CN101838295B - 一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，该工艺包括静态吸附、洗脱和浓缩干燥三步骤。静态吸附：动物脑组织加提取液，匀浆，离心，分层；分层后的上清液直接加入具有特异识别功能的色谱介质，搅拌吸附1-2小时，使具有特异识别功能的色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合；洗脱：将吸附了神经节苷脂的具有特异识别功能的色谱介质，直接加入到洗脱液中搅拌洗脱1-2小时；浓缩干燥：将洗脱液浓缩，并在-70°-20°的环境下冷冻干燥，可获得神经节苷脂产品。该发明采用静态吸附与洗脱的方法，使色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少了提取过程中神经节苷脂的丢失，与目前沿用的大孔树脂层析法相比可提高产率15-20％；缩短了分离纯化时间10-38倍，该法操作简单，有利于工业化生产。

Description

一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺

(一)技术领域

本发明涉及一种具有生物活性神经节苷脂的工业化生产工艺，具体地说是一种具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂工业化生产工艺。

(二)技术背景

神经节苷脂类化合物(Gangliosides)，具有非常重要的生物功能，它是一种分子量小的糖脂类复合物貭，能穿过血脑屏障进入大脑，镶嵌在受损的神经细胞膜上，修复受损的神经。它是当今国际公认的可以直接作用于人脑细胞，即神经系统的营养和生长因子，可以治疗神经损伤、促进神经再生，对不同时期、不同原因、不同程度的神经损伤、退化、衰老均有修复作用。具有四大医学功能：促进神经细胞及大脑组织的正常发育，防治脑瘫等疾病，修复损伤神经及大脑组织，防治中风等疾病；增强大脑的学习记忆功能，消除头昏头痛等症状；延缓神经细胞的衰老、防治老年痴呆等疾病。研究证明哺育动物脑组织中含量较多，约有20-50多种，其化学结构基本相同，几种主要成分，其差别仅是分子中所含唾液酸数目多少不同或糖链的组成与连接位置有所不同。它具有广泛的适应症，与神经生长因子等药物相比，是目前唯一的能通过血脑屏障进入大脑，并有确切疗效一种物质。

科学研究的发展，基因工程方法已取代了干扰素、白介素、胰岛素等的制备，但由于神经节苷这类化合物种类多、含量少，分子组成结构十分复杂，多变，物理化学性质等因素十分相近，基因工程和生物模拟合成均难以引用实现。目前只能依赖生物提取方法获得。国内外许多实验室在提取、分离、纯化神经节苷脂方面进行了大量探索。1942年，美国科学家发现在哺育动物的神经细胞膜中存在神经节苷脂；60年代日本科学家发现哺育动物大脑中神经节苷脂含量最高；70年代，美、加、意等多国科学家先后发明了神经节苷脂的化学提取方法，但一直沿用1957年Folch等发明的分层技术1976年T.Momoi等[T.Momoi(1976)B.B.A.441，488-497]首次报道了使用DEAE-Seeeephadex A-25及多空球latrobeads，1985年和2006年天津南开大学报道了关于大孔树脂分离纯化神经节苷脂技术。95年我国开始科研突破，成为世界上第三个有能力提取节苷脂的国家。但目前该研究领域中，现有的分离纯化方法一直沿用硅胶、大孔树脂柱层析法。其一：柱层析需要顺冲、反冲，有时因柱堵塞而需要掏树脂等，多有操作步骤繁琐、工艺复杂、处理周期长，不宜大量制备等缺点，不适合产业化生产。其二：柱层析致使色谱介质与提取液不能充分的混合，且目前所采用的硅胶树脂对目标分子不具有特异的选择功能，多有产率低、成本高。到目前为止未发现简便、高效、大批量制备高纯度神经节苷脂新的分离纯化方法和工艺。目前神经系统疾病的发病率很高且往往缺乏有效的治疗措施，像神经节苷脂疗效确切，副作用小的新药具有广泛的市场需求，急待研究开发。

(三)发明内容

本发明的技术任务是针对现有技术的不足，提供一种利用具有特异功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明根据神经节苷脂的分子结构的特点(既溶于水又溶入脂肪溶剂，即具有两性性质。)和分子印迹理论，及麦饭石可以吸附阳离子，壳聚糖在酸性溶液中带有正电荷可以吸附阴离子等特性，研制了对神经节苷脂具有特异识别功能的色谱介质。该色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，采用静态吸附与洗脱的方法，建立了分离纯化神经节苷脂的一种新的生产工艺，得到了很好的分离效果，分离纯化获得的神经节苷脂，经高压液相色谱测定结果表明，与进口针剂相比基本一致。

一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，该工艺包括静态吸附、洗脱和浓缩干燥三步骤：

1)静态吸附：动物脑组织加提取液，匀浆，离心，分层；分层后的上清液直接加入具有特异识别功能的色谱介质，搅拌吸附1-2小时，使具有特异识别功能的色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少提取过程中神经节苷脂的丢失。

2)洗脱：将吸附了神经节苷脂的具有特异识别功能的色谱介质，直接加入到洗脱液中搅拌洗脱1-2小时。

3)浓缩干燥：将洗脱液浓缩，并在-70°--20°的环境下冷冻干燥，可获得神经节苷脂产品。

上述动物脑组织和提取液的质量百分比为1∶10-15。

上述提取液为氯仿和甲醇按1-5∶2-8的比例混合而成。

上述洗脱液为氯仿和甲醇按3-5∶1-3的比例混合而成。

上述动物脑组织为哺乳动物的鲜脑组织，哺乳动物优选猪、牛、羊。

整个提取过程的溶液PH值在1.0-6.0之间。

具有特异识别功能的色谱介质的研制包括对麦饭石的预处理和特异识别功能的色谱介质的制备：

1)对麦饭石预处理：将粒度为20-60目的麦饭石加入到0.5-2.5mol/L盐酸中，麦饭石与盐酸溶液的质量比为1∶10-15；浸泡时间为20-38小时；浸泡完毕后用蒸馏水将麦饭石洗至中性，烘干备用。

2)特异识别功能的色谱介质的制备：先将乙酰度为90％-60％的壳聚糖加入到浓度为1-8％的醋酸溶液之中，配制成浓度为0.1％-0.5％的壳聚糖溶液60-180ml；再将已经处理好的20-80g的麦饭石加入到壳聚糖溶液中调成糊状，最后将此糊状混合物加热干燥，研细过90-120目筛，即得具有特异识别功能的色谱介质。

本发明的一种利用具有特异功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺与现有技术相比，所产生的有益效果是：

1)该发明改变了人们在节苷脂的分离纯化过程中一直沿用的柱层析法。省去了柱层析，需要顺冲、反冲，有时因柱堵塞而需要掏树脂等繁杂步骤，缩短了分离纯化周期，确保了节苷脂的纯度，提高了产率，本法操作简单，适用于工业化生产。

2)该发明采用静态吸附与洗脱的方法，使色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少了提取过程中神经节苷脂的丢失，与目前沿用的大孔树脂层析法相比可提高产率15-20％；缩短了分离纯化时间10-38倍。

(四)附图说明

附图1为常见神经节苷脂的结构。

附图2为神经节苷脂的分子结构。

附图3为标准品的神经节苷脂高效液相色谱图。

附图4为实施例1的神经节苷脂高效液相色谱图。

附图5为实施例2的神经节苷脂高效液相色谱图。

附图6为实施例3的神经节苷脂高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面分别以猪、牛、羊三种哺乳动物的的鲜脑组织为例来具体说明本发明。三个实施例仅仅是对本发明的举例说明，并不限定本发明，凡是以哺乳动物的鲜脑组织加之本发明的提取工艺，都应在本发明的保护范围之内。

实施例1：以猪鲜脑组织为例进行说明。

1)特异识别功能的色谱介质的研制：

麦饭石的预处理：将粒度为20-60目的麦饭石加入到1mol/L盐酸中，麦饭石与盐酸溶液的质量比为1∶12；浸泡时间为30小时；除去有机物等杂质，浸泡完毕后用蒸馏水将麦饭石洗至中性，烘干备用；

特异识别功能的色谱介质的制备：先将乙酰度为75％的壳聚糖加入到浓度为6％的醋酸溶液之中，配制成浓度为0.3％的壳聚糖溶液60ml；再将已经处理好的20g的麦饭石加入到壳聚糖溶液中调成糊状，使之充分浸润，将此糊状置于微波炉中，加热干燥，研细过100目筛，即得具有特异识别功能的色谱介质。

猪的鲜脑组织加提取液(氯仿和甲醇按3∶6的比例混合)，按质量比1∶10的比例匀浆，离心，分层；分层后的上清液直接加入具有特异识别功能的色谱介质，搅拌吸附1.5小时，使具有特异识别功能的色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少提取过程中神经节苷脂的丢失。

将吸附了神经节苷脂的具有特异识别功能的色谱介质，直接加入到洗脱液(氯仿和甲醇按4∶2)的比例混合中搅拌洗脱1.5小时。

合并洗脱液，并在-45°的环境下冷冻干燥，可获得神经节苷脂产品。

整个提取过程调PH1.0-6.0。

获得的产品，纯度与进口针剂纯度相当。

每千克猪鲜脑组织可提取单一成分神经节苷脂1.2-1.5克，从色谱图可以看出纯度与标准品相同，与进口针剂纯度相同。

实施例2：以牛鲜脑组织为例进行说明。

1)特异识别功能的色谱介质的研制：

麦饭石的预处理：将粒度为20-60目的麦饭石加入到2.5mol/L盐酸中，麦饭石与盐酸溶液的质量比为1∶15；浸泡时间为38小时；除去有机物等杂质，浸泡完毕后用蒸馏水将麦饭石洗至中性，烘干备用；

特异识别功能的色谱介质的制备：先将乙酰度为90％的壳聚糖加入到浓度为8％的醋酸溶液之中，配制成浓度为0.5％的壳聚糖溶液120ml；再将已经处理好的50g的麦饭石加入到壳聚糖溶液中调成糊状，之充分浸润，将此糊状置于微波炉中，加热干燥，研细过120目筛，即得具有特异识别功能的色谱介质。

牛的鲜脑组织加提取液(氯仿和甲醇按5∶8的比例混合)，按质量比1∶13的比例匀浆，离心，分层；分层后的上清液直接加入具有特异识别功能的色谱介质，搅拌吸附2小时，使具有特异识别功能的色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少提取过程中神经节苷脂的丢失。

将吸附了神经节苷脂的具有特异识别功能的色谱介质，直接加入到洗脱液(氯仿和甲醇按5∶3)的比例混合中搅拌洗脱2小时。

合并洗脱液，并在-70°的环境下冷冻干燥，可获得神经节苷脂产品。

整个提取过程调PH1.0-6.0。

获得的产品，纯度与进口针剂纯度相当。

每千克牛脑组织可提取神经节苷脂单一成分1.4-1.8克.纯度与标准品相同.与进口针剂纯度相同。

实施例3：以羊鲜脑组织为例进行说明。

1)特异识别功能的色谱介质的研制：

麦饭石的预处理：将粒度为20-60目的麦饭石加入到0.5mol/L盐酸中，麦饭石与盐酸溶液的质量比为1∶10；浸泡时间为20小时；除去有机物等杂质，浸泡完毕后用蒸馏水将麦饭石洗至中性，烘干备用；

特异识别功能的色谱介质的制备：先将乙酰度为60％的壳聚糖加入到浓度为1％的醋酸溶液之中，配制成浓度为0.1％的壳聚糖溶液180ml；再将已经处理好的80g的麦饭石加入到壳聚糖溶液中调成糊状，之充分浸润，将此糊状置于微波炉中，加热干燥，研细过90目筛，即得具有特异识别功能的色谱介质。

羊的鲜脑组织加提取液(氯仿和甲醇按1∶2的比例混合)，按质量比1∶15的比例匀浆，离心，分层；分层后的上清液直接加入具有特异识别功能的色谱介质，搅拌吸附1小时，使具有特异识别功能的色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少提取过程中神经节苷脂的丢失。

将吸附了神经节苷脂的具有特异识别功能的色谱介质，直接加入到洗脱液(氯仿和甲醇按3∶1)的比例混合中搅拌洗脱1小时。

合并洗脱液，并在-20°的环境下冷冻干燥，可获得神经节苷脂产品。

整个提取过程调PH1.0-6.0。

获得的产品，纯度与进口针剂纯度相当。

每千克羊脑组织可提取神经节苷脂单一成分1.0-1.2克.纯度与标准品相同.与进口针剂纯度相同。

Claims (6)

1.一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，其特征在于：该工艺包括静态吸附、洗脱和浓缩干燥三步骤： 

1)静态吸附：动物脑组织加提取液，匀浆，离心，分层；分层后的上清液直接加入具有特异识别功能的色谱介质，搅拌吸附1-2小时，使具有特异识别功能的色谱介质与提取液进行充分的搅拌与混合，尽量减少提取过程中神经节苷脂的丢失； 

2)洗脱：将吸附了神经节苷脂的具有特异识别功能的色谱介质，直接加入到洗脱液中搅拌洗脱1-2小时； 

3)浓缩干燥：将洗脱液浓缩，并在-70°—-20°的环境下冷冻干燥，可获得神经节苷脂产品； 

上述洗脱液为氯仿和甲醇按3-5∶1-3的比例混合而成； 

上述具有特异识别功能的色谱介质，其研制包括对麦饭石的预处理和特异识别功能的色谱介质的制备： 

1)对麦饭石预处理：将粒度为20-60目的麦饭石加入到0.5-2.5mol/L盐酸中，麦饭石与盐酸溶液的质量比为1∶10-15；浸泡时间为20-38小时；浸泡完毕后用蒸馏水将麦饭石洗至中性，烘干备用； 

2)特异识别功能的色谱介质的制备：先将乙醇度为90％-60％的壳聚糖加入到浓度为1-8％的醋酸溶液中，配制成中浓度为0.1％-0.5％的壳聚糖溶液60-180ml；再将已经处理好的20-80g麦饭石加入到壳聚糖溶液中调成糊状，最后将此糊状混合物加热干燥，研细过90-120目筛，即得到具有特异识别功能的色谱介质。 

2.根据权利要求1所述的一种利用具有特异识别功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，其特征在于，上述动物脑组织和提取液的质量百分比为1∶10-15。 

3.根据权利要求1所述的一种利用具有特异功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，其特征在于，上述提取液为氯仿和甲醇按1-5∶2-8 的比例混合而成。 

4.根据权利要求1所述的一种利用具有特异功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，其特征在于，动物脑组织为哺乳动物的鲜脑组织。 

5.根据权利要求4所述的一种利用具有特异功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，其特征在于，哺乳动物为猪、牛、羊。 

6.根据权利要求1所述的一种利用具有特异功能色谱介质快速分离纯化神经节苷脂的工业化生产工艺，其特征在于，整个提取过程的溶液PH值在1.0-6.0之间。