CN109651458A - 高效水解转化制备神经节苷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高效水解转化制备神经节苷脂的方法,包括如下步骤:猪脑粗提物提取,猪脑粗提物硅胶层析纯化,水解转化,GM1粗品硅胶层析纯化;总神经节苷脂硅胶纯化分离出大部分GM1,分离得到的GM1粗品I含量在80%以上,其他神经节苷脂部分再进行水解,转化率大幅度提高。
Description
技术领域
本发明属于神经节苷脂制备技术领域,具体涉及高效水解转化制备神经节苷脂的方法。
背景技术
GM1(单唾液酸四己糖神经节苷脂钠)是一种安全有效的神经保护和修复药物,对中风、脑瘫、帕金森综合症等都有明显的疗效。常规的总神经节苷脂制备工艺,是将猪脑通过有机溶剂提取得到总神经节苷脂直接水解,水解转化率一般只有2倍左右,本工艺先将总神经节苷脂中的GM1纯化分离,再将其他的神经节苷脂进行水解,神经节苷脂水解转化效率明显提高,通过新的水解工艺将GM1含量提高一倍以上,通过该方法得到的GM1粗品GM1的含量在80%以上。GM1粗品再经过一次硅胶纯化,得到含量在98%以上的GM1,总收率在万分之五以上,远高于常规方法的万分之三。
神经节苷脂酸水解是一个动态平衡的过程,在一定的条件下能将双唾液酸四己糖神经节苷脂钠等含多个唾液酸的神经节苷脂水解转化成单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1),当水解达到平衡后,GM1也会被水解,常规方法只能将GM1含量提高1倍。
目前应用于临床的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠主要从猪脑中提取得到,提取率仅约万分之三,应用临床的剂型主要为注射剂,市场长期处于供不应求的状态。
发明内容
本发明的目的在于提供高效水解转化制备神经节苷脂的方法,以解决上述背景技术中提出的目前应用于临床的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠主要从猪脑中提取得到,提取率仅约万分之三,应用临床的剂型主要为注射剂,市场长期处于供不应求的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:高效水解转化制备神经节苷脂的方法,包括如下步骤:
步骤一:猪脑粗提物提取:
提取:将鲜猪脑绞碎和提取液按1∶3(w/v)加入提取罐中,加热40℃,搅拌提取30分钟,静置分层40分钟,压滤,收集上清液和滤液;
分层:按提取液体积的25%加入饮用水,搅拌10分钟,静置12小时分层,收集上清液;
皂化:按上清体积的0.3%加氢氧化钠固体于分层水解罐中,控制温度55~65℃,搅拌30分钟;
树脂层析:将水解液通过大孔树脂,用2倍柱体积的水冲洗树脂,再用2倍柱体积的50%甲醇冲洗树脂,再用甲醇洗脱,收集洗脱液;
丙酮沉淀过滤、干燥:按水解液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀,丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得猪脑粗提物;
步骤二:猪脑粗提物硅胶层析纯化:将100-200目硅胶装入硅胶层析柱,猪脑粗提物用流动相溶解后上样,用流动相洗脱,收集洗脱液,将仅含GM1洗脱液和含后段杂质洗脱液分别收集浓缩至基本无有机溶剂,得到粗品浓缩液和杂质浓缩液;按浓缩液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀;丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1粗品I和待水解杂质部分;
步骤三:水解转化:将待水解杂质部分加水按50mg/ml加热溶解,80℃用6M盐酸调pH3.5,水解5个小时,再用2M氢氧化钠阳调pH8.0,水解液浓缩后,浓缩液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀;丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1粗品II;
步骤四:GM1粗品硅胶层析纯化:将200-300目硅胶装入硅胶层析柱,GM1粗品I和GM1粗品II用流动相溶解后上样,用流动相洗脱,收集洗脱液,将仅含GM1洗脱液;将GM1洗脱液浓缩后,倒入10倍量丙酮于-10℃~-15℃静置沉淀10~20小时,丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1纯品。
作为本发明的一种优选的技术方案,所述步骤一中,提取液为氯仿/甲醇=1∶2。
作为本发明的一种优选的技术方案,所述静置沉淀,沉淀时间不少于4小时。
作为本发明的一种优选的技术方案,所述步骤二中,流动相为三氯甲烷∶甲醇∶水=60∶30∶3(v∶v∶v)。
作为本发明的一种优选的技术方案,所述步骤四中,流动相为三氯甲烷∶甲醇∶水=65∶35∶4(v∶v∶v)。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
总神经节苷脂硅胶纯化分离出大部分GM1,分离得到的GM1粗品I含量在80%以上,其他神经节苷脂部分再进行水解,转化率大幅度提高。
附图说明
图1为本发明的制备方法流程图。
具体实施方式
高效水解转化制备神经节苷脂的方法,包括如下步骤:
步骤一:猪脑粗提物提取:
提取:将鲜猪脑绞碎,和提取液(氯仿/甲醇=1∶2)按1∶3(w/v)加入提取罐中,加热40℃,搅拌提取30分钟,静置分层40分钟,压滤,收集上清液和滤液;
分层:按提取液体积的25%加入饮用水,搅拌10分钟,静置12小时分层,收集上清液;
皂化:按上清体积的0.3%加氢氧化钠固体于分层水解罐中,控制温度55~65℃,搅拌30分钟;
树脂层析:将水解液通过大孔树脂,用2倍柱体积的水冲洗树脂,再用2倍柱体积的50%甲醇冲洗树脂,再用甲醇洗脱,收集洗脱液;
丙酮沉淀过滤、干燥:按水解液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀,沉淀时间不少于4小时,丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得猪脑粗提物;
步骤二:猪脑粗提物硅胶层析纯化:将100-200目硅胶装入硅胶层析柱,猪脑粗提物用流动相(三氯甲烷∶甲醇∶水=60∶30∶3(v∶v∶v))溶解后上样,用流动相洗脱,收集洗脱液,将仅含GM1洗脱液和含后段杂质洗脱液,分别收集浓缩至基本无有机溶剂,得到粗品浓缩液和杂质浓缩液;按浓缩液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀,沉淀时间不少于4小时;丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1粗品I和待水解杂质部分;
步骤三:水解转化:将待水解杂质部分加水按50mg/ml加热溶解,80℃用6M盐酸调pH3.5,水解5个小时,再用2M氢氧化钠阳调pH8.0,水解液浓缩后,浓缩液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀,沉淀时间不少于4小时;丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1粗品II;
步骤四:将200-300目硅胶装入硅胶层析柱,GM1粗品I和GM1粗品II用流动相(三氯甲烷∶甲醇∶水=65∶35∶4(v∶v∶v))溶解后上样,用流动相洗脱,收集洗脱液,将仅含GM1洗脱液,将GM1洗脱液浓缩后,倒入10倍量丙酮于-10℃~-15℃静置沉淀10~20小时,丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1纯品。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.高效水解转化制备神经节苷脂的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:猪脑粗提物提取:
提取:将鲜猪脑绞碎和提取液按1∶3(w/v)加入提取罐中,加热40℃,搅拌提取30分钟,静置分层40分钟,压滤,收集上清液和滤液;
分层:按提取液体积的25%加入饮用水,搅拌10分钟,静置12小时分层,收集上清液;
皂化:按上清体积的0.3%加氢氧化钠固体于分层水解罐中,控制温度55~65℃,搅拌30分钟;
树脂层析:将水解液通过大孔树脂,用2倍柱体积的水冲洗树脂,再用2倍柱体积的50%甲醇冲洗树脂,再用甲醇洗脱,收集洗脱液;
丙酮沉淀过滤、干燥:按水解液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀,丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得猪脑粗提物;
步骤二:猪脑粗提物硅胶层析纯化:将100-200目硅胶装入硅胶层析柱,猪脑粗提物用流动相溶解后上样,用流动相洗脱,收集洗脱液,将仅含GM1洗脱液和含后段杂质洗脱液分别收集浓缩至基本无有机溶剂,得到粗品浓缩液和杂质浓缩液;按浓缩液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀;丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1粗品I和待水解杂质部分;
步骤三:水解转化:将待水解杂质部分加水按50mg/ml加热溶解,80℃用6M盐酸调pH3.5,水解5个小时,再用2M氢氧化钠阳调pH8.0,水解液浓缩后,浓缩液∶丙酮(w/w)=1∶5将丙酮加入浓缩液中,搅拌均匀,-10℃~-15℃静置沉淀;丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1粗品II;
步骤四:GM1粗品硅胶层析纯化:将200-300目硅胶装入硅胶层析柱,GM1粗品I和GM1粗品II用流动相溶解后上样,用流动相洗脱,收集洗脱液,将仅含GM1洗脱液;将GM1洗脱液浓缩后,倒入10倍量丙酮于-10℃~-15℃静置沉淀10~20小时,丙酮沉淀液真空抽滤,将滤饼放入真空干燥箱干燥,即得GM1纯品。
2.根据权利要求1所述的高效水解转化制备神经节苷脂的方法,其特征在于:所述步骤一中,提取液为氯仿/甲醇=1∶2。
3.根据权利要求1所述的高效水解转化制备神经节苷脂的方法,其特征在于:所述静置沉淀,沉淀时间不少于4小时。
4.根据权利要求1所述的高效水解转化制备神经节苷脂的方法,其特征在于:所述步骤二中,流动相为三氯甲烷∶甲醇∶水=60∶30∶3(v∶v∶v)。
5.根据权利要求1所述的高效水解转化制备神经节苷脂的方法,其特征在于:所述步骤四中,流动相为三氯甲烷∶甲醇∶水=65∶35∶4(v∶v∶v)。
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