CN1814610A

CN1814610A - 大批量高纯度神经节苷脂化合物的制备方法

Info

Publication number: CN1814610A
Application number: CN 200510013173
Authority: CN
Inventors: 商宗一
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-02-02
Filing date: 2005-02-02
Publication date: 2006-08-09

Abstract

本发明是以高等动物脑细胞为原料，加溶剂匀浆、分层。将神经节苷脂(Gangliosides)提取液，仅通过一次新型大孔树脂柱处理，即可达到有效分离、纯化、脱盐及浓缩制备高纯度神经节苷脂的目的，产品纯度可＞98％。已知神经节苷脂化合物，具有广泛的生物活性，国外已有药厂生产神经节苷脂针剂用于临床，主要功能是治疗和改善受损伤的外周及中枢神经系统疾病。本发明首次使用新型大孔树脂，利用树脂的组成、结构特性，能去除有害物质，分离出有效成分并保持其生物活性。多年实践证明，本工艺属国内外首创，远比现行工艺先进，适于工业化生产。

Description

大批量高纯度神经节苷脂化合物的制备方法

技术领域：

已知神经节苷脂类化合物(Gangliosides)，具有非常重要的生物功能，约有40～50多种，哺乳动物鲜脑组织约有20种，其化学结构基本相同，几种主要成分，其差别仅是分子中所含唾液酸(Sialic acides)数目多少不同，另有大部分种类糖链的组成与连接位置有所不同。

由于这类化合物种类多、含量少、分子组成、结构、物理化学性质等因素十分相近，至今尚缺乏简便、高效、大批量制备高纯度神经节苷脂的新工艺。现列出四种主要神经节苷脂的分子结构图，请参考：

GANGLIOSIDES-STRUCTURE

G_M1：I，II，III，IV，AG_D1a：I，II，III，IV，A，BG_D1b：I，II，III，IV，A，CG_T1b：I，II，III，IV，A，B，C

Structures of the four major gangliosides of mammalian brain.

注：Gm1，Gd1a，Gd1b，Gt1b这4种化合物占神经节苷脂全成分的80～90％

本发明皆以猪鲜脑组织为原料，利用新型大孔树脂，建立了一套简便、有效、提取、分离、纯化，制备大批量高纯度神经节苷脂的生产工艺，并用此工艺制备的化合物，做成针剂进行了几项动物药理试验，以验证生物活性，并与进口产品做了纯度对比实验。

本发明不仅适用于神经节苷脂全成分制备，也适用于单一成分GM1的制备(但需要上柱前增加一步简单处理)。

背景技术：

神经节苷脂化合物早期阶段的提取、分离几乎都是使用1957年Folch等发明的分层技术[Folch et al.(1957)J.B.C.226，497-509]，此方法一直沿用至今。此后虽不断有修正、改进，但在使用上，并没有大的改变。

直到1976年T.Momoi等[T.Momoi(1976)B.B.A.441，488-497]首次报道了使用DEAE-Sephadex A-25及多孔硅胶球Iatrobeads等，分离、纯化神经节苷脂的技术，明显提高了分离、纯化的效果。但此类工艺最大缺点是处理过程复杂、产率低、成本高。若进一步纯化，则需使用制备型TLC及相应的优质硅胶柱层析技术。

发明内容：

1980年起，我们开始总结各类制备神经节苷脂不同方法的优缺点，当时正兴起新型大孔树脂的科研，有多种试制的小量树脂样品，可供选择试用。我们根据不同型号树脂与被分离物的理化性质匹配程度，经多次筛选发现一种大孔树脂(暂时定名227号)，在一定条件下，对神经节苷脂有很好的选择性分离纯化作用，最后确定使用227号树脂，用于神经节苷脂科研至今。

我们利用此技术，制备出数十克纯品，进行了多项生物活性试验，均取得良好结果(见：实审参考资料1，2，3)，为成果鉴定会准备了条件。

1.实审参考资料1.中国科学院科学基金委员会1985年7月1日，科学基金工作简报。科研成果鉴定会评价“此项工艺属国内外首创”。

2.实审参考资料2.神经节苷脂薄层谱(1984.2)，与进口针剂做了对比。

3.实审参考资料3.神经节苷脂对小鼠巨噬细胞的激活实验。

本发明适于大批量制备高纯度混和全成分，也适于单一成分。至今尚未见有更先进的相关文献和专利的报道；即仅通过一次新型大孔树脂柱处理，就能有效完成神经节苷脂的分离、纯化、脱盐、浓缩等过程，短时间内即可制备出大批量、高纯度产品。

本发明远比其它工艺先进，大部分有机溶剂尚可回收和套用，树脂容易再生，全过程污染小，产品成本低廉，非常适于工业化生产。

(混和纯品每克成本约150元，GM1每克约250元)

具体实施方式：

一.通过下述实例，可有助于理解本发明的基本内容：

(1)本发明是根据神经节苷脂的组成、结构与性质，选择粒度为30-300目、平均孔径为60-300的大孔树脂。

(2)实验处理过程温度为0-60℃，PH为1.5-6.5。

(3)实验材料加氯仿、甲醇(1∶1V/V或1∶2V/V)，高速匀浆，调溶剂比例，加水分出上层，适当调节后直接通过大孔树脂柱，洗脱。

(4)洗脱液减压浓缩，即可达到分离、纯化的目的。

(5)经树脂柱一次处理，产品纯度与进口针剂纯度相当

[见：实审参考资料2.神经节苷脂薄层谱(1984年2月)]。

(6)每Kg猪鲜脑组织可提取1.2-1.5克全成分纯品，经TLC检测，与意大利进口针剂纯度相同。单一成分GM1可提取约0.8-1克，纯度与Sigma标准品相同。(神经节苷脂制品国外皆用牛脑，我们一直用猪脑为原料)。

二.本发明制备的产品活性检测实例(样品纯度皆＞98％)：

(1)对小鼠巨噬细胞有极显著的激活作用

[见：实审参考资料3]

(2)使用20只同批纯种莱亨母鸡，用有机磷神经毒剂TOCP中毒，待实验组鸡只两腿皆瘫痪后，随机分成两组，一组作对照，另一组注射神经节苷脂(20mg/只、天)，共给药30天，一两个月后，已瘫痪的鸡只逐渐开始恢复，多数能站立、活动，并有几只产蛋，证明本发明提取的神经节苷脂，有显著缓解TOCP毒性的生物活性。

我们还为一些科研单位提供神经节苷脂针剂，用于兔坐骨神经搭桥(解放军301医院骨科)、狗脊髓半横切(天津医科大学总医院神经科)，皆取得显著效果，并在成果鉴定会上作了报告。

Claims

一种适于大批量、提取、分离、纯化，制备神经节苷脂(Gangliosides)的方法，其特征是：

1.含神经节苷脂类化合物的匀浆提取液，或化学合成、化学修饰物的后期纯化，0-60℃静置，调PH1.5-6.5，调温度5-60℃，即可供大孔树脂柱上柱用。
2.根据权利要求1.所述，选择已纯化的大孔树脂，其特点是：树脂粒度为30-300目、平均孔径为60-300的树脂，装柱，供层析用。
3.根据权利要求1.和权利要求2.所述范围，可试选出分离、纯化的最佳匹配条件，进行树脂柱分离，即可达到分离纯化的目的。
4.根据权利要求3.无论含神经节苷脂混合成分，或单一成分样品的分离、纯化，上述要求皆适用。