TW493002B - Two-step conversion of vegetable protein isoflavone conjugates to aglucones - Google Patents

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Babara A Bryan
Maryann C Allred
Mark A Roussey
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Description

493002 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明爲共同未准申請案系列第08/477,102號（申請日 爲1995年6月7曰）之部分繼續申請。 發明範疇 本發明關於用以將存在植物性蛋白質物料中之異黃酮 矣軛物，轉化成異黃酮葡萄配糖基之二階段方法。此外， 本發明關於含有異黃酮葡萄配糖基之所成產物_。 發明背景 異黃酮發生於各種豆科植物，其包括諸如衍生自大豆之 植物蛋白物料中。此等化合物包括大豆黃：y：、6m_〇Ac大豆 黃答、6”-〇Mal大豆黃甞、大豆黃素、金雀異黃甞、6"_〇Ac 金雀異黃苷、6"-〇Mal金雀異黃苷、金雀異黃素、黃豆黃 甞、6"-OAc黃豆黃甞、6，，_QMal^豆黃甞、黃豆黃素、難 豆黃素、芒柄花黃素、與擬雌内醋σ代表性地此等化合物 與大豆之固有苦咮有關。於製造商業產品，如分離物與濃 縮物方面’焦點已放在如何除去此等物質上。例如，於一 種習知製造大豆蛋白質分離物之方法（其中係將大豆薄片 以水性鹼性介質萃取）中，係將許多異黃酮溶解於該萃取 物，並且使其保持溶解於該萃取物中，其通常隨著蛋白質 之酸沈澱被丟棄，而形成一種分離物。殘餘在經酸沈澱之 蛋白質分離物中的異黃酮，通常係藉由將該分離物徹底清 洗而被除去。 最近已認知，包含於植物性蛋白質如大豆中之異黃酮， 可抑制人類癌細胞，例如乳癌細胞與前列腺癌細胞生長， 如以下文獻中所述：由彼得森（Peters〇n)與巴尼斯（BMaes) (請先.M讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝· 訂 -4 - 493002 A7 ______B7_ 五、發明説明（2 ) 所著”金雀異黃素對人類乳癌細胞之抑制作用，與雌激素 梵體及多重藥物抗性基因無關’生物化學與生物物理研 % 報導 (Biochemical and Biophysical Research Comiimnications^，卷 179，第 1號，第 661-667 頁，1991年 8 月30曰；由彼得森（peterson)與巴尼斯（Barnes)所著”金雀 異黃素與難豆黃素抑制人類前列腺癌細胞之生長，担不抑 制表皮生長因子受體之酪胺酸自體磷酸化作用”，前列腺 LThe Prostate^，卷 22，第 335_345 頁（1993);以及由巴尼斯 (Barnes)等人所著”大豆抑制乳癌模式中之乳房腫瘤，飲 食中之謗變劑與致癌密丨jfMutagens and Carcinogens in the (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Diet)，第 239-253 頁（1990)。 於上述異黃酮中，有些係與其所接附之葡萄糖分子呈葡 萄糖甞，或呈葡萄糖原形式存在。有些葡萄糖原如6”-OAc 金雀異黃苷或6”-OMal金雀異黃甞，分別含有一個乙醯基 或丙二醯基，其接附至該葡萄糖务子本身之六位置上。此 類型，即具有接附至該葡萄糖部分之額外部分的化合物， 通常引述稱爲”共、軛物”。雖然所有異黃酮（包括葡萄糖 苷類）於醫藥評價上受到注意，然而最感興趣之特定異黃 嗣爲葡萄取糖基類，其不含所接附之葡萄糖部分。此類中 之特定異黃鲷爲大豆黃素、金雀異黃素及黃豆黃素。此等 葡萄配糖基類具有下列之通式·· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公瘦） 3 、發明説明
經濟部中央標準局負工消費合作社印製 pθ Η、〇H及Θ(：Η3。因此，本 白質物料料葡萄配糖基類，及富含此等物質之植物性蛋
=藝中用於將葡萄糖#異黃萌轉化成爲葡萄配糖 =銅之方法爲已知’例如經敘述於由小播(〇bata)等人 公開日本專财請案258,669中。此等方法僅達 程度义轉J：，故尤其對大規模商業操作而言並不適 用。此外，諸如敘述於該258,669中請案中 < 已知方法， :敎示從蛋白質物料中取出異黃嗣，而未敘述如何製備得 田含葡萄配糖基異黃嗣之植物性蛋白質物料T 用於藉由將異黃酮葡萄糖原轉化成爲異黃酮葡萄配糖 基，而製造富含特定葡萄配糖基異黃酮之植物性蛋白質衍 生物’例如蛋白質萃取物、蛋白質乳漿與蛋白質濃缩產物 之方法亦爲已知，例如經敘述於最近之已公開未准專利申 請案 PCT/US94/10697 、 PCT/US94/10699 、與 PCT/US94/l〇696中，其皆屬本申請案之申請人所有，於是 有需要一種將至少大部分，而較佳地係實質上所有之異黃 -6- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規袼（210X297公釐）
τ共軛物，轉化成爲葡萄配糖基異黃酮，且用於製造富含 葡萄配糖基異黃酮之植物桂蛋白質物料的方法。田σ 愛丧要 、本發明 < 一目的在於，提供一種富含葡萄配糖基異黃酮 <物質，以及用於從含有異黃酮共軛物之植物性蛋白質物. 料’而製得該相同物質之方法。 本發明提供用以將異黃鲷共耗物轉彳匕成異黃酮葡萄配 糖基之方法。其係形成包含異黃酮共軛物與水之混合物， ♦ '* · —---- 么1 及爲約2°C至12TC之溫度 下處理’以將大部分之異黃酮共耗物轉化成爲異黃酮葡萄 糖原。將異黃酮葡萄耱原（自異黃酮共軛物轉化成，或原 先即存在該混合物中）於約3至約9之pH値及爲约至75 溫度下，與一種能夠將異黃酮葡萄糖甞鍵裂解之酵素 接觸，以將存在該混合物中之異黃酮葡萄糖原轉化成異黃 嗣葡萄配糖基。本發明包括各種其中該等存在植物性蛋白 質物料中之，各別異黃蚵共軛物、異黃酮葡萄糖原、或異 黃酮葡萄配糖基，係於該二階段轉化方法之前、期間、或 之後，從該植物性蛋白質物料中取出之方法。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 i隹具體實施例之敘述 本新穎方法爲用於將至少大部分之異黃酮共軛物，轉化 成異黃酮葡萄配糖基之二階段方法。較佳地，該等異黃酮 共軛物係存在植物性蛋白質或植物物料中。此方法業經發 現，可確保將異黃酮共軛物與異黃酹葡萄糖原，實質上完 全轉化成異黃酮葡萄配糖基。第一階段涉及將異黃酮共軛 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 493002 A7
請- 先 閱 讀 背 面 之 注 意
I Η 寫 本 頁 裝 訂 493002 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ^^~-----B7 五、發明説明'一·' 上亦可使用水性萃取方法。 於第二種具體實施例中，係將異黃酮共軛物於存於該植 物性蛋白質物料中時，轉化成爲異黃酮葡萄糖原。然後將 孩異黃酮葡萄糖原藉由水隹瀝濾或萃取方法，而從該植物 $蛋白質物料中取出。水性瀝濾方法可藉由將植物物料、浸 潰、暴露或浸洗於水，或其他可與水相混之溶劑如乙醇或 其他醇類的混合物中，以瀝濾出相對上可溶之異黃_葡萄 糖原。所埤水性系統之ρΗ値爲约4至约u，且較佳地爲約 7。待取出程序之後，再將異黃酮葡萄糖原轉化成爲異黃 酮葡萄配糖基形式。 於第三種具體實施例中，係於進行任何轉化作用之前， 先將異黃酮共軛物從該植物性蛋白質物料中取出。由於異 黃嗣之共轭物形式相對上可溶於水中，故可藉由如前所述 之水性瀝濾或萃取方法，而將異黃酮共軛物從該植物性蛋 白質物料中取出。經此類取出释序之後，將異黃酮共軛物 轉化成爲葡萄糖原形式，然後再轉化成爲葡萄配糖基形 式。 視含有異if酮共輕物之植物性植物物料的類型而定，於 某些案例中，可能需要將該植物物料處理成細分之形式。 此可希望地悚包含於植物性物料中的異黃酮化合物，能容 易接觸到各種用於第一及/或第二階段中之試劑，其經進 一步詳述於下。該物料可經研磨、壓碎或藉由其他該項技 藝所已知之習用方法處理。若植物物料係以使得植物性物 料中的異黃銅化合物，能容易接觸到外部試劍或反應物之 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背¾之注意事『項再填寫本頁) «裝. 493002
經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 狀態，例如某些植铷之小的葉片部分存在時，則毋需對咳 植物物料進行此類處理， ^ 於第-轉化階段或操作中，係將存在該植物性蛋白質物 料中之異黃_共耗物，藉由化學反應轉化成異黃網葡萄糖 茹。此反應業經發現，其於特定？11値與溫度範圍之组合下 特別快速且有效率。較佳地，將該植物性蛋白質物料導入 一反應容器，或其他含有足量水之適宜容器中。水之含量 並未厫格限定，只要使該植物性蛋白質物料形成相對上均 勻之混合物或分散液。對於第一轉化階段而言，較佳ipH 値^圍爲約6至約13.5。業經發現，使異黃酮共軛物成爲 異黃酮葡萄糖原之轉化作用係受鹼催化，故最佳地使用高 pH値以達到快速轉化作用。對於第一轉化階段而言，最佳 之pH値範獨爲約η。pH値可藉由添加任何使該系統之？11 値增加之適宜鹼類、苛性試劑或鹼性試劑，例如氫氧化鈉 而調整。 對於第一轉化階段而言，較佳之溫度爲約至12 ιΌ。 最佳溫度係視pH値而定。本發明業已發現，當ρΗ値相對 上爲高時，該轉化作用可於較低之溫度下快速地發生。於 爲約9之pH値下，該轉化作用於爲約45°C至75χ之溫度範 園内有效率地發生，而最佳之溫度爲約73 。於爲約i j 之pH値下，較佳之溫度爲约5χ：至50。(：，而以3_5°C爲特別 較佳。當pH値相對上爲低時，該轉化作用可於較高之溫度 下發生。例如，於爲約6之pH値下，該轉化作用於爲約80 °(：至121°(：之溫度範圍内發生。 請· 閱 讀 背 之 注 意 事 項
旁. 裝 訂 10- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 493002 Α7 Β7 五、發明説明（8 ) 較佳地，於經歷整個從異黃蚵共軛物成爲異黃酮葡萄搪 原之轉化作用期間，將該混合物保持在相對上恆定之溫度 下。然而，於某些案例中，可能希望於經過第一階段轉化 過程時，蔣溫度增加或減低。 於第一階段中用以使異黃酮共軛物成爲異黃酮葡萄糖 甞之轉化作用所需時間，主要係視所使用之pH値與溫度範 圍而定。此等時間範爵代表性地爲約15分鐘至數小時或更 冬。轉化作用可於較高pH値與較高溫度下，更快速地發 生。於爲約9之pH値下，轉化作用係於約73χ：下，於約4 至約6小時内實質上達完全。於一特別較佳具體實施例 中’係使用特別之處理參數組合，以進行第一階段轉化作 用。此等參數爲約11之pH値，爲約5。匕至5〇π之溫度，以 及爲约15至約45分鐘之轉化時間。 該第一步異黃酮轉化作用係顯著地有效率，其將至少大 部分，而較佳地係實質上所有之異黃酮共軛物轉化成爲異 黃酮葡萄糖原。於第一階段期間，將異黃酮共軛物轉化成 局異質_葡萄糖原之作用程度，代表性地爲約至少川％至 100%。藉由使用前述之較佳反應參數，其可能達到95%或 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 更1%之轉化作用。此等高的轉化率對於大規模商業操作而 言，尤其受到注意。 本案申請人已發現，該第一轉化階段係於水性系統中完 成。其他水可相容之组成份可存在於該系統中，例如特定 醇類如甲醇。通常，該第一轉化階段並不需要時常混合， 亦毋需特別的環境限制。若於該系統中存在其他除水之外 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210χ297公釐） ' - ^3002 A7 _____ B7 五、發明説明（9 ) 盼組成份，則可能需要將該等组成份除去，或藉由多額外 量之水導入韓系統中而使其矣分稀釋。對於此處理之理由 爲，某些組成份可能對以下所詳述之第二轉化階段，具有 不利的影響。 第二轉化階段涉及將所有存在該混合物中之，異黃酮葡 萄糖原（包括原先於第一轉化階段之前即存在該植物性蛋 白質物料中之黃_葡萄糖原，以及於第一轉化階段中製得 之異黃酮葡萄糖原）轉化成異黃酮葡萄配糖基。該轉化作 用係藉由將存在該混合物中之黃酮葡萄糖原，於一溫度與 pH値下’與一種能夠將異黃酮葡萄糖苷鍵裂解之酵素接觸 一段，足以完成該轉化作用之時間而完成。 經濟，邺中夬榡準局員工消費合作社印製 此轉化作用主要係視，該酵素存在該混合物中之濃度， 以及其特性而定。此等酵素可天然地存在該植物性蛋白質 物料中，可由生長於該物料中之微生物表現，或可經添加 於Μ植物性蛋白質物料中。天然地存在該植物性或大豆物 料中，或由微生物之生長表現的酵素，於本文中經引述稱 爲殘餘酵素”。經添加之酵素，於本文中經引述稱爲”追 加酵素。通常，若植物性蛋白質物料中之殘餘酵素濃度， 不足以將大部分，而較佳地係實質上所有呈葡萄糖原形式 異黃嗣轉化成爲葡萄配糖基形式時，則應添加入追加 酵素。 用以完成第二階段中之轉化作用所需的酵素總量，係視 各種包括所存在酵素之類型、酵素濃度之分佈、系統之？11 値所存在酵素之活性、以及系統之溫度等因素而定。所 -12- 493002 A7
3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 添加蜂素（若有〉之較佳總量， 之總濃度，爲該植物性蛋白質物c酵素 1 〇〇/ “、； +旦、LΘ <乾4重的約〇· L%至約 1Θ /〇 (以重量計）之總量。一旦該酵杳 ^ ^ 鮮素猎由殘餘酵素、追加 二者’而以足夠濃度存在於該系統中時，即將黃嗣 痛苟糖原於-溫度與pH値下.，與該酵素接觸—段 部分，而較佳地係實質上所有，存在# ^、疋乂將大 ^ 伃在，昆合物中之異黃酮葡 萄糖原，轉化成爲異黃酮葡萄配糖基形式之時間。、 較佳之追加酵素係，以混合物環境之_爲基準進行筛 選，且其包含幾乎所有糖酶酵素，亦即，能夠裂解以-葡 萄耱菩鍵之酵素。此類酵素可衍生自，例如，黑曲霉、米 曲霉、乳酸克魯維酵母、及脆壁克魯維酵母。較佳之追加 酵素爲市售可得之阿爾伐-與貝他_半乳糖甞酶酵素，及果 膠酶酵素。尤其較佳之市售可得酵素爲··生物果膠酶 (Biopectinase) 100L (其較佳地係於爲約値範 圍下使用）、生物果膠酶300L(其最適之pH値範圍爲約3 至約6 )、生物果膠酶〇κ 70L (其最適之pH値範圍爲約3 至约6)、生物果膠酶3〇,〇〇〇(其最適之pH値範圍爲約 至約6)、中性乳糖酶（Neutral Lactase)(其最適之pH値範 圍爲釣6至約8 )，彼等皆可購自奎斯特國際股份有限公司 (QAtest International)，第 57街 1833號，郵政信箱 3917號， 沙拉索塔（Sarasota)，佛羅里達34243。亦特別較佳者爲乳 糖酶f (其較佳地係於爲約4至約6之pH値範園下使用）與 乳糖酶50,00、0(其最適之pH値範圍爲約4至约6)，彼等皆 可購自艾曼諾國際酵素股份有限公司（Amano -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 493002 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7五、發明説明（11 ) International Enzyme Co·，Inc.)，郵政信箱 1000號，特洛 (Troy)，維吉尼亞22974。其他特別較佳之酵素包括， Lactozyme 3 00L(其較佳地係於爲約6至約8之pH値範圍下 使用）與Alpha-Gal 600L (其較佳地係於爲約4至約6.5之 pH値範圍下使用），可購自新諾迪斯克生物工業股份有限 公司（NovoNordiskBioindustrials，Inc·)，土納路33號，丹 伯利（0丑111)117)，康乃狄格06813;%狂\11狂(：1^000(其較佳 地係於爲約4至約6之pH値範園下使用），可購自吉斯特布 卡得斯食品成份朦份有限公司（Gist Brocades Food Ingredients，Inc·)，普魯士王市，賓州19406 ;中性乳糖酶 (Neutral Lactase)(其較佳地係於爲約6至約8之pH値範圍 下使用），可購自費則食品科學集團（Pfizer Food Science Group)，東第42街205號，紐約市，紐約州10017;以及Enzeco 眞菌性乳糖酶濃縮物（其較佳地係於爲約4至約6之pH値範 菌下使用），可購自酵素發展股份有限公司（Enzyme Development Corporation)，朋普梪扎（Penn Plaza)第 2號， 蘇伊特（Suite) 2439，紐約市，紐約州10121。 業經發現，某些特定葡萄糖-澱粉酶可用於替代前述酵 素，或除了前述酵素外又另行添加。適宜葡萄糖-澱粉酶 之實例爲G-ZymeG990(其較佳地係於爲約4至約6之pH値 範圍下使用），可購自酵素發展股份有限公司（Enzyme Development Corporation) 〇 於開始進行第二轉化階段之前，毋需將自第一轉化階段 所製得之系統，轉移至不同容器或反應容器中。而且，毋 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4*!格·（ 210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 493002 A7 -__BI____ 五、發明説明（12 ) 糸對該反應混合物或其中任何成份，進行耗費人工、時間 或金錢之分離或處理操作。此外，可直接使用自第一轉化 階段所製得之產物，做爲用於第二轉化階段之餵料。需要 進行調整或彳貞測之參數僅爲pH値與溫度。 弟二轉化階段可於爲約3至約j之pH値範圍下完成。對於 弟二轉化階段而言，較佳之pH値範圍爲約}至約8。所使用 之pH値’主要係視所使用之酵素類型而定，且應由此而進 行選擇。於大多數案例中，該pH値可藉由添加一或多種適 苴酸類，例如醋酸、硫酸、磷酸、鹽酸或任何其他適宜之 試劑’自第一階段之相對上爲高或蛤性之pH値降低而調整 得。經預期於大多數案例中，較佳係使用食品級之試劑或 酸類。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閎讀背¾之注意ΐ項再填寫本頁} '、·1Τ 第二轉化階段可於爲約5。(：至約75t之溫度下完成。對 於第二轉化階段而言，較佳之溫度爲約5T：至約6(TC。最 佳 < 溫度爲約35°C至約55°C。較佳地，係將該反應系統於 經歷整個從異黃酮葡萄糖原，成爲異黃酮葡萄配糖基之轉 化作用期間，維持在相對上恆定之溫度下。然而，想像得 到於某些案例中，可能希望於經過第二階段轉化過程時， 將溫度增加、減低或改變。 對於第二轉化階段之所需時間，主要係視各種與酵素有 關足因素、以及該系統之溫度與1)11値而定。某些案例中， 可把於24小時内達到實質上之轉化作用。用以完成第二轉 化階段I所需時間，可藉由追加酵素之添加而顯著地減 少’且可能減少約1小時至約3小時。 -15-
第一轉化階段可將至少大部分之異黃酮葡萄糖原轉化 成爲異買_葡萄配糖基。於第二階段期間，將異黃酮葡萄 糖原轉化成爲異黃酮葡萄配糖基冬作用程度，代表性地爲 j至少80%至100%，且較佳地爲約9〇%至1〇〇%。藉由使用 前述之較佳反應參數，其可能達到95%或更高之轉化作 用。此等高的轉化率，於可信賴之基礎上係顯著的，丑希 望用於商業應用之上。 於芫成第二轉化階段時，將相對上不可溶之異黃酮葡菊 配糖基，較佳地藉由離心或過濾作用，而自該系統中移 出。一旦孩葡萄配糖基被取出後，可將其藉由以適當溶劑 萃取，而與任何粉碎粒子或其他同體分離。此類溶劑之實 例包括（但非限定於），丙酮及/或醇類如乙醇。亦可想 見，可將一或多種絮凝劑於第二轉化階段之前、前間或之 後，添加至孩系統或混合物中，以助於使異―黃酮葡萄配糖 基沈澱。 以下實施例敘述本發明特定，但非限制性之具體實施 例。 實驗 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明藉由下列，使用大要些料做爲植物性物料之實施 例中，以進一步詳細例舉説明。該等實施例意欲用做説 明，而不應以任何方式被視爲，用以限定或限制本發明之 範圍。 諸如大豆蛋白質分離物、濃縮粉或粉末之植物性蛋白質 物料，包括具有相對應共轭物、葡萄糖原、及葡萄配糖基 -16- 本紙張尺度適财關^τ^Α4胁（21Q謂巧 493002 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 A7 ___________B7 _ 五、發明説明（14 ) 之異黃酮的大豆黃素、金雀異黃素及黃豆黃素《家族，， 而其中金雀異黃素家族含有共軛物6"-〇Mai金雀異黃甞與 6”-OAc金雀異黃甞、葡萄糖原金雀異黃甞、及葡萄配糖基 金雀異黃素；大i黃素家族含有共軛物6”_〇Ma丨大豆黃甞 與6”-OAc大豆黃甞、葡萄糖原大豆黃甞、及葡萄配糖基大 豆黃素；黃豆黃素家族含有共軛物6,，-〇Mai黃豆黃苷與 6”-OAc黃豆黃苷、葡萄糖原黃豆黃甞、及葡萄配糖基黃豆 黃素。於以下之實施例中，該等異黃酮之濃度係，以莫黃 ’家族之百分率測量得。例如，於金雀異黃素家族中：％ 6”-OMal金雀異黃:y： + % 6"_〇Ac金雀異黃苷+ y。金雀異 黃苷+ %金雀異黃素=1〇〇 %。共軛物轉化成爲葡萄糖 原’及葡萄糖原轉化成爲葡萄配糖基之作用程度，可藉由 比對存在異黃酮家族中之，各類化合物的百分率而測定 得。 實施例1 藉由形成初級大豆乳漿水性混合物，而製備得含有植物 性蛋白質物料之樣本。於第一系列實驗中，第一轉化階段 係藉由將所有樣本之匕11値調整至9 〇，並於72 5。〇下培育 3 ·5小時而完成。待將樣本冷卻並將其pH値調整至7 〇後， 於進行第二轉化階段之前取樣三组樣本。於第一组中，其 pH値仍、保持在之値。對於第二組，其pH値調整至8 〇。、 而於第三組中，將其pH値調整至9^0。然後將各組分兩 類，·其中第二次培育分別於4 51或5 51下進行。將所有樣 本培育小時，於期間各於〇、2、4、6與24小時下進行定 -17 一 ( CNS ) A4^( 210X297^ )-~~~^_ (請先閱讀背¾之注意事項再填寫本頁) ·.裝. -rr填寫太 、-α 五 '發明説明（15 ) Α7Β7 期分析。 下列之表I係指示藉由應用本發 料中之異黃酮共軛物，成爲異黃酮 百分率。 明方 葡萄 法’將存在大豆物 配糖基之轉化作用
表I 樣本金雀異黃金6·ΌΑο金金雀異黃 甞 雀異黃甞雀異黃# 素 纽黃答百 分 β*-〇Αο 率 大^黃素黃豆黃菩6V〇Mal·黃直夺^ 黃豆黃《 86 86 86 86 9 9 9 9 99 79 78 78 79 0 18 18 18 18 98 100 100 100 100 0 0 0 0 100 86 87 88 89 9 9 9 8 97 79 79 79 79 0 0 0 0 0 0 18 18 18 18 97 100 100 100 100 0 0 0 0 0 100 86 89 92 93 9 9 8 7 100 79 81 82 82 0 於 18 18 18 18 100 100 100 100 100 0 0 0 0 Q 0 0 0 0 0 100 86 86 S7 SS 0 9 9 8 8 99 79 78 79 80 0 丨於 0 0 0 0 0 18 18 18 18 98 100 100 100 100 0 0 0 0 0 100 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 86 87 89 91 5 4 3 2 0 9 9 8 7 100 79 79 80 81 0 丨於 18 18 】8 17 99 100 100 100 100 0 0 0 0 0 100 t=〇 86 ，丨碕 91 t=4 *J 诗 t=6树 t=24 *满 93 95 9 8 7 5 100 79 82 83 83 0 18 Π 17 17 100 100 100 100 100 0 0 0 0 100 -18- 493002 A7 B7 五、發明説明（16 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 完全或經實質上完成之將異黃酮共軛物轉化成爲異黃 酮葡萄配糖基之作用，係於所有pH値及於45°C與55°C下， 之6至24小時内的培育中發生。雖然不希望受任何特定理 論束縛，然而據信，於轉化成爲葡萄配糖基形式前所發 生，且可從上列數據觀察到之延遲期，係由於爲發生生化 合成所需之時間，亦即形成大豆或微生物殘餘酵素所致。 該延遲期亦可能由於該反應中產生第二參與者，另一酵素 受質耗盡，及/或酵素與/或之結合所致。 實施例2 於第二系列實驗中，該第一轉化階段係藉由將所有樣本 之pH値調整至11.0，並加熱至50°C達1小時而完成。然後 將樣本冷卻，並將其pH値調整至4.0或4.5。於第一组中， 將有效量之生物果膠酶（Biopectinase) 100L加入，而於第 二組中，將有效量之乳糖酶（Lactase) F加入。然後將樣本 於50°C或60°C下培育達1小時。 下列之表II係指示藉由應用本發明方法，將存在大豆物 料中之異黃酮共軛物，成爲異黃酮葡萄配糖基之轉化作用 百分率。 表II 樣本金雀異黃6M3Mal金金金雀異黃大豆黃：^ 6ν〇Μ^ 6·ΌΑο·大立黃素黃豆黃甚黃豆黃素 苷 雀異黃Ϋ雀異黃甞 素 大JL黃甞大豆黃# 黃豆黃甚 百分率 第一暗段 轉用 i前··~ 25.9 61.6 0 12.5 2S.4 58.2 2.9 10.5 37.9 55.4 6.7 之後： 89.5 0.0 0 10.5 89.7 0.0 0.0 10.3 100.0 0.0 0.0 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請· 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再4 填t %裝 本衣 頁 訂 493002 A7 B7 五、發明説明（17 ) 表II續 樣本金雀異黃6*_OMaI金6^A^r金雀異黃大豆黃# 甞 雀異黃芬雀異黃茲 素 百 第二段轉 化作用 pH45,50 eC，l 树 百分率生 物果膠酶 6*楊沾 6··ΟΑ〇大五黃素黃豆黃答黃豆黃素 技黃答纽黃甞 黃豆黃答 分 率 KXI (固體 m 5.3 9.9 0 0 90.1 7..9 4.4 20.4 0 0 79.6 1^.6 2.2 43.1 0 0 56.9 42.2 1.1 62.4 0 0 37.6 62.0 0.5 百紳 乳糖酶F (固體基 75.4 0 0 24.6 75.1 11.1 0.0 0 0 100.0 0 8.9 0.0 0 0 100.0 0 4.4 0.0 0 0 100.0 0 2.2 0.0 0 0 100.0 0 U 0.0 0 0 100.0 0 0.6 pH45»60 eC 4.2 ，1 0 0 95.8 0 ooooo0.00.02.42.12.12.2
ooooo OOOJOOO 92.1 74.8 0 25.2 81.4 75.2 0 24.8 57.8 77.8 0 22.2 38.0 100.0 0 0.0 24.9 100.0 0 0.0 100.0 0.0 0 100.0 100.0 0.0 0 100.0 97.6 0.0 0 100.P 97.9 0.0 0 100.0 97.9 0.0 0 100.0 97.8 15.9 0 84.1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 百分率生 物果膠酶 100L (固體 m) 5.3 5.5 0 0 94.5 5.0 4.4 12.9 0 0 87.1 12.5 2.2 70.9 0 0 29.1 34.6 1.1 55.0 0 0 45.0 55.9 0.5 70.9 0 0 29.1 72.2 百鲜 乳糖酶F (固體基質） 11.1 0.0 0 0 100.0 0.0 8.9 0.0 0 0 100.0 0.0 4.4 0.0 0 0 100.0 0.0 2.2 0.0 0 0 100.0 0.0 U 0.0 0 0 100.0 0.0 0.6 5.2 pH40,50 eC，l 0 0 94.8 4.0 百分率生 物果膠酶 100L (固趙 基 5.3 13.4 0 0 86.6 12.5 4.4 23.0 0 0 77.0 22.5 2.2 65.3 0 0 34.7 66.0 1.1 66.4 0 0 33.6 67.0 0.5 77.9 0 0 22.1 77.7 ooooo 2.2.2.2.2. ooooo oooooo ooooo 95.0 71.0 0 29.0 87.5 100.0 0 0.0 65.4 75.5 0 24.5 44.1 78.5 0 21:5 27.8 100.0 0 0.0 100.0 0.0 0 100.0 97.7 0.0 0 100.0 97.8 0.0 0 100.0 97.9 0.0 0 100.0 97.9 0.0 0 100.0 93.8 29 0 71.0 87.5 75.8 0 24.2 77.5 76.6 0 23.4 34.0 100.0 0 0.0 33.0 100.0 0 0.0 23.3 100.0 0 0.0 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 493002
表II績 樣本金雀異黃6*«OMal金6X)Ao冷金雀異黃 甞 雀異黃甞雀異黄苷 素 百分率 乳糖酶F (固粧t) 百 分 ③产好黃豆黃甞幡处黃謝 1 黃豆黃甞率 4.4 0 0 0 100.0 2.2 0 0 0 100.0 1.1 0 0 0 100.0 0:6 0 0 0 100.0 ο 2·22'12·22·4 97.8 97.9 97.8 97.6 0.0 0.0 24.9 44.2 100.0 100.0 75.1 55.8 班40，60 eC，1辦 ^分率生 物果膠酶 W0L (固體 m 5.3 10.1 0 0 89.9 4.4 21.4 0 0 78.6 2.2 45.1 0 0 54.9 1.1 65.6 0 0 34.4 0.5 百辨 乳糖酶F (固酿 73.5 0 0 26.5 4.4 0.0 0 0 100.0 2.2 2.1 0 0 97.9 1.1 14.6 0 0 85.4 0.6 41.3 0 0 58.7 4 6· 7 2 J °·2·νρ 7 5 1 2 Φ 6 7 89.6 77.4 53.3 32,8 25.5 72.8 74.2 77.9 100.0 100.0 27.2 25.8 22.1 0.0 0.0 0.0Θ.0Ι9.447.9 2 1 ο*° 2· 2· ο· ο· 97.8 97.9 80.6 52.1 30.9 54.0 67.1 74.3 69.2 46.0 32.9 25.7 ,/ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例3 於第三系列實驗中，該第一轉化階段係藉由將所有樣本 之PH値調整至U:0，並加熱至2(rC達i小時而完成。然後 將樣本冷卻’並依照將其pH値調整至4.0、4.5及5.0而區分 爲二組。將生物果膠酶（Biopectinase) 100L以每1〇〇克初級 乳f含0二〇4克生物，膠酶之濃度，加入各樣本中。然後將 所有樣本於5〇°c 以下所呈現之表III，係列示藉由應用本發明方法，將存 在大豆物料中之異黃酮共軛物，成爲異黃酮葡萄配糖基之 轉化作用百分率。
表III -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） 493002
樣本金雀異黃济C»/lal金 第一陪段 轉化作用 甞 雀異黃甞 之前： 18.6 32.8 之後： 第二段轉 化作用 pH 5.0 52.3 2.5 48.5 45.2 百 32.2 63.5 分 率 3Zg1.8 34.9 34.7 33.6 60.1 28.00.0 38.4 39.9 t=0 *J 骑 51.0 t=a5 树 39.4 t=1.0，J妨 30.0 t=L5 23.0 t=2.0妨 18.2 t=3.0 树 11.9 pH 45 t=0树 50.4 t=0t5 树 35.0 t=L0 *J>3^ 24.8 t=L5 树 16.3 t=2.0，!骑 12.1 t=10，J诗 6.7 pH 40 t=0树 t=(15 t=LO 树 t=L5 树 t=2.0 t=3.0 树 ο·43·31 4 ο· 4·4·6·2·6· 5 3 2 1 1 ί 實施例 2.5 2.5 2.4 2.4 2.2 2.1 2.5 2.4 2.3 2.1 2.1 1.8 2.5 2.4 2.3 2.1 2.1 1.7 4 46.5 58.1 66.9 74.6 79.6 86.0 47.1 62.6 72.9 81.6 85.8 91.5 47.5 63.3 73.4 81.6 85.8 91.9 62.2 47.9 37.6 28.6 22.5 14.6 61.1 43.6 31.120.2 15.4 8.5 60.1 42.2 30.020.2 15.4 7.5 18 18 181.61.61.6 18 16 18 1.4 1.4 1.3 19 18 161.4 1.6 1.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36.0 50.3 60.6 69.8 75.9 83.8 37.1 54.8 67.2 78.4 83.1 90.2 38.1 56.1 68.4 78.4 83.1 91.3 59.1 57.1 55.6 54.9 53.4 51.4 60.1 56.5 54.3 53.3 50.9 0.0 59.5 55.0 55.0 53.3 51.9 49.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40.8 42.9 44.4 45.1 46.6 58.6 39.9 43.5 54.7 46.7 49.1 100.0 40.5 45.0 45.0 46.7 48.1 50.7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
於第四系列實驗中，該第一轉化階段係藉由將所有樣本 之pH値調整至8·0，並將溫度維持於72 下達24小時而 完成。經該24小時期間定時吸取樣本。 以下所呈現之表VI，係列示藉由應用本發明方法之第一 階段’將存在大豆物料中之異黃酮共軛物，成爲異黃嗣葡 萄糖原之轉化作用百分率。 表IV •22- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A#規格（21〇χ297公釐）
493002 A7 B7 五、發明説明（2G ) 樣本 金雀異黃抑撕金β··ΟΑί>金 金雀異黃 纽黃答 σ-〇Α〇 纽黃素 黃豆黃答 黃豆今 苷 雀異黃菩 雀異黃芬 素 纽黃$ 技黃# 黃豆黃苷 百 分 率 |)H &0 t=0，j喊 27 52 0 21 28 52 2 18 41 45 16 t=2树 53 30 0 17 52 29 1 18 58 26 16 t=4 Ί'ίφ 66 19 0 15 64 17 1 18 70 15 15 t=6，!辦 73 13 0 14 71 11 1 17 72 11 17 t=9，J辦 81 7 0 12 77 6 0 17 78 6 16 t=24 树 79 .1 0 20 79 0 0 21 80 0 20 實施例5 於第五系列實驗中，該第二轉化階段係藉由使用各種不 同市售可得之貝他-半乳糖甞酶酵素而完成。將從大豆物 料獲得之初級乳將，與水混合成其中固體含量爲5°/9之漿 液。將pH値調整至11，並將溫度維持於25°C下達45分鐘， 而使異黃酮共軛物轉化成爲異黃酮葡萄糖原。然後取樣以 測定藉由各種濃度爲2%與10%之酵素，於50°C之溫度，及 於4.5與7.0之pH値下之轉化作用，該轉化程度係於t = 0、1 及4小時下測定得。 以下所呈現之表V，係列示轉化作用百分率及所形成之 (請先閱讀背两之注意事項再填寫本頁)
異黃酮分佈情形。 表V 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 樣本 金雀異黃6^0MaI金金雀異黃 纽黃答 6V〇A> 纽针黃豆料 黃豆黃素 苷 雀異黃菩 雀異黃菩 素 技黃答 黃豆黃# 百 分 率 2% Νλό LadcBmr e 3000L pH 4.5 t=0 *J>3^ 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l d喊 78 8 0 14 80 7 0 13 86 0 14 t=4 77 8 0 15 80 7 0 13 84 0 16 pH 7.0 t=(H 辦 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 72 8 0 20 77 7 0 16 72 0 28 t=4如寺 68 8 0 24 74 7 0 19 61 0 39 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 493002 A7 B7 五、發明説明（21 ) 表V續 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 樣本 金雀異黃6*·〇Αί>金金雀異黃 ^JL 黃# 6*<X\faI- 6·-ΟΑί> 黃豆黃答 6*-α\ω- 黃豆姑 雀異黃菩雀異黃接 素 技黃$ 技黃甞 黃豆黃甞 百 分 率 10%Novo ladceynm ϊ 3000L pH 4.5 t=0 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l橫 78 8 0 14 80 7 0 13 84 0 16 t=4，!特 pH 7.0 78 8 0 14 80 7 0 13 82 0 18 t=0 4砷 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l，J辦 53 9 0 38 66 8 0 26 25 0 75 t=4树 32 10 0 58 50 S 0 42 α 0 100 2% Maxilact L2000 pH 4.5 t=0 对 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=4树 76 7 0 17 76 7 0 17 73 6 21 pH 7.0 t=0树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 71 7 0 22 73 6 0 21 56 7 37 t=4，!辦 65 7 0 28 69 5 0 26 52 0 48 10% Maxilact L2000 ' pH 4.5 t=0树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 78 7 0 15 78 6 0 16 75 6 19 t=4骑 pH 7.0 77 6 0 17 77 6 0 17 77 0 23 t=0树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l »!辦 49 7 0 44 59 5 0 36 17 7 76 t=4，⑽ 25 S 0 67 39 6 0 55 0 0 100 2% Pfizer 中性乳 螗酶 pH 4.5 t=0树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=i *j>a# 77 7 0 16 77 6 0 17 73 7 20 t=4树 pH 7.0 77 7 0 16 77 6 0 17 76 0 24 t=0 ,J# 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 70 7 0 23 72 5 0 23 70 6 24 t=4 祷 55 7 0 38 60 6 0 34 66 0 34 10% Pfizer中性乳糖 酶 pH 4.5 t=0树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 78 6 0 16 78 5 0 17 73 7 20 t=4 pH 7.0 78 6 0 16 77 6 0 17 76 0 24 t=o，i 神 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l /]>a$ 35 8 0 5? 46 6 0 48 51 0 49 t=4，J辦 2 8 0 90 4 6 0 90 0 0 100 -24- (請先閲讀背¾之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 493002 A7B7 五、發明説明（22 表V讀 樣本金雀異黃金金雀異黃 苷 雀異黃替雀異黃淙 素 2% Quest生物乳糖酶 30,000 ^>黃菩6*〇Malr 6*«ΟΑ〇· 黃素黃豆黃:y： 6*楊黃豆 技黃# U黃甞 黃豆黃甞 、 率 pH 4.5 t=0树 t=i *!>s^r t=4树 pH 7.0 t=0 *J# t=l树 t=4，!辦 10% 78 0 0 78 2 0 Quest 生 7 6 4 7 7 7 物乳糖 0 0 0 0 0 Ο 酶30,000 15 94 96 15 91 93 77 Ο Ο 77 3 Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο 16 94 95 16 90 94 75 Ο Ο 75 29 Ο 19 100 100 19 71 100 pH 4.5 t=0树 t=l树 t=4树 pH 7.0 t=0，J>3^ t=l树 t=4橫 2% Quest 78 0 0 78 0 0 中性乳 7 4 2 7 7 7糖臶 15 96 98 15 23 38 77 Ο Ο 77 Ο Ο 7 4 3 7 7 6 16 96 97 16 93 94 75 Ο Ο 75 Ο Ο 19 100 100 19 100 100
pH 4.5 t=0⑽ 78 7 0 15 77 7 t=l，J_ 73 6 0 21 76 5 t=4，J骑 73 6 0 21 76 5 pH 7.0 tU辦 78 7 0 15 77 7 t=l *1* 2 7 0 91 7 4 t=4 *1 特 0 7 0 93 0 4 10% ( ^U€St 中 性乳糖 酶 pH 4.5 t=0]特 78 7 0 15 77 7 t=l 73 6 0 21 76 5 t=4树 72 6 0 22 75 5 pH 7.0 t=0树 78 7 0 15 77 7 t=l树 0 7 0 93 0 4 t=4树 0 7 0 93 0 4 16 19 19 16 89 96 75 79 76 75 15 Ο 19 21 24 19 85 100 訂(請先.H讀背面•之注意事項再填寫本頁) 16 19 20 16 96 96 75 79 77 75 Ο Ο 19 21 23 19 100 100 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例6 於第六系列實驗中，該第土轉化階段係以自前述第五系 列實驗中，第一階段所產生之物質而完成。該第二轉化階 段係藉由使用濃度爲5%與10%之生物果膠酶 (Biopectinase) 100L及乳糖酶F，於5〇。(：及於爲3.0之pH値 下完成。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董)
493002 A7 B7 五、發明説明（23 ) 以下所呈現之表VI，係列示藉由使用該等酵素所獲得之 轉化作用百分率。
表VI 樣本 5%生物 果膠酶 100L 金雀異黃6^0Mal金金雀異黃 甞 雀異黃$雀異黃$ 素 百 U黃嘗 分 6*-OAo- 技黃甚 率 大^黃素黃豆黃嘗 6·^^-黃豆黃菩 黃豆黃素 t=0，J妨 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l，J辦 30 5 0 65 30 5 0 65 67 0 33 t=4 27 4 0 69 27 4 0 69 61 0 39 t=7橫 10%生物 果膠酶 100L 11 3 0 86 10 3 0 87 52 0 48 t=0，J祷 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l树 27 4 0 79 27 4 0 69 61 0 39 t=4 9 2 0 89 9 1 0 90 41 0 59 t=7树 5%乳糖 酶F 8 1 0 91 8 1 0 91 34 0 51 t=0 4 辦 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l*l 特 68 7 0 25 71 6 0 23 80 0 20 t=4 »1 辦 68 6 0 26 71 6 0 23 80 0 20 ，J 特 10%乳糖 酶F 68 6 0 26 71 6 0 23 79 0 21 t=0树 78 7 0 15 77 7 0 16 75 6 19 t=l 辦 65 7 0 28 68 6 0 26 79 0 21 t=4 Ί'# 64 6 0 29 67 6 0 27 78 0 22 t=7树 64 6 0 30 67 5 0 28 78 0 22 實施例7 (請先閱讀背vS·之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於另一系列實驗中，該第一轉化階段係藉由將含有10% 經噴乾初級乳漿懸浮液，之水性樣本的pH値調整至11，加 熱至35°c並將保持達3〇分鐘。然後將所成富含葡萄糖:y：之 樣本的的pH値調整至4.5,並分配成150克之樣本。然後將 三種不同市售可得之酵素，即Aipha-Gal 600L、G-Zyme 990 與生物乳糖酶（Biolactase)30,000加入該等樣本中。於各樣 本加入0.15克之各一酵素類型。然後將樣本於50°C下培育 4小時。針對各培育中之樣本，於酵素添加後的0、1、2、 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） 493002 A7 B7 五、發明説明（ 24
3及4小時時，進行自異黃酮葡萄糖甞轉化成爲異黃酮葡萄 配糖基之作用程度的測量。 以下所呈現之表VII，提供藉由使用該等特定酵素所獲 得之轉化作用百分率。 表VII
樣本 富含葡萄 糖棼之初 金雀異黃金6··ΟΑο^τ 甞 雀異黃甞雀異黃:a： 金雀異黃 素 百 纽黃# 分 6^-OAd- 技黃芬 率 拉黃素 黃豆黃# 黃豆黃答 黃豆专 級乳漿起 始物料 Alpha-Ga! 600L 83 0 0 17 83 0 0 17 81 5 13 t=0树 66 1 0 33 63 0 0 37 80 0 20 t=l 4辦 4 0 0 96 2 0 0 98 23 0 77 t=^2 1 0 0 99 0 0 0 100 10 14 76 t=3辦 0 0 0 100 0 0 0 100 6 0 94 t=4，!持 G-Zyme 990 0 0 0 100 0 0 0 100 8 14 78 t=0 63 1 0 37 60 0 0 40 79 0 21 t=l 辦 49 1 0 51 41 0 0 59 82 0 18 30 1 0 69 21 0 0 79 79 0 21 t=3 18 0 0 82 11 0 0 89 69 11 19 t=4 *1妨 生物乳 糖酶 30,000 11 1 0 88 5 0 0 95 67 12 21 t=0树 56 1 0 43 57 0 0 43 70 0 30 t=i 妨 1 0 0 99 0 0 0 100 11 0 89 t=2树 0 1 0 99 0 0 0 100 9 0 91 t=3树 0 0 0 100 0 0 0 100 8 14 78 t=4，i妨 0 0 0 100 0 0 0 100 8 15 7S 請 先 閱 讀 背 注 意 事 項 再 填 馬 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例8 於第八系列實驗中，係藉由使用各參數乏不同组合，而 將存在初級乳漿起始物料中之異黃酮共軛物，轉化成爲異 黃酮葡萄糖甞。第一階段轉化作用係於爲121 °C之溫度， 及爲6、7.1與7.5之pH値下；於爲80°C之溫度及爲6、7.1 與7.5之pH値下；於爲20°C之溫度及爲11:5、12、13與13.7 之pH値範園下完成。第一階段轉化作用亦於相對上低之溫 -27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 493002 A7 B7五、發明説明（25 ) 度，例如6°C下完成。以下所呈現之表VIII，提供藉由前 述pH値與溫度之组合，乳達成之轉化作用百分率。異黃酮 共軛物轉化成爲其相對應異黃酮葡萄糖苷形式之作用，可 藉由使用較長之轉化時間，而達到$) %甚或更高。
表 VIII 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 樣本 金雀異黃6*·ΟΜ3ΐ金 金雀異黃 U黃甞 6^-OMaI- ff-OAch 技姑黃豆黃甞 6*0^ 黃豆村 甞 雀異黃甞雀異黃答 素 黃 黃豆黃# 百 分 率 初級乳漿 起始物料 17 62 0 21 10 68 2 20 29 46 25 121°C (使用氫氧 化鈉調整 袖值） pH 60 81 0 0 19 71 3 8 18 54 10 36 pH 7.1 75 9 0 16 70 8 6 17 61 6 34 pH 7.5 78 7 0 15 72 7 6 16 64 4 31 121°C (使用氫氧 化鈣調整 儘） pH 6.0 72 13 0 15 64 12 7 16 56 9 35 pH 7.1 77 8 0 15 71 7 6 17 62 5 33 pH 7.5 84 4 0 12 77 3 4 15 72 0 28 樣本維持於80°C下5小時 (使用氩氧 化納調整 々聰 pH 60 59 27 0 14 55 26 3 16 62 18 20 pH 7.1 70 19 0 12 65 18 2 16 68 14 18 pH 7.5 73 16 0 11 67 15 2 16 70 12 18 樣本維持於8〇°C下5小時 (使用氫氧 化鈣調整 僅） pH 60 61 26 0 13 56 26 3 15 61 18 21 pH 7.1 72 17 0 12 65 16 2 16 67 13 18 pH 7.5 80 10 0 10 73 9 2 16 74 8 21 樣本維持於6 Ό下17.5小時 pH 9.5 73 14 0 13 72 13 0 15 91 0 9 樣本維持於2〇eC下15分鐘 pH 1L5 82 2 0 15 η 2 0 16 93 0 7 pH 12.0 85 0 0 15 84 0 0 16 93 0 7 pH 13.0 91 0 0 9 84 0 0 16 93 0 7 pH 13.7 84 0 0 16 S9 0 0 11 100 0 0 實施例9 於另一系列實驗中，务初級乳漿混合物中使異黃爾共軛 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背¾之注意*項再填寫本頁) «裝·
、1T 493002 A7 B7五、發明説明（26 ) 物，成爲異黃嗣葡萄糖甞之第一轉化階段，係於爲2°C與6 °C之溫度，及爲11與12.3之pH値範圍下完成。此試驗之結 果列式於下表IX中。
表IX 樣本 金雀異黃6**OMal金6*·ΟΑ〇金 甞 雀異黃1?雀異黃# 期热轉化成葡萄糖S之作用 於2。0 (冰 闷下 金雀異黃 素 百 6*-OMal-U黃眷 分 6··ΟΑ〇» 率 技黃素 黃豆黃苷 黃豆黃答 黃豆村 t=0 阳11.0， 17 62 0 21 10 68 3 20 29 46 25 t=l »]>3φ 闲 12.3， 40 39 0 21 40 38 4 17 15 73 12 t=l树 於6。(：（冷 鄉下 81 0 0 19 83 0 0 17 100 0 0 t=0 ρΗΙΙ.0» 17 62 0 21 10 68 3 20 29 46 25 t=l .J妨 riiU.3» 80 0 0 20 83 0 0 17 100 0 0 t=l 诗 81 0 0 19 77 0 0 23 100 0 0 實施例10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
於第十系列實驗中，使異黃酮葡萄糖原成爲異黃酮葡萄 配糖基之第二階段轉化作用，係於爲8°C之溫度及爲4.5與 7之pH値範圍下，分別使用Amano乳糖酶50,000及Quest中 性乳糖酶完成。富含葡萄糖苷之乳漿混合物，係藉由將初 級乳漿混合物進行於爲11之pH値，及爲35°C之溫度下所完 成之第一階段轉化作用而形成。於形成該富含葡萄糖苷之 混合物後，即進行第二階段轉化作用。 以下所呈現之表X，提供藉由上述pH値與溫度之组合， 所達成之轉化作用百分率。 表X -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 493002 A7 B7五、發明説明（27 ) 樣本金雀異黃⑼編金金雀異黃 σ-ΟΑί> 黃豆黃菩 黃豆好 苷 雀異黃：§：雀異黃杳 期动#ί匕成葡勒綠之作用 以Quest中性乳餘酶 pH 7.0^ 8·(：，t=23 小時 素 百 U黃答 分 炫黃答 率 黃豆黃替 t=0 71 9 1=23 5% mfjn 0 20 74 8 0 I 19 100 0 0 度 12 ίο t=23 树 10%酵麦 0 78 26 9 0 、 65 49 0 51 m 〇 π 赋綱配用 以Ammo乳糖酶50,000 pH 4.5， 8 eC，t= 23 小時 0 89 0 10 0 90 0 0 100 t=0 71 9 t=23 5%赖衷 0 20 74 8 0 19 100 0 0 度 〇 10 t=23 10%酵素 0 90 0 9 0 91 0 0 100 m 〇 ιοί 實施例11 0 90 0 9 0 91 0 0 100 於第十一系列實驗中，其中使異黃酮葡萄糖苷成爲異黃 (請先閱讀背面^注意事項再填寫本頁) 、^1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 酮葡萄配糖基之第二階段轉化作用，係於爲35°C之溫度及 爲4.0與4.5之pH値範圍下完成。將第一組含有異黃酮共軛 物之初級乳漿樣本，進行於爲11之pH値及爲35 °C之溫度 下，所完成之第一階-段轉化作用。然後將所成富含葡萄糖 嘗之混合物，進行使用5%生物果膠酶（Biopectinase) 100L，爲4之pH値及，爲35°C之溫度而完成之第二階段轉 化作用。將第二组初級乳漿樣本，如前所述轉化成富含葡 萄糖苷之樣本，其後於爲4之pH値及爲35T：之溫度下，使 用2%乳糖酶F。 以下所呈現之表XI，説明所獲得之轉化作用百分率。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 493002 Μ Β7五、發明説明（28 ) 表ΧΓ 樣本 金雀異黃6^CMal金金 金雀異黃 σ-OMa^r 6·-ΟΑί> 黃豆黃贫 6*福lal· 黃豆， 甞 雀異黃答雀異黃答 素 纽黃洛 纽黃菩 黃豆黃甞 百 分 率 初級乳漿 17 62 0 21 10 68 2 20 29 46 25 组A (5%生物果膠酶 100L) 步驟1:共軛物轉化成葡萄糖甞之作用 ，pHU， 35 V t=43 诚 82 0 0 18 76 0 0 24 100 0 0 t=60 赠 84 0 0 16 77 0 0 23 100 0 0 步樣2 :葡萄糖甞轉化成葡萄配糖基之作用，pH 4.0，35°C t=l树 5 0 0 95 12 0 0 88 44 0 56 t=1.5 *J特 0 0 0 100 0 12 0 88 37 0 63 t=20 ^ 0 0 0 100 0 12 0 81 32 0 68 组B (2%果膠酶F) 步骤1:共耗物轉化成葡萄糖甞之作用 ，ρΗ11， 35 *C t=45 Mk 83 0 0 17 77 0 0 23 100 0 0 t=60 維 82 0 0 18 77 0 0 23 100 0 0 步樣2:葡萄糖甞轉化成葡萄 配糖基之作用，pH 4.0,35eC t=l，J特 4 0 0 96 0 0 0 100 45 G 55 t=1.5，J特 0 0 0 100 0 0 0 100 39 0 61 t=20 0 0 0 100 0 0 0 100 34 0 66 (請先閱讀背¾之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 所有針對6"-OMal-金雀異黃甞、6”-OAc-金雀異黃甞、 6、OMal大豆黃苷、6”-OAc大豆黃苷、黃豆黃甞、6"-OMal 黃豆黃苷與黃豆黃素之百分率，皆爲經計算之質。針對酵 素濃度之百分率，係從各樣本中每100克固體，所含市售 酵素製劑之克數而計算得。 以下係描述用於定量存在大豆產物中之異黃酮的方 法。諒等異黃酮係藉由將0.75克樣本（經噴乾或經細密研磨 之粉末），與50毫升80/20甲醇/水溶劑混合，而從大豆產物 中萃取出。將該混合物於室溫下，以執道搖晃器搖晃2小 時。經2小時後，將剩餘未溶解之物質，藉由通過哇特曼 (Whatmann™)第42號濾紙過濾而去除。將五毫升濾液以4 毫升水及1毫升甲醇稀釋。 將所萃取得之異黃酮經由，使用Hewlett Packard C18-31 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493002 A7 __B7 五、發明説明（29 )
Hypersil逆相管柱之HPLC (高效能液相層析術）分離。將異 黃酮注入於該管柱上方，並以從88%甲醇、10%水與2%冰 醋酸起始，而終於98%甲醇與2%冰醋酸之溶劑梯度溶析。 於0·4亳升/分鐘之流速下，所有異黃酮-金雀異黃苷、6，，_ 0-6醯基金雀異黃甞、6"-0-丙二醯基金雀異黃：y：、金雀 異黃素、大豆黃苷、6，，-0-乙醯基大豆黃苷、6，，-〇-丙二醯 基大旦黃苷、大豆黃素、黃豆黃苷及其衍生物與黃豆黃素 -皆清楚地解析出。以於260毫米下之UV吸收偵測高峰。 高峰之確認係藉由HPLC-質譜儀完成。 疋量作用係藉由使用講自In(j〇fine化學公可，夏谷 (Sommerville)，N.J·之純標準物（金雀異黃苷、金雀異黃 素、大豆黃甞與大豆黃素）而達成。反應係數（經整合之面 積/濃度）係針對上述各化合物計算得，並用於定量未知之 樣本。對於無法市售得純標準物之經共軛形式，其反應係 數經推論爲母體分子者，但經分子量差異之校正。對於黃 且黃苷之反應係數，係推論爲金雀異黃苷，經分子量差異 之校正而得者。 此方法提供各別異黃酮之定量。爲方便起見，可計算總 金雀異黃素、大旦黃素與黃豆黃素，且若所有共軛物形式 皆轉化爲其各別之未共軛形式時，則其代表此等化合物之 集口重量。此等總値亦可藉由，一種使用酸水解作用將共 輛物形式轉化之方法’而直接制董得。 前述僅爲本發明之較佳具體實施例。於未偏離列示於所 附屬申請專利範圍中之本發明精神與廣義層面下，可進行 (請先閲讀背¾之注倉寒項再填寫本頁) .«裝· 訂 -32
493002 A7 B7 五、發明説明（3° 各種改變與修飾，其係根據包括相等主義（Doctrine of Equivalents)之專利法原則而做解釋。 (請先閲讀背^5注I事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -33 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

  1. 493002 Α8 Β8 C8 第086113534號專七鲁案逢·太 中文申請專利範圍叔 申請專利範圍 ...1ϊ 年 η 猶】 1 · 一種將異黃酮共輛物轉化成異黃酮葡萄配糖基之方 法，其包含： 形成包含異黃艱I共輛物與水之混合物； 將該混合物於為6至13.5之pH值，及為2°C至121 °C之溫度下，處理一段足以將大部分之異黃酮共軛物 轉化成為異黃酮葡萄糖原之時間；以及 將存在該混合物中之異黃酮葡萄糖原，於3至9之 pH值及為5°C至75°C之溫度下，與一種能夠將異黃酮 葡萄糖甞鍵裂解之酵素接觸一段，足以將該之異黃酮 葡萄糖原轉化成異黃酮葡萄配糖基之時間。 2·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中係將該含異黃 酮共軛物與水之混合物，於為9之pH值，及為45°C 至75°C之溫度下處理。 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中係將該含異黃 酉同共軛物與水之混合物，於為1 1之pH值，及為5°C 至5 0 °C之溫度下處理。 4·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該等與該酵素 接觸之異黃酿I葡萄糖原，係從該等異黃酮共軛物轉化 成之異黃酮葡萄糖原，以及於將該等異黃酮共軛物轉 化成異黃酮葡萄糖原之前即存在該混合物中之黃酮葡 萄糖原。 5 ·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該異黃酮共軛 物係存在植物蛋白質物料中。 6.根據申請專利範圍第5項之方法，其中係將該含有異 申請專利範圍 黃酮共軛物之植物性蛋白質物料漿液，於為9之PH 值’及為4 5 °C至7 5 °C之溫度下處理。 7·=據申請專利範圍第5項之方法，其中係將該含有異 黃酮共軛物之植物性蛋白質物料漿液，於為丨丨之 值’及為5 °C至5 0 °C之溫度下處理。 8.根據申請專利範圍第5項之方法，其中將酵素該等異 κ酮葡萄糖原接觸之步驟包含，將一有效使該等異黄 酉同葡萄糖原的異黃酮葡萄糖：y：键裂解之總量的追加酵 素，添加至該漿液中。 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該追加酵素包 含一種能夠裂解1，4-葡萄糖甞鍵之糖酶酵素。 1 〇 ’根據申请專利氣圍第9項之方法’其中該追加酵素係 選自阿爾伐-半乳糖甞酶酵素、貝他-半乳糖甞酶酵素、 葡萄糖-澱粉酶酵素、果膠酶酵素及其組合物。 1 1.根據申請專利範圍第5項之方法，其中該追加酵素係 以’為該植物性蛋白質物料之乾重的，〇 · 1 %至1 〇 % (以 重量計）之濃度添加至該漿液中。 12·根據申請專利範圍第5項之方法，其中該等與該酵素 接觸之異黃酮葡萄糖原，係從該等異黃酮共辆物轉化 成之異黃酮葡萄糖原，以及於將該等異黃酮共輕物轉 化成異黃酮葡萄糖原之前即存在該混合物中之黃酮葡 萄糖原。 1 3 ·根據申請專利範圍第5項之方法，其進一步包含將該 等異黃酮葡萄配糖基自該漿液中分離出。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) C8
    •:存在植物性蛋白質物料中之異黃酮共輛物轉化 =二，萄糖原、將該異黃_葡萄糖原自該植物性 貝」枓中取出、並將該異黃酉同葡萄糖原轉化成異 更酮匍匈配糖基之方法，其包含： 形成含有異黃酮共輛物之植物性蛋白質物料 液； 將田該装液於為6至13.5之阳值，及為代至i2rc 、.度下處理一段足以將大部分之異黃酮共輛物轉 化成為異黃嗣葡萄糖原之時間； 將該異黃酮葡萄糖原自該植物性蛋白質物料中分離 出： 形成包含該異黃酮葡萄糖原與水之混合物； 將一種能夠將異黃酮葡萄糖-鍵裂解之酵素，與存 在咸w 5物中之異黃酮葡萄糖原，於3至9之pH值及 j 5 C至75 C《溫度下’接觸一段足以將該異黃酮葡 萄糖原轉化成異黃酮葡萄配糖基之時間。 15_根據申請專利範圍第14項之方法，其中係將該漿液於 為9之pH值，及為45。(：至75它之溫度下處理。 16.根據申請專利範圍第14項之方法，其中係將該漿液於 為11之pH值，及為5。(：至5(TCt溫度下處理。 1 7 ·根據申請專利範圍第i 4項之方法，其中該等自該植物 性蛋白質物料中分離出之異黃酮葡萄糖原，包含藉由 從該等異黃酮共軛物轉化而形成之異黃酮葡萄糖原， 以及於將該等異黃酮共軛物成為異黃酮葡萄糖原之轉 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 18. 18. 19. 20. 21. 22. 化m即存在該植物性蛋白 彳M 白★物料中之黃酮葡萄糖原。 根據申請專利範圍第14 戈獅一—「 頁 < 万法，其中將酵素該等異 两銅葡荀糖原接觸之步驟包 古、w古呤答1 # 細一— 匕 >，將一有效使該旁異黃 职匍匈糖原的異黃酮葡萄擁— j甸搪甘鍵裂解之總量的追加酵 常，添加至該漿液中。 根據申請專利範圍第18項夕、；#丄 ^ ^ 万法，其中該追加酵素包 含一種能夠裂解1,4-葡萄棘# ^、L、a ^ 同匈糖甘鍵《糖酶酵素。 根據申請專利範圍第1 9靖士 、 哪^ 固罘iy員〈万法，其中該追加酵素係 =阿爾伐·半乳”酶酵素、貝他·半乳糖料酵素、 匍甸糖-澱粉酶酵素、果膠酶酵素及其組合物。 根據申請專利範圍第18項之方法，其中該追加酵素係 以’為該植物性蛋白皙你拉 ^ 皮曰貞物枓 <乾重的，0.1%至10% (以 重量計）之濃度添加至該漿液中。 所種將異黃酮共轭物與異黃_葡萄糖原從植物性蛋白 貝物料中取出、並將該異黃酮共軛物與異黃酮葡萄糖 原轉化成異黃酮葡萄配糖基之方法，其包含： 將異黃酮共軛物與異黃酮葡萄糖原自一種含有異黃 酮共軛物與異黃酮葡萄糖原之植物性蛋白質物料中瀝 滤出： 形成含該異黃酮共軛物、該異黃酮葡萄糖原與水之 混合物； 將該混合物於為6至13.5之pH值，及為2°C至121 C之溫度下，處理一段足以將大部分該異黃酮共軛物 轉化成為異黃酮葡萄糖原之時間； -4- 493002 * A8 • B8 C8 __ D8 六、申請專利範圍" ^ 將一種能夠將異黃酮葡萄糖甞鍵裂解之酵素，與存 在該混合物中之異黃酮葡萄糖原，於3至9之pH值及 為5C至75C之溫度下，接觸一段足以將該異黃酮葡 萄糖原轉化成異黃g同葡萄配糖基之時間。 23 ·根據申請專利範圍第22項之方法，其中該濾瀝作用係 於為4至11之pH值下完成。 24.根據申請專利範圍第22項之方法，其中該濾瀝作用係 於為7之pH值下完成。 2 5 ·根據申凊專利範圍第2 2項之方法，其中係將該含異黃 酮共軛物與水之混合物於為9之pH值，及為45°C至 7 5 C之溫度下處理，以使該異黃酮共軛物轉化成為異 黃酮葡萄糖原。 2 6 ·根據申請專利範圍第2 2項之方法，其中係將該含異黃 酮共輛物與水之混合物於為1 1之p Η值，及為5 °C至 5 0°C之溫度下處理，以使該異黃酮共軛物轉化成為異 黃酮葡萄糖原。 2 7 ·根據申凊專利範圍第2 2項之方法，其中將酵素該等異 黃酮葡萄糖原接觸之步驟包含，將一有效使該等異黃 酮葡萄糖原的異黃酮葡萄糖嘗鍵裂解之總量的追加酵 素，添加至該漿液中。 2 8 ·根據申凊專利範圍第2 7項之方法，其中該追加酵素包 含一種能夠裂解1，4-葡萄糖甞鍵之糖酶酵素。 29·根據申請專利範圍第28項之方法，其中該追加酵素係 選自阿爾伐-半乳糖茹酶酵素、貝他-半乳糖荅酶酵素、 5- 本紙張尺度適用中國國家標準((：]^3) A4規格(210X 297公釐） 493002 A8 B8 C8 D8 「、申請專利範圍 葡萄糖-澱粉酶酵素、果膠酶酵素及其組合物。 3 0.根據申請專利範圍第27項之方法，其中該追加酵素係 以，為該植物性蛋白質物料之乾重的，〇·1 %至10% (以 重量計）之濃度添加至該漿液中。 3 L根據申請專利範圍第22項之方法，其進一步包含將該 等異黃酮葡萄配糖基自該混合物中分離出。 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐)
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