CN101177439B - 千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备 - Google Patents
千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明以新鲜猪脑组织为原料，利用大型提取罐、大孔吸附树脂、DEAE SephadexA-25和硅胶层析构建了-套提取分离纯化千克级规模高纯度GM1的生产工艺。本发明摒弃传统方法流动相中有毒溶剂氯仿的使用，全套工艺污染少，工艺简单，产品成本低，适合工业化生产。
Description
所属技术领域
本发明涉及千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的制备方法，属于生物医药领域。
背景技术
神经节苷脂(Gangliosides，GLS)是一类含唾液酸的酸性糖脂，为哺乳动物细胞膜的重要成分，其在脑组织中含量最高。神经节苷脂的组成十分复杂，不同的神经节苷脂所含的糖基的唾液酸的数目和连接方式不同，可用G代表神经节苷脂，M、D、T分别代表单、二、三唾液酸基，下标数字1、2、3分别代表四糖基、三糖基、二糖基神经酰胺，GM1就表示由单个唾液酸基和四糖基神经酰胺连接而成的神经节苷脂。研究表明，具有显著生物学功能的神经节苷脂是连接有单个唾液酸的GM1，具有促进神经重构(神经重塑，神经可塑性，Neuroplasticity)的作用，即通过促进各种形态、生化、组化、神经生理及行为参数的改善，最终可以加速神经修复，最大程度地恢复原有的神经功能，其对血管性或外伤性中枢神经系统损伤和帕金森治病有疗效。目前神经系统疾病的发病率很高且往往缺乏有效的治疗措施，象GM1等疗效确切、副作用小的新药具有广泛的市场需求，亟待研究开发并产业化。
1957年Folch等发明了分层技术从哺乳动物组织中提取分离神经节苷脂，但此方法获得的神经节苷脂成分复杂并且纯度低，其中提取的神经节苷脂中含有大量色素、磷脂、硫脂等其他脂类成分，无法应用于药品的制备。1976年Momoi.T等使用阴离子交换介质DEAE sephadex A-25和硅胶分离纯化神经节苷脂，使分离效率和产品纯度大大提高，他们首先将猪脑或牛脑绞碎后用丙酮脱水制成丙酮粉，再用氯仿-甲醇-水的混合溶液进行提取，使得率达到了14％，但还是得率低无法用于大规模生产。
CN1353112公开了单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺，他们用有机溶剂混合物从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷脂，然后对提取液进行浓缩、酸水解、脱盐、交换柱层析，洗脱液层析后再进行反相柱层析，最终得成品。虽然根据此工艺可以得到纯度大于98％的GM1，然而工艺流程繁琐，耗费时间长，生产一批所需的时间长达6天，工业化生产成本太高，且提取纯化过程中应用了有毒溶剂氯仿，从而使药品的副作用增加。
CN1415756与CN1570080均公开了一种微尘物转化方法制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，虽然有效利用并节省了动物脑组织，但工艺程序复杂，在发酵工艺中菌种条件要求苛刻，容易受到染菌，且成本在每克500元以上，工业化生产成本偏高。
由于GM1结构的复杂性和多变性，以及其它技术难题没有得到解决，利用人工合成或基因工程方法制备GM1的方法在短期内难以应用。因此，目前获取GM1的普遍方法是从动物脑组织中提取分离。然而，神经节苷脂种类多，在脑组织中含量少，特别是其分子组成、结构物理化学性质等因素十分相近，所以高纯度GM1的提取分离又一定难度，特别是大规模工业化提取工艺还未见有报道和应用。到目前为止，国内关于GM1提取分离的研究大多还处于实验室规模和水平，还未得到有效应用，采用的工艺主要有Momoi.T方法和利用微生物转化的方法，但成本太高，难以大规模应用于临床。国内还没有单一成分GLS如GM1的批量生产方法和工艺，现有的分离纯化方法多有操作步骤繁琐、工艺复杂、周期长、不宜大量制备等缺点。
发明内容
GM1价格昂贵的原因在于应用现有的技术工艺制备产量少，工艺复杂，如果采用易于获得的原料，对提取过程的几个关键步骤进行改良，使生产工艺适合大量制备以及产业化生产，或发展出新的先进分离纯化技术，则其成本将大大降低。本发明人为了达到上述目的，通过对现有的GM1提取纯化工艺进行研究，通过大量实验对现有技术不断改进，提出了本发明的技术方案。
本发明以新鲜猪脑组织为原料，利用大型提取罐、大孔吸附树脂、DEAESephadex A-25和硅胶层析构建了一套提取分离纯化千克级规模高纯度GM1的生产工艺。本发明选用新鲜猪脑组织经粉碎和高速匀浆，注入提取罐并加入甲醇水混合液搅拌提取，经板框过滤分离甲醇水层经大孔吸附树脂分离神经节苷总脂；通过水解神经节苷总脂提高GM1含量30％，再经DEAE Sephadex A-2 5和硅胶层析过的纯度高于98％GM1。
通过大量的实验对提取纯化工艺进行优化，本发明的制备工艺包括如下步骤：
1) 将新鲜猪脑组织经4000～6000rpm离心除游离水后，胶体磨粉碎，3000r/min高速匀浆20～40min，成乳胶状后，注入提取罐中并加入10倍体积的甲醇水(2∶0.8～2∶1/V∶V)溶液，低温2～8℃下搅拌过夜(12～24小时)，提取；
2) 将提取液用板框过滤机实现固液分离后并上样大孔吸附树脂D-101层析柱，先用低浓度甲醇水(1∶2～1∶3/V∶V)洗除杂质，再用无水甲醇洗脱收集含有神经节苷脂洗脱液；
3) 将神经节苷脂洗脱液40℃～80℃真空浓缩并经-20℃～-60℃冷冻干燥后，用0.5M NaCl溶液溶解并用冰乙酸调节PH至3.5～4.0之间，60～75℃水解3～5小时；
4) 水解后用氢氧化钠溶液先将PH调至中性，再用1.5～2.5倍体积的预冷丙酮在-20℃～-10℃下过夜静置沉淀。离心分离沉淀后40℃～80℃真空浓缩并经-20℃～-60℃冷冻干燥并上样阴离子交换层析柱DEAE Sephadex A-25，用甲醇水流动相A(4∶1～4∶1.25/V∶V)去除杂质后，再用甲醇/乙酸钠流动相B(0.1M)洗脱并收集洗脱液；
5) 真空浓缩洗脱液后上样硅胶层析柱(填充物为60-80目和80-120目层析用硅胶各半)，用甲醇/乙酸钠(0.015M)流动相分步收集流出液，用HPLC检测GM1的纯度；
6) 将收集的高纯度GM1溶液40℃～80℃真空浓缩后用于预冷的丙酮在-20℃～-10℃下沉淀过夜，经8000rpm离心后收集沉淀，经-20℃～-60℃冷冻干燥后即为高纯度GM1冻干粉。
上述所有步骤中涉及的真空浓缩温度进一步优选为55℃～75℃，冷冻干燥温度进一步优选为-40℃～-50℃。
本发明与现有技术相比有如下的明显优点和技术进步：
(1)在有机溶剂提取方法的基础上进行了改进，摒弃传统方法流动相中有毒溶剂氯仿的使用，全套工艺污染少，药品中的主药成分含量高，副作用小。
(2)对层析分离和纯化步骤中流动相的比例进行了优化，提高了产品的得率和生产效率。
(3)整个工艺简单，甲醇可以回收或套用，产品成本低，实际生产中每克GM1纯品的成本约为160元。
(4)本发明适用于大批量制备高纯度GM1，至今尚未见有更先进的相关文献和专利报道，即通过五个步骤获得千克级高纯度(＞98％)GM1产品，步骤流程少，通过一次性处理大量动物组织，纯化时上样量大，可以进行千克级规模化生产。
具体实施方式
通过如下实施例，可以具体了解本发明的基本内容，但本发明的技术方案并不限于以下实施例。
实施例1 高纯度GM1冻干粉的制备
1)将新鲜猪脑组织经5000rpm离心去除游离水，用胶体磨粉碎后3000r/min高速匀浆30min，成乳胶状后，注入提取罐中并加入10倍体积的甲醇水(2∶0.8)溶液，低温2℃搅拌12小时，提取；
2)将提取液用板框过滤机实现固液分离后上样大孔吸附树脂D-101层析柱，先用低浓度甲醇水(1∶2)洗除杂质，再用无水甲醇洗脱收集含有神经节苷脂洗脱液；
3)将神经节苷脂洗脱液40℃真空浓缩并经-20℃冷冻干燥后，用0.5M NaCl溶液溶解并用冰乙酸调节PH至3.5，60℃水解3小时，在水解的过程中不断用薄层色谱(TLC)检测检测水解程度；水解后用氢氧化钠溶液先将PH调至中性，再用1.5倍体积的预冷丙酮-20℃过夜静置沉淀。其中，TLC的条件是样品3μl点样，在氯仿/甲醇/0.2％CaCl2(55∶45∶10，V/V/V)中展开，用0.2％间苯二酚/25％HCl/0.1M CuSO4(10∶80∶0.25，V/V/V)溶液显色，然后100℃烘烤20～30min；
4)离心分离沉淀后40℃真空浓缩并经-20℃冷冻干燥并上样阴离子交换层析柱(DEAE-Sephadex A-25)，用甲醇水流动相A(4∶1)去除杂质后，再用甲醇/乙酸钠流动相B(0.1M)洗脱并收集洗脱液；
5)真空浓缩洗脱液后上样硅胶层析住(60-80目和80-120目层析用硅胶各半)，用甲醇/乙酸钠(0.015M)流动相分步收集流出液，用HPLC检测GM1的纯度；
6)将收集的高纯度GM1溶液40℃真空浓缩后用于预冷的丙酮-20℃沉淀过夜，经8000rpm离心后收集沉淀-20℃冷冻干燥即为高纯度GM1冻干粉。
实施例2 高纯度GM1冻干粉的制备
1)将新鲜猪脑组织经5000rpm离心去除游离水，用胶体磨粉碎后3000r/min高速匀浆30min，成乳胶状后，注入提取罐中并加入10倍体积的甲醇水(2∶1)溶液，低温8℃搅拌24小时，提取；
2)将提取液用板框过滤机实现固液分离后上样大孔吸附树脂D-101层析柱，先用低浓度甲醇水(1∶3)洗除杂质，再用无水甲醇洗脱收集含有神经节苷脂洗脱液；
3)将神经节苷脂洗脱液80℃真空浓缩并经-60℃冷冻干燥后，用0.5M NaCl溶液溶解并用冰乙酸调节PH至4.0，75℃水解5小时，在水解的过程中不断用薄层色谱(TLC)检测水解程度；水解后用氢氧化钠溶液先将PH调至中性，再用2.5倍体积的预冷丙酮-10℃过夜静置沉淀。其中，TLC的条件是样品3μl点样，在氯仿/甲醇/0.2％CaCl2(55∶45∶10，V/V/V)中展开，用0.2％间苯二酚/25％HCl/0.1 M CuSO4(10∶80∶0.25，V/V/V)溶液显色，然后100℃烘烤20～30min；
4)离心分离沉淀后80℃真空浓缩并经-60℃冷冻干燥并上样阴离子交换层析柱(DEAE-Sephadex A-25)，用甲醇水流动相A(4∶1.25)去除杂质后，再用甲醇/乙酸钠流动相B(0.1M)洗脱并收集洗脱液；
5)真空浓缩洗脱液后上样硅胶层析住(60-80目和80-120目层析用硅胶各半)，用甲醇/乙酸钠(0.015M)流动相分步收集流出液，用HPLC检测GM1的纯度；
6)将收集的高纯度GM1溶液80℃真空浓缩后用于预冷的丙酮-10℃沉淀过夜，经8000rpm离心后收集沉淀-60℃冷冻干燥即为高纯度GM1冻干粉。
附图说明：
图1：实施例1制备的GM1的HPLC检测图谱。HPLC层析柱为Lichrospher 100 NH2(250×4mm，5um)，流动相为乙氰-0.2M磷酸-四氢呋喃(25∶75∶5)，流速为1.0ml/min，检测器为UV205nm，进样量为每次20ul，在此条件下检测GM1冻干粉的纯度为98.367％。(表1)
表1GM1与杂质的保留时间、峰面积、峰高、峰宽
| Time | Area | Height | Wideth | Area％ | |
| GM1 | 13.188 | 13857.7 | 212.9 | 0.9748 | 98.367 |
| 杂质峰 | 19.513 | 230 | 7.9 | 0.4142 | 1.633 |
图2：实施例2制备的GM1的HPLC图。HPLC层析柱为Lichrospher 100 NH2(250×4mm，5um)，流动相为乙氰-0.2M磷酸-四氢呋喃(25∶75∶5)，流速为1.0ml/min，检测器为UV205nm，进样量为每次20ul，在此条件下检测GM1冻干粉的纯度为98.277％。(表2)
表2 GM1与杂质的保留时间、峰面积、峰高、峰宽
| # | Time | Area | Height | Wideth | Area％ |
| GM1 | 13.221 | 13439.9 | 206.5 | 0.9545 | 98.277 |
| 杂质峰 | 19.580 | 235.6 | 8.4 | 0.4241 | 1.723 |
Claims (13)
1.一种制备千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于包括如下步骤：
a.将新鲜猪脑组织除游离水后粉碎高速匀浆，注入提取罐中并加入10倍体积的甲醇水溶液，低温2～8℃搅拌，提取；
b.将提取液过滤并上样大孔吸附树脂层析柱，先用甲醇水溶液洗除杂质，再用无水甲醇洗脱收集洗脱液；
c.将洗脱液真空浓缩并经冷冻干燥后，用0.5M NaCl溶液溶解并用冰乙酸调节PH至3.5～4.0之间，60～75℃水解3～5小时，水解后用氢氧化钠溶液将PH调至中性，再用1.5～2.5倍体积的预冷丙酮低温过夜静置沉淀；
d.离心分离沉淀后真空浓缩、冷冻干燥并上样阴离子交换层析柱，用甲醇水流动相A去除杂质后，再用0.1M甲醇/乙酸钠流动相B洗脱并收集洗脱液；
e.真空浓缩洗脱液后上样硅胶层析柱，用0.015M甲醇/乙酸钠流动相收集流出液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为2∶0.8～2∶1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1∶2～1∶3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d所述的甲醇水流动相A中甲醇与水的体积比为4∶1～4∶1.25。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a所述的粉碎匀浆的条件为胶体磨粉碎，3000r/min高速匀浆30min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a所述的低温4℃下搅拌时间为12～24小时。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b所述的提取液过滤条件为板框过滤机过滤。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b所述的大孔吸附树脂层析柱为大孔吸附树脂D-101层析柱。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c、d、e所述的真空浓缩温度为40℃～80℃，冷冻干燥温度为-20℃～-60℃。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c、d、e所述的真空浓缩温度为55℃～75℃，冷冻干燥温度为-40℃～-50℃。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c所述的预冷丙酮温度在-20℃～-10℃。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d所述的阴离子交换层析柱为DEAE SephadexA-25。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e所述的硅胶层析柱中填充物为比例各占一半的60-80目和80-120目层析用硅胶。
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