高pH以达到快速转化。适于第一步的最优选pH为约11。pH的调节可以通过添加任何能够提高系统pH的合适的碱、苛性剂或碱性试剂，如氢氧化钠来进行。
适于第一步的温度优选约2℃-约121℃。要根据pH来确定最优选的温度。发明人发现，当pH相对较高时，转化可以在较低的温度下迅速进行。pH约9时，进行有效转化的温度范围在约45℃-约75℃之间，最优选约73℃的温度。pH约11时，温度范围优选约5℃-约50℃，最优选约35℃。当pH相对较低时，转化可以在较高的温度下进行。例如，pH约6时转化可以在约80℃-121℃温度范围内进行。
在将异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙的整个期间，混合物优选保持在相对恒定的温度下。但在某些情况下，最好可以在第一步转化过程中提高或降低温度。
第一步将异黄酮结合物转化成异黄酮甙所需要的时间主要根据所使用的pH和温度范围而定。一般来说所用的时间为约15分钟至高达几个小时范围或更长时间。较高pH和较高温度下转化进行得较快。pH约9时，转化在73℃下约4-约6小时基本上能够完成。在特别优选的实施方案中，第一步转化采用了方法参数的特定组合。这些参数是pH约11，温度约5℃-约50℃，转化时间约15-约45分钟。
第一步异黄酮转化步骤的效率十分明显，它至少将大部分异黄酮结合物转化成了异黄酮葡萄糖甙，优选基本上全部转化。在第一步过程中异黄酮结合物被转化成异黄酮葡萄糖甙的量一般至少约80％至高达100％。如果使用前述优选的反应参数，则可以达到95％或更高的转化率。这么高的转化率对大规模工业化操作有特别的吸引力。
发明人发现第一转化步骤最优选在含水系统中进行。系统中可以存在其它和水相溶的成分，如某些醇，例如甲醇。一般说来，第一转化步骤不要求频繁混合也不要求限制特别的环境。如果系统中存在除水以外的成分，则必需除去那些成分或者将附加量的水引入系统充分稀释那些成分。这样作的原因是某些成分可能会对第二转化步骤产生不利影响，以下将具体描述这一步骤。
第二转化步骤是将混合物中的所有异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元，所说的所有异黄酮葡萄糖甙包括在第一转化步骤进行之前就原始存在于植物蛋白原料中的异黄酮葡萄糖甙以及第一转化步骤中产生的异黄酮葡萄糖甙。该转化作用是通过将混合物中的异黄酮葡萄糖甙和能够裂解异黄酮糖苷键的酶在足以达到转化的温度和pH下接触一定的时间。
该转化的进行主要取决于混合物中酶存在的浓度和它们的特性。这些酶可以是天然存在于植物蛋白原料中的、可以是由所说原料中生长的微生物产生的、或者也可以是添加到植物蛋白原料中的。天然存在于植物或大豆原料的或者产生于微生物生长的酶在本发明中称作“留存酶”。添加的酶称作“补充酶”。一般说来，如果植物蛋白原料中的留存酶不足以将大部分，优选基本上全部葡萄糖形式的异黄酮转化成为甙元形式，则应当添加补充酶。
进行第二步转化所需酶的量要根据各种因素来定，包括酶存在的类型、酶浓度的分布、系统pH、酶存在的活性和系统的温度。即使需要的话，所添加的酶优选量一般应使酶的总浓度以干基计占植物蛋白原料的约0.1wt％-约10wt％。如果系统中存在足够的酶浓度，无论是留存酶、补充酶，还是两者都有，则异黄酮葡萄糖甙会和酶在一定温度和pH下接触一定的时间，充分将混合物中的多数异黄酮葡萄糖甙，优选基本上全部异黄酮葡萄糖甙转化成甙元形式。
根据混合物的pH环境选择优选的补充酶，优选的补充酶包括差不多所有的糖酶，即能够裂解1，4-糖苷键的酶。这种酶可以来源于如黑曲霉、米曲霉、乳克鲁维氏酵母和脆壁克鲁维氏酵母。优选的补充酶是可商购的α-和β-半乳糖苷酶以及果胶酶。特别优选的可商购酶有：可从Questlnternational(1833 57th Street.Post Office Box3917，Sarasota，Florida 34243)购得的生物果胶酶100L(Biopectinase100L)(优选在约3-约6范围的pH下使用)、生物果胶酶300L(Biopectinase 300L)(最适pH范围约3-约6)、生物果胶酶(Biopectinase)0K 70L(最适pH范围约3-约6)、生物果胶酶30,000(最适pH范围约3-约6)、中性乳糖酶(最适pH范围约6-约8)。特别优选的是可从Amano International Enzyme Co.，Inc.(Post Office Box1000，Troy，Virginia 22974)购得的乳糖酶F(最适pH范围约4-约6)和乳糖酶50,000(最适pH范围约4-约6)。其它优选的酶包括：可从NovoNordisk Bioindustrials，Inc.(33 Turner Road，Danbury，Connecticut06813)购得的Lactozyme 3000L(优选在约6-约8范围的pH下使用)和Alpha-Gal 600L(优选在约4-约6.5范围的pH下使用)；可从Gist BrocadesFood Ingredients，Inc.(King of Prussia，Pennsylvania，19406)购得的Maxilact L2000(优选在约3-约6范围的pH下使用)；可从Pfizer FoodScience Group(205 East 42th Street，New York，New York 10017)购得的Neutral Lactase(优选在约6-约8范围的pH下使用)；以及可从Enzyme Development Corporation(2 Penn Plaza，Suite 2439，NewYork，New York 10121)购得的Enzeco Fungal Lactase Concentrate(优选在约4-约6范围的pH下使用)。
据发现，某些葡糖淀粉酶可以代替前述酶使用，或者附加使用。适宜葡糖淀粉酶的一个实例是可从Enzyme Development Corporation购得的G-Zyme G990(优选在约4-约6范围的pH下使用)。
在引发第二转化步骤之前，不必将第一转化步骤产生的系统转移至不同容器或反应罐中。此外，也不必进行那些繁复的、消耗时间和开销的分离或处理反应混合物或任何一部分混合物。相反，第一转化步骤的产物可以直接作为第二转化步骤的进料原料。需要调节或监测的参数仅为pH和温度。
第二转化步骤可以在pH约3-约9下完成。第二转化步骤优选的pH范围为约3-约8。具体使用的pH主要依据所使用酶的类型，并且应当由此加以选择。大多数情况下，把pH值由第一步的相对较高pH或碱性pH降低下来，这时可以通过各种方式如添加一种或几种适宜的酸来调节pH，所说的酸如乙酸、硫酸、磷酸、盐酸或任何其它适宜试剂。大多数情况下优选使用的是食用级酸性试剂或酸。
第二转化步骤可以在约5℃-约75℃温度下进行。第二转化步骤优选温度为约5℃-约60℃。最优选约35℃-约55℃的温度。优选在异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元的整个过程中使反应系统保持相对恒稳的温度。但是，某些情况下在第二转化步骤期间升高、降低或改变温度也是可以符合要求的。
第二转化步骤所需要的时间主要由各种酶相关因素、以及系统的温度和pH决定。大多数情况下，24小时之内便可完成基本转化。添加补充酶可以明显减少完成第二转化步骤所需时间，可以缩短至约1-约3小时。
第二转化步骤可以至少将混合物中的大部分异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元。经过第二步，异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元的程度一般至少约80％至高达100％，优选约90％-约100％。通过采用前述优选的反应参数，可以达到约95％或更高的转化程度。这么高的转化率是具有可靠依据的，明显的，且是工业应用所需要的。
完成第二转化步骤后，从系统中将相对不溶性的异黄酮甙元脱离出来，优选通过离心或过滤方法进行脱离。一经脱离出来后，即可通过合适溶剂提取的办法进一步将甙元从任何粒状或其它固体原料中分离出来。溶剂的实例包括(但不限于此)丙酮和/或醇如乙醇。另外，在进行第二步转化前、当中或之后向系统或混合物中加入一种或几种絮凝剂可以有助于沉淀异黄酮甙元。
下面的实施例将详细但非限制性地描述本发明的实施方案。实施例
本发明将通过以下使用大豆原料作为植物原料的实施例作较详细的说明。实施例旨在举例说明，不应当被认为有限定或限制本发明范围的意图。
植物蛋白原料如大豆分离蛋白、浓缩蛋白或蛋白粉包括异黄酮的染料木素、大豆黄素和黄豆黄素“家族”，它们具有相应的结合物、葡萄糖甙和甙元成员，其中染料木素族含有结合物6″-OMal染料木苷和6″-0Ac染料木苷、葡萄糖染料木苷以及染料木素甙元；大豆黄素族含有结合物6″-OMal大豆黄苷和6″-0Ac大豆黄苷、葡萄糖大豆黄苷以及大豆黄素甙元；黄豆黄素族含有结合物6″-0Mal黄豆黄苷、葡萄糖黄豆黄苷以及黄豆黄素甙元。以下的实施例中异黄酮的相对浓度是按异黄酮族的百分比进行测定的。例如，染料木素族：％6″-OMal染料木苷+％6″-OAc染料木苷+％染料木苷+％染料木素＝100％。通过比较一种异黄酮族中各类型化合物的百分比可以看出结合物转化成葡萄糖甙以及葡萄糖甙转化成甙元的程度。实施例1
制备含有植物蛋白原料的样品，形成初级大豆乳清含水混合物。在第一批实验中，将所有样品的pH调节至9.0，并且在72.5℃下保温3.5小时，进行第一转化步骤。样品冷却之后，将其pH调至7.0，在进行第二转化步骤之前，将样品分成三组。第一组，pH仍为7.0，第二组pH调至8.0，而第三组，pH调至9.0。然后将各组分成两份，分别在45℃或55℃下进行第二次保温。所有样品保温24小时，其间在0、2、4、6和24小时进行分析。
下表1给出了通过使用本实施例的方法，大豆原料中异黄酮结合物转化至异黄酮甙元的百分比。
                                                 表1
                    6″OMAL-6″OAC                           6″OMAL   6″OAC-                      6″-OMAL样品          染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                   百分比pH7.0@45℃t＝0            86         5         0         9         79        4         0         18       100        0         0t＝2hrs         85         6         0         9         78        4         0         18       100        0         0t＝4hrs         86         5         0         9         78        4         0         18       100        0         0t＝6hrs         87         5         0         9         79        3         0         18       100        0         0t＝24hrs        0          1         0         99        0         2         0         98       0          0         100pH8.0@45℃t＝0            86         5         0         9         79        4         0         18       100        0         0t＝2hrs         87         4         0         9         79        3         0         18       100        0         0t＝4hrs         88         4         0         9         79        3         0         18       100        0         0t＝6hrs         89         3         0         8         80        2         0         18       100        0         0t＝24hrs        0          3         0         97        0         3         0         97       0          0         100pH9.0@45℃t＝0            86         5         0         9         79        4         0         18       100        0         0t＝2hrs         89         2         0         9         81        1         0         18       100        0         0t＝4hrs         92         1         0         8         82        0         0         18       100        0         0t＝6hrs         93         0         0         7         82        0         0         18       100        0         0t＝24hrs        0          0         0         100       0         0         0         100      0          0         100pH7.0@55℃t＝0            86         5         0         9         79        4         0         18       100        0         0t＝2hrs         86         5         0         9         78        4         0         18       100        0         0t＝4hrs         87         5         0         8         79        3         0         18       100        0         0t＝6hrs         88         4         0         8         80        3         0         18       100        0         0t＝24hrs        0          1         0         99        0         2         0         98       0          0         100pH8.0@55℃t＝0            86         5         0         9         79        4         0         18       100        0         0t＝2hrs         87         4         0         9         79        3         0         18       100        0         0t＝4hrs         89         3         0         8         80        2         0         18       100        0         0t＝6hrs         91         2         0         7         81        1         0         17       100        0         0t＝24hrs        0          0         0         100       0         1         0         99       0          0         100
                                       表1续
                    6″OMAL-6″OAC-                         6″-OMAL-6″-OAC                                  6″-OOMAL样品          染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                   百分比pH＝9.0@55℃t＝0             86       5          0         9         79        4         0         18       100        0         0t＝2hrs          91       1          0         8         82        0         0         17       100        0         0t＝4hrs          93       0          0         7         83        0         0         17       100        0         0t＝6hrs          95       0          0         5         83        0         0         17       100        0         0t＝24hrs         0        0          0         100       0         0         0         100      0          0         100
在所有pH及45℃和55℃下，保温6-24小时间出现异黄酮结合物完全或基本上完全转化成甙元。从以上数据可观察到在转化成甙元形式之前出现一段滞后期，虽然尚不能期望得到任何具体理论的支持，但据信它是由生物合成所要发生的时间引起的，也就是留存酶或微生物酶形成的时间。造成滞后期的原因还在于反应中第二参与者的产生、另一酶底物的耗尽以及/或者酶和/或底物的束缚。实施例2
在第二批实验中，将所有样品的pH调节至11.0，并且加热至50℃进行其1小时的第一转化步骤。之后将样品冷却且其pH分别调节至4.0或4.5。第一组中添加有效量的Biopectinase 100L，而第二组中加入有效量的Lactase F。样品分别在50℃或60℃下保温1小时。
下表2给出了通过使用本实施例的方法，大豆原料中异黄酮结合物转化至异黄酮甙元的百分比。
                                                    表2
                   6″-OMal-6″-OAc                        6″-0Mal-6″-OAc-                       6″-
                                                                                                   OMal-样品         染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                  百分比第一步转化之前：        25.9      61.6        0        12.5      28.4      58.2      2.9       10.5      37.9      55.4      6.7之后：        89.5      0.0         0        10.5      89.7      0.0       0.0       10.3      100.0     0.0       0.0
                                                  百分比第二步转化pH4.5，50℃，1hr生物果胶酶100L百分数(固体计)5.3           9.9       0           0        90.1      7.9       0         0         92.1      74.8      0         25.24.4           20.4      0           0        79.6      18.6      0         0         81.4      75.2      0         24.82.2           43.1      0           0        56.9      42.2      0         0         57.8      77.8      0         22.21.1           62.4      0           0        37.6      62.0      0         0         38.0      100.0     0         0.00.5           75.4      0           0        24.6      75.1      0         0         24.9      100.0     0         0.0乳糖酶F百分数(固体计)11.1          0.0       0           0        100.0     0         0.0       0         100.0     0.0       0         100.08.9           0.0       0           0        100.0     0         0.0       0         100.0     0.0       0         100.04.4           0.0       0           0        100.0     0         2.4       0         97.6      0.0       0         100.02.2           0.0       0           0        100.0     0         2.1       0         97.9      0.0       0         100.01.1           0.0       0           0        100.0     0         2.1       0         97.9      0.0       0         100.00.6           4.2       0           0        95.8      0         2.2       0         97.8      15.9      0         84.1pH4.5，60℃，1hr生物聚胶酶100L百分数(固体计)5.3           5.5       0           0        94.5      5.0       0         0         95.0      71.0      0         29.04.4           12.9      0           0        87.1      12.5      0         0         87.5      100.0     0         0.02.2           70.9      0           0        29.1      34.6      0         0         65.4      75.5      0         24.51.1           55.0      0           0        45.0      55.9      0         0         44.1      78.5      0         21.50.6           70.9      0           0        29.1      72.2      0         0         27.8      100.0     0         0.0乳糖酶F百分数(固体计)11.1    0.0    0    0    100.0    0 0    0.0    0    100.0    0       0     100.08.9     0.0    0    0    100.0    0.0    2.3    0    97.7     0       0     100.04 4     0.0    0    0    100.0    0.0    2.2    0    97.8     0       0     100.02 2     0.0    0    0    100.0    0.0    2.1    0    97 9     0       0     100.01.1     0 0    0    0    100.0    0.0    2.1    0    97.9     0       0     100.00.6     5.2    0    0    94.8     4.0    2.2    0    93.8     29      0     71.0pH4.0，50℃，1hr生物果胶酶100L百分数(固体计)5.3     13.4   0    0    86.6     12.5   0      0    87.5     75.8    0     24.24.4     23.0   0    0    77.0     22.5   0      0    77.5     76.6    0     23.42.1     65.3   0    0    34.7     66.0   0      0    34.0     100.0   0     0.01.1     66.4   0    0    33.6     67.0   0      0    33.0     100.0   0     0.00.5     77.9   0    0    22.1     77.7   0      0    23.3     100.0   0     0.0乳糖酶F百分数(固体计)4.4     0      0    0    100.0    0      2.2    0    97.8     0.0     0     100.02.2     0      0    0    100.0    0      2.1    0    97.9     0.0     0     100.01.1     0      0    0    100.0    0      2.2    0    97.8     24.9    0     75.10.6     0      0    0    100.0    0      2 4    0    97.6     44.2    0     55.8pH4.0，60℃，1hr生物果胶酶100L百分数(固体计)5.3     10.1   0    0    89.9     10.4   0      0    89.6     72.8    0     27.24.4     21.4   0    0    78.6     22.6   0      0    77.4     74.2    0     25.82.2     45.1   0    0    54.9     46.7   0      0    53.3     77.9    0     22.11.1     65.6   0    0    34.4     67.2   0      0    32.8     100.0   0     0.00.5     73.5   0    0    26.5     75.1   0      0    25.5     100.0   0     0.0乳糖酶F百分数(固体计)4.4    0.0     0    0    100.0    0.0    2.2    0    97.8     30.9    0     69.22.2    2.1     0    0    97.9     0.0    2.1    0    97.9     54.0    0     46.01.1    14.6    0    0    85.4     19.4   0.0    0    80.6     67.1    0     32.90.6    41.3    0    0    58 7     47.9   0.0    0    52.1     74.3    0     25.7实施例3
在第三批实验中，将所有样品的pH调节至11.0，并且加热至20℃进行1小时的第一转化步骤。之后将样品冷却，并根据pH分成三组且分别调节至pH4.0、4.5和5.0。向各组样品中添加Biopectinase 100L至浓度为每100g初级豆乳清0.04g Biopectinase。所有样品在50℃保温1小时。
表3显示于下，列出通过使用本实施例的方法，大豆原料中异黄酮结合物转化至异黄酮甙元的百分比。
                                                  表3
                  6″-OMal-6″-OAc-                      6″-OMal-6″0Ac-                        6″-OMa1-样品        染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                               百分比第一步转化之前：       18.6       32.8       0        48.5      32.2      32.8       0        34.9      33.6      28.0      38.4
         52.3       2.5        0        45.2      63.5      1.8        0        34.7      60.1      0.0       39.9之后：
                                                           百分比第二步转化pH5.0t＝0hrs      51.0       2.5        0        46.5      62.2      1.8        0        36.0      59.1      0         40.8t＝0.5hrs    39.4       2.5        0        58.1      47.9      1.8        0        50.3      57.1      0         42.9t＝1.0hrs    30.6       2.4        0        66.9      37.6      1.8        0        60.6      55.6      0         44.4t＝1.5hrs    23.0       2.4        0        74.6      28.6      1.6        0        69.8      54.9      0         45.1t＝2.0hrs    18.2       2.2        0        79.6      22.5      1.6        0        75.9      53.4      0         46.6t＝3.0hrs    11.9       2.1        0        86.0      14.6      1.6        0        83.8      51.4      0         58.6PH4.5t＝0hrs      50.4       2.5        0        47.1      61.1      1.8        0        37.1      60.1      0         39.9t＝0.5hrs    35.0       2.4        0        62.6      43.6      1.6        0        54.8      56.5      0         43.5t＝1.0hrs    24.8       2.3        0        72.9      31.1      1.8        0        67.2      54.3      0         54.7t＝1.5hrs    16.3       2.1        0        81.6      20.2      1.4        0        78.4      53.3      0         46.7t＝2.0hrs    12.1       2.1        0        85.8      15.4      1.4        0        83.1      50.9      0         49.1t＝3.0hrs    6.7        1.8        0        91.5      8.5       1.3        0        90.2      0.0       0         100.0pH4.0t＝0hrs      50.0       2.5        0        47.5      60.1      1.9        0        38.1      59.5      0         40.5t＝0.5hrs    34.4       2.4        0        63.3      42.2      1.8        0        56.1      55.0      0         45.0t＝1.0hrs    24.3       2.3        0        73.4      30.0      1.6        0        68.4      55.0      0         45.0t＝1.5hrs    16.3       2.1        0        81.6      20.2      1.4        0        78.4      53.3      0         46.7t＝2.0hrs    12.1       2.1        0        85.8      15.4      1.6        0        83.1      51.9      0         48.1t＝3.0hrs    6.4        1.7        0        91.9      7.5       1.2        0        91.3      49.3      0         50.7实施例4
第四批实验，将所有样品的pH调节至8.0并且在72.5℃下保持24小时，以此进行第一转化步骤。在24小时期间取样。
表4显示于下，列出通过使用本实施例的方法，大豆原料中异黄酮结合物转化至异黄酮甙元的百分比。
                                                    表4
                6″-OMal-6″-OAc                        6″-OMal-6″-OAc                         6″-OMal-样品      染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷   大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                               百分比pH8.0t＝0hrs      27       52         0         21        28        52         2        18        41        43         16t＝2hrs      53       30         0         17        52        29         1        18        58        26         16t＝4hrs      66       19         0         15        64        17         1        18        70        15         15t＝6hrs      73       13         0         14        71        11         1        17        72        11         17t＝9hrs      81       7          0         12        77        6          0        17        78        6          16t＝24hrs     79       1          0         20        79        0          0        21        80        0          20实施例5
在第五批实验中，使用各种不同商购得到的β-半乳糖酶进行第二转化步骤。用水将由大豆原料得到的初级豆乳清制成固形物含量5％的浆液。调节pH为11，并且保持25℃45分钟，将异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙。然后将形成的样品在各酶浓度分别为2％和10％、温度50℃且pH值分别4.5和7.0下测定转化，在t＝0、1和4小时时测定转化程度。
下表5列出了通过使用本实施例的方法，大豆原料中异黄酮结合物转化至异黄酮甙元的百分比。
                                                        表5
                6″-OMal-6″-OAc                         6″-OMal-6″-OAc                       6″-OMal-样品      染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                              百分比2％Novo Lactozyme 3000LpH4.5t＝0hr      78        7         0          15       77         7          0        16        75        6         19t＝1hr      78        8         0          14       80         7          0        13        86        0         14t＝4hr      77        8         0          15       80         7          0        13        84        0         16pH7.0t＝0hr      78        7         0          15       77         7          0        16        75        6         19t＝1hr      72        8         0          20       77         7          0        16        72        0         28t＝4hr      68        8         0          24       74         7          0        19        61        0         3910％Novo Lactozyme 3000LpH4.5t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    78    8    0    14    80    7    0    13    84    0    16t＝4hr    78    8    0    14    80    7    0    13    82    0    18pH7.0t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    53    9    0    38    66    8    0    26    25    0    75t＝4hr    32    10   0    58    50    8    0    42    0     0    1002％Maxilact L2000pH4.5t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝4hr    76    7    0    17    76    7    0    17    73    6    21pH7.0     78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    71    7    0    22    73    6    0    21    56    7    37t＝4hr    65    7    0    28    69    5    0    26    52    0    4810％Maxilact L2000pH4.5t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    78    7    0    15    78    6    0    16    75    6    19t＝4hr    77    6    0    17    77    6    0    17    77    0    23pH7.0t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    49    7    0    44    59    5    0    36    17    7    76t＝4hr    25    8    0    67    39    6    0    55    0     0    1002％Pfizer Ncutral LactasepH4.5t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    77    7    0    16    77    6    0    17    73    7    20t＝4hr    77    7    0    16    77    6    0    17    76    0    24pH7.0t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    70    7    0    23    72    5    0    23    70    6    24t＝4hr    55    7    0    38    60    6    0    34    66    0    3410％Pfizer Neutral LactasepH4.5     78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    78    6    0    16    78    5    0    17    73    7    20t＝4hr    78    6    0    16    77    6    0    17    76    0    24pH7.0t＝0hr    78    7    0    15    77    7    0    16    75    6    19t＝1hr    35    8    0    57    46    6    0    48    51    0    49t＝4hr    2    8     0    90    4     6    0    90    0     0    1002％Ouest Biolactase 30.000pH4.5t＝1hr     78     7     0     15      77      7      0     16     75     6    19t＝1hr     0      6     0     94      0       6      0     94     0      0    100t＝4hr     0      4     0     96      0       5      0     95     0      0    100pH7.0t＝0hr     78     7     0     15      77      7      0     16     75     6    19t＝1hr     2      7     0     91      3       7      0     90     29     0    71t＝4hr     0      7     0     93      0       6      0     94     0      0    10010％Qucst Biolactase 30.000pH4.5t＝0hr     78     7     0     15      77      7      0     16     75     6    19t＝1hr     0      4     0     96      0       4      0     96     0      0    100t＝4hr     0      2     0     98      0       3      0     97     0      0    100pH7.0t＝0hr     78     7     0     15      77      7      0    16      75     6    19t＝1hr     0      7     0     93      0       7      0    93      0      0    100t＝4hr     0      7     0     93      0       6      0    94      0      0    1002％Quest Neutral LactasepH4.5t＝0hr    78      7     0     15      77      7      0    16      75     6    19t＝1hr    73      6     0     21      76      5      0    19      79     0    21t＝4hr    73      6     0     21      76      5      0    19      76     0    24pH7.0t＝0hr    78      7     0     15      77      7      0    16      75     6    19t＝1hr    2       7     0     91      7       4      0    89      15     0    85t＝4hr    0       7     0     93      0       4      0    96      0      0    10010％Quest Neutral LactasepH4.5t＝0hr    78      7     0     15      77      7      0    16      75     6    19t＝1hr    73      6     0     21      76      5      0    19      79     0    21t＝4hr    72      6     0     22      75      5      0    20      77     0    23pH7.0t＝0hr    78      7     0     15      77      7      0    16      75     6    19t＝1hr    0       7     0     93      0       4      0    96      0      0    100t＝4hr    0       7     0     93      0       4      0    96      0      0    100实施例6
第六批实验中，在前述第五批实验中第一步转化得到的原料基础上进行第二转化步骤。通过使用Biopectinase 100L和Lactase F在50℃和pH3.0下进行第二步转化，酶浓度为5％和10％。
下表6提供了使用这些酶得到的转化百分比。
                                        表6
                6″-OMal-6″OAc-                        6″-OMal-6″-OAc-                       6″-OMal-样品      染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                              百分比5％Biopectinase 100Lt＝0hr      78         7         0        15         77        7         0         16        75        6         19t＝1hr      30         5         0        65         30        5         0         65        67        0         33t＝4hr      27         4         0        69         27        4         0         69        61        0         39t＝7hr      11         3         0        86         10        3         0         87        52        0         4810％Biopectinase 100Lt＝0hr      78         7         0        15         77        7         0         16        75        6         19t＝1hr      27         4         0        79         27        4         0         69        61        0         39t＝4hr      9          2         0        89         9         1         0         90        41        0         59t＝7hr      8          1         0        91         8         1         0         91        34        0         515％Lactase Ft＝0hr      78         7         0        15         77        7         0         16        75        6         19t＝1hr      68         7         0        25         71        6         0         23        80        0         20t＝4hr      68         6         0        26         71        6         0         23        80        0         20t＝7hr      68         6         0        26         71        6         0         23        79        0         2110％Lactase Ft＝0hr      78         7         0        15         77        7         0         16        75        6         19t＝1hr      65         7         0        28         68        6         0         26        79        0         21t＝4hr      64         6         0        29         67        6         0         27        78        0         22t＝7hr      64         6         0        30         67        5         0         28        78        0         22实施例7
在另一批实验中，将含有10％喷雾干燥初级豆乳清的含水悬浮样品调节至pH11，并且加热至35℃，放置30分钟进行第一转化步骤。将所得的富含糖苷的样品调节至pH4.5，并且等分成150g样品。向样品中加入三种不同的商购酶A1pha-Gal 600L、G-Zyme 990和Biolactase 30,000。每份样品添加0.15g一种类型的酶。然后50℃下保温4小时。各保温样品在加入酶后0、1、2、3和4小时取样测定异黄酮甙转化成异黄酮甙元的程度。
下表7给出了实验各具体酶得到的转化百分比。
                                                            表7
                        6″-OMal-6″-0Ac-              6″-OMal-6″-OAc-                      6″-OMal-样品    染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                             百分比富葡萄糖苷起始原料初级乳清
       83       0          0         17        83        0         0          17        81       5         13Alpha-Gal 600Lt＝0hr    66    1    0    33     63    0    0     37     80    0     20t＝1hr    4     0    0    96     2     0    0     98     23    0     77t＝2hr    1     0    0    99     0     0    0     100    10    14    76t＝3hr    0     0    0    100    0     0    0     100    6     0     94t＝4hr    0     0    0    100    0     0    0     100    8     14    78G-Zvme 990t＝0hr    63    1    0    37     60    0    0     40     79    0     21t＝1hr    49    1    0    51     41    0    0     59     82    0     18t＝2hr    30    1    0    69     21    0    0     79     79    0     21t＝3hr    18    0    0    82     11    0    0     89     69    11    19t＝4hr    11    1    0    88     5     0    0     95     67    12    21Biolactase 30,000t＝0hr    56    1    0    43     57    0    0     43     70    0     30t＝1hr    1     0    0    99     0     0    0     100    11    0     89t＝2hr    0     1    0    99     0     0    0     100    9     0     91t＝3hr    0     0    0    100    0     0    0     100    8     14    78t＝4hr    0     0    0    100    0     0    0     100    8     15    78实施例8
第八批实验中，结合使用各种方法参数，将初级豆乳清起始原料中的异黄酮结合物转化成异黄酮甙。第一步转化分别按以下条件进行：温度121℃，pH值6、7.1和7.5；温度80℃，pH值6、7.1和7.5；温度20℃，pH值11.5、12、13和13.7。另外还在相对较低的温度如6℃下进行一次第一步转化。下表8提供了提供结合上述pH和温度所达到的转化百分比。使用更长的时间可以使异黄酮结合物转化成其相应异黄酮甙形式达到90％或更高。
                                    表8
              6″-OMal-6″-OAc-                       6″-OMal-6″-OAc-                       6″-OMal-样品    染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                            百分比起始原料初级豆乳清
      17        62         0         21        10         68       2          20        29         46      25121℃(用氢氧化纳调节pH)pH6.0     81        0          0         19        71         3        8          18        54         10      36pH7.1     75        9          0         16        70         8        6          17        61         6       34pH7.5     78        7          0         15        72         7        6          16        64         4       31121℃(用氢氧化钙调节pH)pH6.0    72    13    0    15    64    12    7    16    56    9    35pH7.1    77    8     0    15    71    7     6    17    62    5    33pH7.5    84    4     0    12    77    3     4    15    72    0    28样品80℃下放置5hrs(用氢氧化钠调节pH)pH6.0    59    27    0    14    55    26    3    16    62    18   20pH7.1    70    19    0    12    65    18    2    16    68    14   18pH7.5    73    16    0    11    67    15    2    16    70    12   18样品80℃下放置5hrs(用氩氧化钙调节pH)pH6.0    61    26    0    13    56    26    3    15    61    18   21pH7.1    72    17    0    12    65    16    2    16    67    13   20pH7.5    80    10    0    10    73    9     2    16    74    8    18样品6℃下放置17.5hrspH9.5    73    14    0    13    72    13    0    15    91    0    9样品20℃下放置15minpH11.5   82    2     0    15    82    2     0    16    93    0    7pH12.0   85    0     0    15    84    0     0    16    93    0    7pH13.0   91    0     0    9     84    0     0    16    93    0    7pH13.7   84    0     0    16    89    0     0    11    100   0    0实施例9
另一批实验中，在pH11和12.3下于2℃和6℃进行将初级豆乳清混合物中异黄酮结合物转化产异黄酮甙的第一步转化。该实验结果示于下表9。
                                                            表9
              6″-OMal-6″-OAc-                        6″-OMal-6″-OAc-                      6″-OMal-样品    染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素                                          百分比结合物转化成糖苷2℃下(冰浴)t＝0             17     62     0     21    10     68     3      20    29     46    25pH11.0，t＝1hr   40     39     0     21    40     38     4      17    15     73    12pH12.3，t＝1hr   81     0      0     19    83     0      0      17    100    0     06℃下(冰箱)t＝0             17     62     0     21    10     68     3      20    29     46    25pH11.0，t＝1hr   80     0      0     20    83     0      0      17    100    0     0pH12.3，t＝1hr   81     0      0     19    77     0      0      23    100    0     0实施例10
第十批实验中，分别使用Amano Lactase 50,000和Quest NeutralLactase酶在8℃和pH4.5和7下进行将异黄酮甙转化成异黄酮甙元的第二步转化。将初级豆乳清在pH11和35℃温度下进行45分钟的第一步转化，形成富含糖苷的豆乳清混合物。形成富含糖苷的混合物后，进行第二步转化。
下表10提供了通过结合所说pH和温度，达到的转化百分比。
                                                             表10
              6″-OMal-6″-OAc-                        6″-OMal-6″-OAc                       6″-OMal-样品    染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                             百分比用Quest Neutral Lactase将糖苷转化成甙元pH7.0，8℃，t＝23hrst＝0       71       9          0         20       74          8        0         19        100        0        0t＝23hrs5％酶量    12       10         0         78       26          9        0         65        49         0        5110％酶量   0        11         0         89       0           10       0         90        0          0        100用Amano Lactasc 50,000将糖苷转化成甙元pH4.5，8℃，t＝23hrst＝0        71    9    0    20    74    8    0    19     100   0    0t＝23hrs5％酶量     0    10    0    90    0     9    0    91     0     0    100t＝23hrs10％酶量    0    10    0    90    0     9    0    91     0     0    100实施例11
第十一批实验中，在35℃和pH值4.0和4.5下进行将异黄酮甙转化成甙元的第二转化步骤。将第一批次含有异黄酮结合物的初级豆乳清样品在pH11和35℃温度下进行第一步转化，然后使用5％Biopectinase 100L在pH4.0和35℃下将所得的富含糖苷的混合物进行第二步转化。按上述过程将第二批次的初级豆乳清样品转化成富含糖苷的样品，之后用2％Loactase F在pH4和35℃下转化。
表示所得转化百分比的表11示于下。
                                                       表11
                 6″-OMal-6″-OAc-                       6″-OMal-6″-OAc-                       6″-OMal-样品       染料木苷  染料木苷  染料木苷  染料木素  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄苷  大豆黄素  黄豆黄苷  黄豆黄苷  黄豆黄素
                                                                百分比起始原料初级豆乳清
         17         62        0         21        10        68        2         20        29        46        25批次A(5％Biopectinase 1001.)步骤1：结合物转化成糖苷，pH11，35℃t＝45min     82         0         0         18        76        0         0         24        100       0         0t＝60min     84         0         0         16        77        0         0         23        100       0         0步骤2：糖苷转化甙元，pH4.0，35℃t＝1hr       5          0         0         95        12        0         0         88        44        0         56t＝1.5hr     0          0         0         100       0         12        0         88        37        0         63t＝2.0hr     0          0         0         100       0         12        0         81        32        0         68批次B(2％Lactase F)步骤1：结合物转化成糖苷，pH11，35℃t＝45min    83     0     0     17      77     0     0     23      100     0     0t＝60min    82     0     0     18      77     0     0     23      100     0     0步骤2：糖苷转化成甙元，pH4.0，35℃t＝1hr      4      0     0     96      0      0     0     100     45      0     55t＝1.5hr    0      0     0     100     0      0     0     100     39      0     61t＝2.0hr    0      0     0     100     0      0     0     100     34      0     66
所有用来表示6″-OMal染料木苷、6″-OAc染料木苷、6″-OMal大豆黄苷、6″-OAc大豆黄苷、黄豆黄苷、6″-OMal黄豆黄苷和黄豆黄素的百分比皆是计算值。用来表示酶浓度的百分数皆按照各样品中每100g固体的商购酶制剂克数来计算。
下面将描述大豆制品中异黄酮的定量方法。将0.75g样品(喷雾干燥或磨细的粉末)与50ml的80/20甲醇/水溶剂混合，以此从大豆制品中提取异黄酮。将混合物通过轨道式摇动器在室温下摇动2小时。2小时后，通过Watman No.42滤纸将剩余不溶的原料过滤除去。用4ml水和1ml甲醇将5ml的滤液稀释。
通过HPLC(高效液相色谱)用Hewlett Packard C18 Hypersil反相柱分离上述提取的异黄酮。将异黄酮注到柱上并且开始用梯度为88％甲醇、10％水和2％冰醋酸的溶剂洗脱，最后用98％甲醇和2％冰醋酸洗脱。在0.4ml/min流速下，所有异黄酮-染料木苷、6-0-乙酰染料木苷、6-0-丙二酰染料木苷、染料木素、大豆黄苷、6-0-乙酰大豆黄苷、6-0-丙二酰大豆黄苷、黄豆黄苷及其衍生物和黄豆黄素-皆清晰地被解析下来。通过UV吸收在260nm下检测峰。通过HPLLC质谱仪进行峰的鉴定。
使用从Indofine Chemical Company，Sommerville，N.J.购买的纯标准品(染料木苷、染料木素、大豆黄苷和大豆黄素)定量异黄酮。计算以上化合物的各个响应因数(积分面积/浓度)，并且用于测定未知样品的数量。对结合物形式而言，由于不能得到纯的标准品，则假设母分子的响应因数是其响应因数，但要校正分子量的差异。假定经过分子量差异校正过的染料木苷的响应因数就是黄豆黄苷的响应因数。
该方法可以得到各个单独异黄酮的数量。为方便起见，如果所有的结合物形式都被转化成它们分别的非共轭形式，则可以计算总的染料木素、总的大豆黄素和总的黄豆黄素，并用这些化合物的集合重量来表示。这些总量还可以通过使用酸分解法将其转化回共轭形式来直接测定。
前面描述的仅是本发明优选的实施方案。根据对包括等同物原则在内的专利法规定的理解，可以在不背离本发明实质和所提权利要求的较宽范围的前提下，作出各种变化和改进。

Claims (18)

1.一种将异黄酮结合物转化成异黄酮甙元的方法，包括：
制成含有异黄酮结合物和水的混合物；
在pH约6-约13.5和温度约2℃-约121℃下处理该混合物，处理时间为足以将大部分所说的异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙；并且
使能够裂解异黄酮糖苷键的酶和所说混合物中的异黄酮葡萄糖甙在pH约3-约9和温度约5℃-约75℃下接触，接触时间为足以将所说的异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的含有异黄酮结合物和水的混合物是包含异黄酮结合物的植物蛋白原料的含水浆液。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的与所说酶接触的异黄酮葡萄糖甙是由所说异黄酮结合物转化的异黄酮葡萄糖甙，以及转化所说异黄酮结合物成异黄酮葡萄糖甙之前存在于所说混合物中的异黄酮葡萄糖甙。
4.根据权利要求2的方法，包括：
制成包含异黄酮结合物的植物蛋白原料的含水浆液；
在pH约6-约13.5和温度约2℃-约121℃下处理该浆液，处理时间为足以将大部分所说的异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙；
从所说的植物蛋白原料中分离出所说的异黄酮葡萄糖甙；
制成所说异黄酮葡萄糖甙和水的混合物；并且
使能够裂解异黄酮糖苷键的酶和所说混合物中的异黄酮葡萄糖甙在pH约3-约9和温度约5℃-约75℃下接触，接触时间为足以将所说的异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元。
5.根据权利要求4的方法，其中所说的从所说植物蛋白原料中分离出的异黄酮葡萄糖甙包括所说异黄酮结合物转化形成的异黄酮葡萄糖甙，以及转化所说异黄酮结合物成异黄酮葡萄糖甙之前存在于所说混合物中的异黄酮葡萄糖甙。
6.一种从植物蛋白原料中脱除异黄酮结合物和异黄酮葡萄糖甙并且将所说的异黄酮结合物和并黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元的方法，包括：
从包含并黄酮结合物和异黄酮葡萄糖甙的植物蛋白原料中浸出异黄酮结合物和异黄酮葡萄糖甙；
制成所说异黄酮结合物、异黄酮葡萄糖甙和水的混合物；
在pH约6-约13.5和温度约2℃-约121℃下处理该混合物，处理时间为足以将大部分所说的异黄酮结合物转化成异黄酮葡萄糖甙；并且
使能够裂解异黄酮糖苷键的酶和所说混合物中的异黄酮葡萄糖甙在pH约3-约9和温度约5℃-约75℃下接触，接触时间为足以将所说的异黄酮葡萄糖甙转化成异黄酮甙元。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的浸出是在pH约4-约11进行的。
8.根据权利要求7的方法，其中所说的浸出是在pH约7进行的。
9.根据权利要求1、2、4或6的方法，其中在pH约9和温度约45℃-约75℃下处理所说的异黄酮结合物和水的混合物或所说的含水浆液。
10.根据权利要求1、2、4或6的方法，其中在pH约11和温度约5℃-约50℃下处理所说的异黄酮结合物和水的混合物或所说的含水浆液。
11.根据权利要求2、4或6的方法，其中使酶和所说混合物或浆液中的异黄酮葡萄糖甙的接触包括将一定量的补充酶添加到所说混合物或浆液中，有效裂解所说异黄酮葡萄糖甙的异黄酮糖苷键。
12.根据权利要求11的方法，其中所说的补充酶是能够裂解1，4-糖苷键的糖酶。
13.根据权利要求12的方法，其中所说的补充酶选自α-半乳糖酶、β-半乳糖酶、葡糖淀粉酶、果胶酶及其组合物。
14.根据权利要求11的方法，其中以干基质计补充酶按所说植物蛋白原料重量的约0.1wt％-10wt％浓度添加到所说的混合物或浆液中。
15.根据权利要求2或6的方法，还包括从所说混合物或所说浆液中分离出所说的异黄酮甙元。
16.根据权利要求2方法生产得到的异黄酮产品。
17.根据权利要求4方法生产得到的异黄酮产品。
18.根据权利要求6方法生产得到的异黄酮产品。
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