CN109705176A - 一种猪神经节苷脂的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效分离纯化猪神经节苷脂的方法，包括以下步骤，将猪神经节苷脂粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的溶液上样到装有均粒正相硅胶的层析柱中进行层析；采用超纯水和有机溶剂作为流动相对目标产物进行洗脱；分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总。本发明用于猪神经节苷脂的深度精纯，仅需一步层析纯化即可满足猪神经节苷脂纯度大于99％，收率大于93.0％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及药物纯化领域，特别是一种高效分离纯化猪神经节苷脂的方法。
背景技术
猪神经节苷脂(ganglioside)较多地存在于细胞膜，以其与膜功能的关系被引起重视。破伤风菌和霍乱菌的外毒素可与特定的猪神经节苷脂分子特异性结合。在水和有机溶剂中可溶。在水中是以数百万个分子聚合的微团状态存在。猪神经节苷脂对神经再生有重大促进作用，神经生长因子(NGF)和猪神经节苷脂(GM)是脑神经再生发育必需物质，GM介导NGF数十倍增强其活性，形成新的丰富的神经网络，修复并促使脑神经再次发育。
结构式如下：
目前国内外专利、文献等对猪神经节苷脂的报道多为合成方法专利，分离纯化方法鲜有报道。CN201010609319.6提供了一种猪神经节苷脂的合成方法，其中描述了硅胶柱色谱分离纯化，流动相为氯仿/甲醇/水＝40∶50∶1，该方法制备出的猪神经节苷脂纯度为98.8％，收率为38％。收率过低，因此有必要对猪神经节苷脂的分离、纯化和制备做更进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效分离纯化猪神经节苷脂的方法，仅需一步层析纯化即可满足猪神经节苷脂纯度大于99％，收率大于93.0％的要求，纯化收率高而稳定，同时本发明分离方法简单方便，可用于规模化生产，大大降低生产成本。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，将猪神经节苷脂粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的猪神经节苷脂溶液上样到装有均粒正相硅胶的层析柱中进行层析；采用超纯水和有机溶剂作为流动相对猪神经节苷脂溶液进行等度洗脱；分段收集目的峰值的猪神经节苷脂溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
优选的，所述有机溶剂为三氯甲烷、甲醇。
优选的，所述均粒正相硅胶的微球型号是UniSil正相硅胶。
优选的，上样前，对层析柱进行平衡，先用10％的水相进行除杂再生，后用有机相进行替换平衡，最后用4.5％的水相平衡。
优选的，所述洗脱过程为，用比例为三氯甲烷∶甲醇∶水＝70∶28∶4.5的流动相冲洗、洗脱16个柱体积，结束洗脱主峰过程。
UniSil正相硅胶是粒径分别为10μm、孔径的表面带有硅羟基的正相色谱填料，该微球具有严格控制的粒径大小和孔径结构(见图1)，为单分散的、具有孔道结构的微球，使其作为色谱填料时具有很好的针对性。
本发明采用有机溶剂和超纯水作为流动相，用16个柱体积就可完成猪神经节苷脂主峰的洗脱，因此本过程所用流动相多可回收率用、成本较低，并且使用的流动相量相对较少，纯化周期较短。
本发明采用单分散的UniSil正相硅胶作为固定相，仅需一步层析即可使猪神经节苷脂纯度大于99％，收率大于93.0％。
因此，本发明方法选择、搭配合适的层析介质和流动相分离纯化猪神经节苷脂，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量可回收利用，大大降低成本。
附图说明
图1为实施例1使用的UniSil正相硅胶微球的的扫描电镜照片。
图2为实施例1提纯前的猪神经节苷脂粗提取物的高效液相色谱分析。
图3为实施例1纯化后的猪神经节苷脂的高效液相色谱分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
一种猪神经节苷脂的分离纯化方法，将猪神经节苷脂粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的猪神经节苷脂溶液上样到装有均粒正相硅胶的层析柱中进行层析；采用超纯水和有机溶剂作为流动相对猪神经节苷脂溶液进行等度洗脱；分段收集目的峰值的猪神经节苷脂溶液，对符合要求的组份液进行汇总。
优选的，所述有机溶剂为三氯甲烷和甲醇。
优选的，所述均粒正相硅胶的微球型号是UniSil正相硅胶。
优选的，上样前，对层析柱进行平衡，先用10％的水相进行除杂再生，后用有机相进行替换平衡，最后用4.5％的水相平衡。
优选的，所述等度洗脱过程为，用三氯甲烷：甲醇：水的混合液作为流动相冲洗、洗脱16个柱体积，结束洗脱主峰过程。
实施例1
取纯度为53.25％的猪神经节苷脂粗提取物，用三氯甲烷∶甲醇∶水＝70∶28∶4.5的流动相溶解粗品，溶液中猪神经节苷脂浓度为10mg/mL。待溶液澄清后，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，UniSil正相硅胶微球(苏州纳微科技有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。对层析柱进行柱前预处理，先用10％的水相进行除杂再生，后用有机相进行替换平衡，最后用4.5％的水相平衡。然后按照三氯甲烷∶甲醇∶水＝70∶28∶4.5的流动相进行等度洗脱，流速控制在1.5ml/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中猪神经节苷脂的纯度99.9％，收率95.3％。
图1为实施例1使用的UniSil正相硅胶微球的的扫描电镜照片，可见该微球粒径非常均一。
图2是提纯前的猪神经节苷脂粗提取物的高效液相色谱分析，可见有一定的杂质。
图3是提纯后的猪神经节苷脂高效液相色谱分析，可见杂质非常少。
实施例2
取纯度为54.24％的猪神经节苷脂粗提取物，以80％乙醇-盐溶液作为A相，100％乙醇作为B相。用100％乙醇溶解粗品，溶液中猪神经节苷脂浓度为5mg/mL。静置两天，取上清液用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，UniQ-30S作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。用B相进行平衡。设置0min-60min的100％B-0％B进行梯度洗脱，流速控制在1.0ml/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中猪神经节苷脂的纯度99.1％，收率30.2％。
实施例3
取纯度为53.21％的猪神经节苷脂粗提取物，以1.0‰磷酸-水溶液作为A相，100％乙腈作为B相。用50％乙腈溶解粗品，溶液中猪神经节苷脂浓度为2mg/mL。用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，UniPS 10-300作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。用2％B相进行平衡。0min-15min的2％B冲洗，15min-65min设置2％B-100％B梯度洗脱，流速控制在1.0ml/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中猪神经节苷脂杂质无法去除，实验结果较差。
实施例4
取纯度为53.68％的猪神经节苷脂粗提取物，以50％乙腈-水溶液作为A相，100％乙腈作为B相。用50％乙腈溶解粗品，溶液中猪神经节苷脂浓度为1mg/mL。用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用4.6×250mm的色谱柱，UniSil 10-120 C4反相硅胶作为层析柱填料，装柱体积为4.2ml。用A相进行平衡。0min-15min的100％A冲洗，15min-65min设置0％B-100％B梯度洗脱，流速控制在1.0ml/min，分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中猪神经节苷脂后杂无法去除，实验不理想。
本发明用于猪神经节苷脂的深度精纯，仅需一步层析纯化即可满足猪神经节苷脂纯度大于99％，收率大于93.0％的要求，纯化收率高而稳定。
本发明方法选择、搭配合适的层析介质和流动相分离纯化猪神经节苷脂，不仅纯度高、收率高且稳定，而且操作简单方便，所用固定相可重复利用，所用流动相量可回收利用，大大降低成本。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将猪神经节苷脂粗提取物进行溶解、过滤；将上述过滤后的猪神经节苷脂溶液上样到装有均粒正相硅胶的层析柱中进行层析；采用水和有机溶剂作为流动相对猪神经节苷脂溶液进行洗脱；分段收集目的峰值的猪神经节苷脂溶液，对符合要求的组份液进行汇总，得到纯化的猪神经节苷脂。
2.如权利要求1所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂为三氯甲烷和甲醇。
3.如权利要求1所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，所述均粒正相硅胶的微球型号是UniSil正相硅胶。
4.如权利要求1所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，上样前，对均粒正相硅胶层析柱进行平衡：先用10％的水相进行除杂再生，后用有机相进行替换平衡，最后用4.5％的水相平衡。
5.如权利要求1所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱过程为，用三氯甲烷：甲醇：水的混合液作为流动相冲洗、洗脱16个柱体积，结束洗脱主峰过程。
6.如权利要求1～5说任一所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，所述猪神经节苷脂粗提取物的纯度在53％以上。
7.如权利要求1～5任一所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化的猪神经节苷脂的纯度在99％以上。
8.如权利要求1～5任一所述的猪神经节苷脂的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化的猪神经节苷脂的收率在93.0％以上。
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Application publication date: 20190503 |