CN101885782B - 一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法 - Google Patents

一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，本发明以肝素副产物为原料，溶解后加入醋酸钾，以醋酸调节溶液的pH值产生沉淀，清液为硫酸多糖溶液，向硫酸多糖溶液加入斑氏试剂、饱和氢氧化钠溶液，离心收集沉淀，重沉淀，再将沉淀溶解，以阴离子交换性质的层析柱、氯化钠溶液洗去铜离子，再以氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩以乙醇沉淀得到高纯度的硫酸皮肤素。本发明的纯化工艺简单、纯化收率高、成本低、容易放大、适于工业化生产。

Description

一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法
技术领域
本发明涉及一种硫酸皮肤素的制备方法，尤其涉及一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法。
背景技术
硫酸皮肤素(dermatan sulfate，简称DS)，是一种天然的糖胺聚糖，由重复的二糖单位组成，其二糖为乙酰氨基硫酸半乳糖和艾杜糖醛酸，主要为N-乙酰半乳糖胺4-硫酸和L-艾杜糖醛构成的双糖链结构。DS广泛分布于动物组织中，具有抗血栓、抗水肿、促进皮肤更新、阻止皮肤的过度角质化和棘皮症、滋润皮肤、保持水分的作用，近年来受到国内外专家的日益重视。
长期以来，动物皮层是制备硫酸皮肤素的主要原料，也是商品硫酸皮肤素的主要来源。早在60年代，Clifonelli J A和Roden L等人(BiochemicalPrep 12，5-12，1968)就曾利用猪皮为原料制备硫酸皮肤素，采用木瓜蛋白酶降解后利用不同浓度的氯化十六烷基吡啶进行结合与解析硫酸皮肤素粗品，将粗品溶于水，以氢氧化钠和班式试剂沉淀，将沉淀溶于乙酸中，用氢氧化钠中和后透析，透析液通过强酸型阳离子树脂脱铜，脱铜液以乙酸调至pH4-5，最后以2倍乙醇沉淀出硫酸皮肤素。
1996年，Voler(J Chromatogram B 685，27-34，1996)以牛肺为原料，以丙酮、三氯甲烷、甲醇等处理，木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶酶解，离子交换树脂吸附、洗涤、洗脱，三氯乙酸除蛋白，多次沉淀、离心，干燥得到精致的粘多糖，混合粘多糖溶液中又通过添加不同体积的有机溶剂，如甲醇，乙醇和丙酮等，根据不同粘多糖的溶解性不同而将它们分离。
2007年张虹等人(专利申请号：200710069959.0)以鮟鱇鱼皮为原料，通过胰酶与木瓜蛋白酶组成的复合酶提取，向提取液中添加氢氧化钠断裂糖肽键，除糖肽键过程以NaPH4保护糖苷键，以savage法除去蛋白质，用乙醇沉淀出硫酸皮肤素。
从动物组织中提取硫酸皮肤素以牺牲动物为代价，所得的硫酸皮肤素量比较少，不能满足市场的需求。另外，从动物组织中提取硫酸皮肤素的步骤比较繁琐，不适用于工业大规模生产。
与此相反，在生产肝素的过程中产生的大量含有硫酸皮肤素的副产物，本发明提供了一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，充分利用了肝素生产过程中产生的副产物，该方法工艺简单、收率高、所得硫酸皮肤素纯度可高达93％以上，适用于工业的大规模生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法。
在生产肝素的过程中产生大量副产物，其中主要组成是硫酸皮肤素、肝素、硫酸类肝素。本发明中建立了一种新的分离纯化工艺，将硫酸皮肤素分离出来并得到高纯度的产品。本发明包括下述顺序步骤：
(1)将肝素副产物溶解为2-10％(质量分数)的溶液，向其中加入醋酸钾至20-80％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至5-7，在2-8℃沉淀1-7天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
(2)向步骤所得(1)的硫酸多糖溶液中加入0.5-1.6倍体积的斑氏试剂和0.05-0.2倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10-60分钟，离心分离清液和沉淀。
(3)向步骤(2)所得的沉淀中加入0.5-1.6倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.05-0.2倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10-60分钟，离心取沉淀。
(4)将步骤(3)得到的沉淀用纯化水溶解，调节pH为中性，上一根阴离子交换性质的层析柱，以0.1-0.6M氯化钠溶液洗去铜离子。然后以1-2.5M氯化钠溶液线形浓度梯度洗脱，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以乙醇沉淀，3000rpm离心30min，收集沉淀、烘干，得到高纯度的硫酸皮肤素。
步骤(1)所述的肝素副产物溶液浓度优选为5％-9％，进一步优选为8％；步骤(2)、(3)所述的沉淀条件选选为0.6-1.2倍体积的斑氏试剂和0.08-0.15倍体积的饱和氢氧化钠，进一步优选为0.8倍体积的斑氏试剂和0.1倍体积的饱和氢氧化钠；步骤(4)所述阴离子交换性质的层析柱优选为Q-SepharoseFF、DEAE-Sepharose FF；步骤(4)所述从层析柱洗去铜离子的氯化钠溶液浓度优选为0.2-0.4M，进一步优选为0.3M。
本发明所述制备方法具有工艺简单、成本低、容易放大、纯化工艺收率高等特点，产品纯度高，制得的硫酸皮肤素用琼脂糖电泳检测未发现其它硫酸化氨基多糖条带。
具体实施方式
下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。
实施例一
将肝素副产物溶解为20％溶液，向其中加入醋酸钾至20％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至5，在2℃沉淀1天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入0.5倍体积斑氏试剂和0.05倍体积饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入0.5倍体积斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.05倍体积饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10分钟，离心取沉淀。
将得到的沉淀用400ml纯化水稀释，调节pH为中性，上一根DEAE-Sepharose FF层析柱，以0.1M氯化钠洗涤300ml，以1-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400ml，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮肤素经过HPLC测定纯度为93.9％，旋光性分析为-55、抗凝测定＜8USP/mg。
实施例二
将肝素副产物溶解为10％溶液，向其中加入醋酸钾至80％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至7，在2℃沉淀7天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入1.6倍斑氏试剂和0.2倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀60分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入1.6倍斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.2倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀60分钟，离心取沉淀。
将得到的沉淀用400ml纯化水稀释，调节pH为中性，上一根DEAE-Sepharose FF层析柱，以0.6M氯化钠洗涤300ml，以1-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400ml，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮肤素经过HPLC测定纯度为95.2％，旋光性分析为-55、抗凝测定＜8USP/mg。
实施例三
将肝素副产物溶解为8％溶液，向其中加入醋酸钾至60％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至6.5，在5℃沉淀5天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入0.8倍斑氏试剂和0.1倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀40分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入0.8倍斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.1倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀40分钟，离心取沉淀。
将得到的沉淀用400ml纯化水稀释，调节pH为中性，上一根DEAE-Sepharose FF柱，以0.3M氯化钠洗涤300ml，以1-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400ml，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮肤素经过HPLC测定纯度为95.5％，旋光性分析为-55、抗凝测定＜8USP/mg。
实施例四
将肝素副产物溶解为5％溶液，向其中加入醋酸钾至50％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至6，在4℃沉淀4天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入0.6倍斑氏试剂和0.15倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀20分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入0.6倍斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.15倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀40分钟，离心取沉淀。
将得到的沉淀用400ml纯化水稀释，调节pH为中性，上一根Q-SepharoseFF柱，以0.4M氯化钠洗涤300ml，以1-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400ml，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮肤素经过HPLC测定纯度为94.3％，旋光性分析为-55、抗凝测定＜8USP/mg。
实施例五
将肝素副产物溶解为9％溶液，向其中加入醋酸钾至30％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至5.5，在7℃沉淀4天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入1.倍斑氏试剂和0.08倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀20分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入1.1倍斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.08倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀40分钟，离心取沉淀。
将得到的沉淀用400ml纯化水稀释，调节pH为中性，上一根Q-SepharoseFF柱，以0.2M氯化钠洗涤300ml，以1-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400ml，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮肤素经过HPLC测定纯度为95.6％，旋光性分析为-55、抗凝测定＜8USP/mg。
实施例六
将肝素副产物溶解为3％溶液，向其中加入醋酸钾至30％浓度，搅拌溶解，以醋酸调节pH至6，在7℃沉淀3天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入1.3倍斑氏试剂和0.12倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀50分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入1.3倍斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.12倍饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀20分钟，离心取沉淀。
将得到的沉淀用400ml纯化水稀释，调节pH为中性，上一根Q-SepharoseFF柱，以0.5M氯化钠洗涤300ml，以1-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400ml，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀、烘干，得到硫酸皮肤素经过HPLC测定纯度为93.5％，旋光性分析为-55、抗凝测定＜8USP/mg。

Claims (10)

1.一种从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：
a、肝素副产物溶解为质量分数2-10％的溶液，加入醋酸钾使溶液中醋酸钾的浓度为20-80％，以醋酸调节pH值为5-7，2-8℃沉淀1-7天，离心取清液；
b、加入0.5-1.6倍清液体积的斑氏试剂、0.05-0.2倍清液体积的饱和氢氧化钠，搅拌，室温沉淀10-60分钟，离心取沉淀；
c、沉淀溶解，重复上一步骤；
d、沉淀用纯化水溶解，调节pH值为中性；
f、上一根阴离子交换层析柱，以浓度为0.1-0.6M的氯化钠洗去铜离子；
g、以氯化钠浓度为1-2.5M线性梯度洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩，过滤，向滤液中加1/4体积水，以乙醇沉淀，离心收集沉淀，烘干。
2.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤a中所述肝素副产物溶解为浓度质量分数5％-9％的溶液。
3.如权利要求1或2所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤a中所述肝素副产物溶解为浓度质量分数8％的溶液。
4.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤b中所述斑氏试剂的量为0.6-1.2倍清液的体积，所述饱和氢氧化钠的量为0.08-0.15倍清液的体积。
5.如权利要求1或4所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤b中所述斑氏试剂的量为0.8倍清液的体积，所述饱和氢氧化钠的量为0.1倍清液的体积。
6.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤f中所述阴离子交换层析柱为Q-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析柱。
7.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤f中所述氯化钠浓度为0.2-0.4M。
8.如权利要求1或6所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤f中所述氯化钠浓度为0.3M。
9.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤g中所述离心为3000rpm离心30min。
10.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸皮肤素的方法，其特征在于：步骤g中所述蒸发浓缩为65℃真空旋转蒸发浓缩至原浓度的5倍。
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