CN1814610A - 大批量高纯度神经节苷脂化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是以高等动物脑细胞为原料,加溶剂匀浆、分层。将神经节苷脂(Gangliosides)提取液,仅通过一次新型大孔树脂柱处理,即可达到有效分离、纯化、脱盐及浓缩制备高纯度神经节苷脂的目的,产品纯度可>98%。已知神经节苷脂化合物,具有广泛的生物活性,国外已有药厂生产神经节苷脂针剂用于临床,主要功能是治疗和改善受损伤的外周及中枢神经系统疾病。本发明首次使用新型大孔树脂,利用树脂的组成、结构特性,能去除有害物质,分离出有效成分并保持其生物活性。多年实践证明,本工艺属国内外首创,远比现行工艺先进,适于工业化生产。
Description
技术领域:
已知神经节苷脂类化合物(Gangliosides),具有非常重要的生物功能,约有40~50多种,哺乳动物鲜脑组织约有20种,其化学结构基本相同,几种主要成分,其差别仅是分子中所含唾液酸(Sialic acides)数目多少不同,另有大部分种类糖链的组成与连接位置有所不同。
由于这类化合物种类多、含量少、分子组成、结构、物理化学性质等因素十分相近,至今尚缺乏简便、高效、大批量制备高纯度神经节苷脂的新工艺。现列出四种主要神经节苷脂的分子结构图,请参考:
GANGLIOSIDES-STRUCTURE
Structures of the four major gangliosides of mammalian brain.
注:Gm1,Gd1a,Gd1b,Gt1b这4种化合物占神经节苷脂全成分的80~90%
本发明皆以猪鲜脑组织为原料,利用新型大孔树脂,建立了一套简便、有效、提取、分离、纯化,制备大批量高纯度神经节苷脂的生产工艺,并用此工艺制备的化合物,做成针剂进行了几项动物药理试验,以验证生物活性,并与进口产品做了纯度对比实验。
本发明不仅适用于神经节苷脂全成分制备,也适用于单一成分GM1的制备(但需要上柱前增加一步简单处理)。
背景技术:
神经节苷脂化合物早期阶段的提取、分离几乎都是使用1957年Folch等发明的分层技术[Folch et al.(1957)J.B.C.226,497-509],此方法一直沿用至今。此后虽不断有修正、改进,但在使用上,并没有大的改变。
直到1976年T.Momoi等[T.Momoi(1976)B.B.A.441,488-497]首次报道了使用DEAE-Sephadex A-25及多孔硅胶球Iatrobeads等,分离、纯化神经节苷脂的技术,明显提高了分离、纯化的效果。但此类工艺最大缺点是处理过程复杂、产率低、成本高。若进一步纯化,则需使用制备型TLC及相应的优质硅胶柱层析技术。
发明内容:
1980年起,我们开始总结各类制备神经节苷脂不同方法的优缺点,当时正兴起新型大孔树脂的科研,有多种试制的小量树脂样品,可供选择试用。我们根据不同型号树脂与被分离物的理化性质匹配程度,经多次筛选发现一种大孔树脂(暂时定名227号),在一定条件下,对神经节苷脂有很好的选择性分离纯化作用,最后确定使用227号树脂,用于神经节苷脂科研至今。
我们利用此技术,制备出数十克纯品,进行了多项生物活性试验,均取得良好结果(见:实审参考资料1,2,3),为成果鉴定会准备了条件。
1.实审参考资料1.中国科学院科学基金委员会1985年7月1日,科学基金工作简报。科研成果鉴定会评价“此项工艺属国内外首创”。
2.实审参考资料2.神经节苷脂薄层谱(1984.2),与进口针剂做了对比。
3.实审参考资料3.神经节苷脂对小鼠巨噬细胞的激活实验。
本发明适于大批量制备高纯度混和全成分,也适于单一成分。至今尚未见有更先进的相关文献和专利的报道;即仅通过一次新型大孔树脂柱处理,就能有效完成神经节苷脂的分离、纯化、脱盐、浓缩等过程,短时间内即可制备出大批量、高纯度产品。
本发明远比其它工艺先进,大部分有机溶剂尚可回收和套用,树脂容易再生,全过程污染小,产品成本低廉,非常适于工业化生产。
(混和纯品每克成本约150元,GM1每克约250元)
具体实施方式:
一.通过下述实例,可有助于理解本发明的基本内容:
(1)本发明是根据神经节苷脂的组成、结构与性质,选择粒度为30-300目、平均孔径为60-300的大孔树脂。
(2)实验处理过程温度为0-60℃,PH为1.5-6.5。
(3)实验材料加氯仿、甲醇(1∶1V/V或1∶2V/V),高速匀浆,调溶剂比例,加水分出上层,适当调节后直接通过大孔树脂柱,洗脱。
(4)洗脱液减压浓缩,即可达到分离、纯化的目的。
(5)经树脂柱一次处理,产品纯度与进口针剂纯度相当
[见:实审参考资料2.神经节苷脂薄层谱(1984年2月)]。
(6)每Kg猪鲜脑组织可提取1.2-1.5克全成分纯品,经TLC检测,与意大利进口针剂纯度相同。单一成分GM1可提取约0.8-1克,纯度与Sigma标准品相同。(神经节苷脂制品国外皆用牛脑,我们一直用猪脑为原料)。
二.本发明制备的产品活性检测实例(样品纯度皆>98%):
(1)对小鼠巨噬细胞有极显著的激活作用
[见:实审参考资料3]
(2)使用20只同批纯种莱亨母鸡,用有机磷神经毒剂TOCP中毒,待实验组鸡只两腿皆瘫痪后,随机分成两组,一组作对照,另一组注射神经节苷脂(20mg/只、天),共给药30天,一两个月后,已瘫痪的鸡只逐渐开始恢复,多数能站立、活动,并有几只产蛋,证明本发明提取的神经节苷脂,有显著缓解TOCP毒性的生物活性。
我们还为一些科研单位提供神经节苷脂针剂,用于兔坐骨神经搭桥(解放军301医院骨科)、狗脊髓半横切(天津医科大学总医院神经科),皆取得显著效果,并在成果鉴定会上作了报告。
Claims (4)
- 一种适于大批量、提取、分离、纯化,制备神经节苷脂(Gangliosides)的方法,其特征是:1.含神经节苷脂类化合物的匀浆提取液,或化学合成、化学修饰物的后期纯化,0-60℃静置,调PH1.5-6.5,调温度5-60℃,即可供大孔树脂柱上柱用。
- 2.根据权利要求1.所述,选择已纯化的大孔树脂,其特点是:树脂粒度为30-300目、平均孔径为60-300的树脂,装柱,供层析用。
- 3.根据权利要求1.和权利要求2.所述范围,可试选出分离、纯化的最佳匹配条件,进行树脂柱分离,即可达到分离纯化的目的。
- 4.根据权利要求3.无论含神经节苷脂混合成分,或单一成分样品的分离、纯化,上述要求皆适用。
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