CN101885787B - 一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，以肝素副产物为原料，溶解后加入醋酸钾，通过醋酸调节溶液的pH值，去沉淀后得到硫酸多糖溶液，向硫酸多糖溶液加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，沉淀中再加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，清液合并，上一根阴离子交换性质的层析柱，以氯化钠溶液洗去铜离子，再以氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩以乙醇沉淀得到高纯度的硫酸乙酰肝素。本发明的纯化工艺简单、纯化收率高、成本低、容易放大、适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸乙酰肝素的制备方法，尤其涉及一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法。
背景技术
硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，简称HS)，是一种天然的糖胺聚糖，由重复的二糖单位组成，其二糖为硫酸化的葡萄糖胺和己糖醛酸。广泛分布于动物组织中，几乎可以在所有细胞内合成。硫酸乙酰肝素与肝素的不同之处在于，其硫酸化程度要小一些，己糖醛酸中艾杜糖醛酸占的比例也小一些。
因为有报道HS具有抗肿瘤功能，HS的研究近年很受重视。但是硫酸乙酰肝素的获得极为困难，试剂公司的HS价格极为昂贵，令许多研究者望而止步。国内很少有研究者进行HS的抗肿瘤试验，多个研究小组关于微生物肝素酶工II和动物类肝素酶的研究因缺乏HS作底物而难以进行。
生产肝素的过程产生的大量副产物中含有硫酸类肝素，本发明提供了一种新的工艺，从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素，具有成本低廉、工艺简单、容易放大为工业生产、获得的硫酸乙酰肝素纯度高等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法。
在生产肝素的过程中产生大量副产物，其中主要组成是硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素。本发明中建立了一种新的分离纯化工艺，从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素，本发明包括以下顺序步骤:
(1)将肝素副产物溶解为2-10%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为10-70%，搅拌溶解，以醋酸调节pH至5-7，在2-8℃沉淀1-7天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
(2)向经过步骤(1)纯化的硫酸多糖溶液中加入0.5-1.6倍体积的斑氏试剂和0.05-0.2倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10-60分钟，离心分离清液和沉淀。
(3)向步骤(2)得到的沉淀中加入0.5-1.6倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.05-0.2倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10-60分钟，离心去沉淀。
(4)将步骤(2)和(3)得到的清液合并，用纯化水稀释，上一根阴离子交换性质的层析柱，以0.1-0.6M氯化钠溶液洗去铜离子。然后以0-2.5M氯化钠溶液线形浓度梯度洗脱，收集硫酸化糖胺聚糖浓度峰的几管，旋转蒸发浓缩后以乙醇沉淀，得到高纯度的硫酸乙酰肝素。
步骤(1)所述的肝素副产物溶液浓度优选为5%-9%，进一步优选为8%，所述沉淀条件优选为3-6℃沉淀2-4天，进一步优选为4℃沉淀3天;步骤(2)、(3)所述的沉淀条件选选为0.6-1.2倍体积的斑氏试剂和0.08-0.15倍体积的饱和氢氧化钠，进一步优选为0.8倍体积的斑氏试剂和0.1倍体积的饱和氢氧化钠;步骤(4)所述阴离子交换性质的层析柱优选为Q-Sepharose FF,DEAE-Sepharose FF;步骤(4)所述从层析柱洗去铜离子的氯化钠溶液浓度优选为0.2-0.4M，进一步优选为0.3M。
本发明所述制备方法，具有成本低廉、工艺简单、容易放大为工业生产、获得的硫酸乙酰肝素纯度高、产品收率高等特点。用本发明所制得的硫酸类肝素用琼脂糖电泳检测未发现其它硫酸花氨基多糖条带。
具体实施方式
下面结合实例对本发明所述内容作进一步阐述。
实施例一
将肝素副产物溶解为2%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为10%，搅拌溶解，以醋酸调节pH至5，在2℃沉淀1天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入0.5倍体积斑氏试剂和0.05倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入0.5倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.05倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀10分钟，离心去沉淀。
将前两步得到的清液合并，用2000m1纯化水稀释，上一根上Q-SepharoseFF柱，以0.1M氯化钠洗涤300m1，以0-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400m1，收集含有硫酸乙酰肝素的管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀，烘干。所得沉淀经过HPLC测定纯度为93.2%。
实施例二
将肝素副产物溶解为8%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为50%，搅拌溶解，以醋酸调节pH至6，在5℃沉淀3天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入1.2倍体积斑氏试剂和0.08倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀30分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入1.2倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.08倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀30分钟，离心去沉淀。
将前两步得到的清液合并，用2000m1纯化水稀释，上一根上Q-SepharoseFF柱，以0.2M氯化钠洗涤300m1，以0-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400m1，收集含有硫酸乙酰肝素的管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀，烘干。所得沉淀经过HPLC测定纯度为94.5%。
实施例三
将肝素副产物溶解为4%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为30%，搅拌溶解，以醋酸调节pH至5.5，在4℃沉淀4天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入0.8倍体积斑氏试剂和0.1倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀45分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入0.8倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.1倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀45分钟，离心去沉淀。
将前两步得到的清液合并，用2000m1纯化水稀释，上一根上Q-SepharoseFF柱，以0.4M氯化钠洗涤300m1，以0-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400m1，收集含有硫酸乙酰肝素的管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀，烘干。所得沉淀经过HPLC测定纯度为93.9%。
实施例四
将肝素副产物溶解为5%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为70%，搅拌溶解，以醋酸调节pH至6.5，在7℃沉淀5天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入1.4倍体积斑氏试剂和倍体积的0.13饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀50分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入1.4倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.13倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀50分钟，离心去沉淀。
将前两步得到的清液合并，用2000m1纯化水稀释，上一根上Q-SepharoseFF柱，以0.3M氯化钠洗涤300m1，以0-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400m1，收集含有硫酸乙酰肝素的管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀，烘干。所得沉淀经过HPLC测定纯度为93.8%。
实施例五
将肝素副产物溶解为9%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为40%，搅拌溶解，以醋酸调节pH至6，在6℃沉淀6天。离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液。
向前述硫酸多糖溶液中加入1.0倍体积斑氏试剂和0.18倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀20分钟，离心分离清液和沉淀。向沉淀中加入1.0倍体积的斑氏试剂，充分搅拌使溶解，然后加入0.18倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌后室温沉淀20分钟，离心去沉淀。
将前两步得到的清液合并，用2000m1纯化水稀释，上一根上Q-SepharoseFF柱，以0.45M氯化钠洗涤300m1，以0-2.5M氯化钠线形梯度洗脱400m1，收集含有硫酸乙酰肝素的管，合并溶液，65℃真空旋转蒸发浓缩5倍，过滤，向滤液中加1/4体积水，以2V新乙醇沉淀，3000rpm离心30min。收集沉淀，烘干。所得沉淀经过HPLC测定纯度为94.4%。
Claims (9)
1.一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:所述方法包括下述步骤:
a、肝素副产物溶解为质量分数2-10%的溶液，向其中加入醋酸钾使醋酸钾的质量分数为20-70%，搅拌溶解，以醋酸调节pH值至5-7,2-8℃沉淀1-7天，离心收集上清得到清除肝素后的硫酸多糖溶液；
b、加入0.5-1.6倍体积的斑氏试剂、0.05-0.2倍体积的饱和氢氧化钠，搅拌，室温沉淀10-60分钟，离心取清液；
c,溶解沉淀，重复上一步骤；
d、合并b和c中的清液，调节pH值为中性；
f、上一根阴离子交换层析柱，以浓度为0.1-0.6M的氯化钠洗去铜离子；
g、以氯化钠浓度为0-2.5M线性梯度洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩，过滤，向滤液中加1/4体积水，以乙醇沉淀，离心收集沉淀，烘干。
2.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤a中所述肝素副产物溶解为浓度质量分数5%-9%的溶液。
3.如权利要求1或2所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤a中所述肝素副产物溶解为浓度质量分数8%的溶液。
4.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤b中所述斑氏试剂的量为0.6-1.2倍的体积，所述饱和氢氧化钠的量为0.08-0.15倍的体积。
5.如权利要求1或4所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤b中所述斑氏试剂的量为0.8倍的体积，所述饱和氢氧化钠的量为0.1倍的体积。
6.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤f中所述阴离子交换层析柱为Q-SepharoseFF,DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析柱。
7.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤f中所述氯化钠浓度为0.2-0.4M。
8.如权利要求1或6所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤f中所述氯化钠浓度为0.3M。
9.如权利要求1所述的从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，其特征在于:步骤g中所述离心为3000rpm离心30min。
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