CN103288981A - 一种抑制细胞增殖的硫酸酯化的硫酸乙酰肝素 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以硫酸乙酰肝素为原料，通过硫酸酯化方法制备的硫酸乙酰肝素衍生物。硫酸乙酰肝素用无水二甲基甲酰胺溶胀，加入三氧化硫·三甲胺复合物，加热酯化，反应物的沉淀组分经蒸馏水溶解、透析、冻干，再用氯化钠溶液溶解，经乙醇沉淀、离心、去上清、干燥后制得硫酸酯化的硫酸乙酰肝素。该硫酸乙酰肝素衍生物具有抑制肿瘤细胞和脐静脉内皮细胞增殖的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸酯化的硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfated, HS)，其制备方法及抑制细胞增殖方面的应用。
背景技术
HS是一种广泛存在于细胞表面和细胞外基质(ECM)中的结构复杂的多糖类化合物，由葡萄糖醛酸(GlcA)和氨基葡萄糖(Glucosamine)二糖单元通过糖苷键重复聚合而成，其结构如图1[Sanaullah Khan, Elizabeth Rodriguez, Rima Patel,Jayesh Gor, Barbara Mulloy, Stephen J. Perkins. The Solution Structure of Heparan Sulfate Differs from That of Heparin. J Biol Chem. 2011, 286(28): 24842–24854]，其中氨基葡萄糖的残基能够被N-乙酰化，N-和O-硫酸化修饰，葡萄糖醛酸残基能够被异构化为艾杜糖醛酸(IdoA)残基。
肿瘤侵袭和转移是肿瘤发生和演进过程最危险阶段，也是肿瘤恶性发展的标志，临床肿瘤患者约有80%以上死于肿瘤侵袭和转移。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)可以促进内皮细胞增殖、诱导毛细血管芽生，增加毛细血管通透性，促进细胞移行和抑制细胞凋亡。正常体内环境中HS蛋白聚糖与VEGF等细胞因子以结合状态存在，当机体发生癌变后，硫酸乙酰肝素酶(Heparan Sufated Enzyme, HPSE)表达量提高，使得HS被降解，VEGF等细胞因子释放成自由分子，从而刺激机体癌变部位新生血管生成，为肿瘤的增殖提供营养。而加入外源性的HS则可以从一定程度上缓解上述过程。通HPSE降解HS，从而摧毁癌症部位的细胞外基质和血管壁是肿瘤实现迁移的途径之一。加入外源性的HS竞争结合肿瘤微环境中的HPSE，能减轻该酶细胞外基质的降解和血管壁的破坏，从而抑制肿瘤细胞对其他组织的侵袭和迁移。
由于高纯度HS制备较为困难，并且天然HS用于肿瘤治疗时效果不显著，目前利用HS治疗肿瘤还没有得到广泛应用。但HS的结构类似物和衍生物的研究却成为人类寻找癌症治疗潜在药物的新方向。目前已有数十种HS的结构类似物正在研究中，其中PI-88(硫酸化磷酸甘露戊糖)和PG545(类固醇和长链烷烃修饰的HS寡糖)已经被作为抗肿瘤药物进行临床试验研究。硫酸酯化是一种多糖结构修饰方法，通过硫酸酯化对多糖结构中自由羟基、乙酰基和羧基进行取代而改变多糖的理化性质和生物活性。对具有潜在抗肿瘤活性的HS进行硫酸酯化修饰有可能提高其在抗肿瘤领域的应用性。
发明内容
本发明提供了一种结构通式为图2所示的硫酸酯化的HS。
硫酸酯化的HS的分子量Mw=27521Da，分子量分布为2196～87845Da。由于HS双糖最低分子量为378.33Da (I-HNAc/ G-HNAc)，最高为657.53Da (I2S-HNS,3S,6S /G2S-HNS,3S,6S)[Ganesh Venkataraman, Zachary Shriver, Rahul Raman, Ram Sasisekharan, Sequencing Complex Polysaccharides, SCIENCE, 1999, 286 (5439): 537- 542]，组成硫酸酯化的HS的各双糖分别为m1、m2、m3……mn，推断3< n <232。其中每个双糖可能相同也可能不同，各双糖通过糖苷键连接组成的序列为m1m2m3……mn。R1、R2、R6、R7是OH、SO3Na、SO3H，可以相同也可以不同；R3是SO3Na、SO3H、COO，可以相同也可以不同；R4是NH、NH2、SO3H、SO3Na可以相同也可以不同；若R4是NH，则R5为SO3Na、SO3H、Ac，可以相同也可以不同；若R4是SO3H、SO3Na、NH2，可以相同也可以不同，则R5不存在。
本发明还提供了一种硫酸酯化的HS的制备方法：
(1)制备高纯度HS的方法参照专利《一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法》(中国专利申请号：200910039359.9)。
(2)通过步骤(1)制备得到的HS冷冻干燥后用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶胀，加入三氧化硫·三甲胺复合物[(CH3)3N·SO3]，其中DMF、(CH3)3N·SO3和HS分别为10～50mL，0.5～5g，0.1～2g。沉淀经蒸馏水溶解、透析、冻干，再用10%NaCl溶解，将其配制成100mg/mL的溶液，用终浓度为45～95%的乙醇沉淀，5000r.p.m离心10min，去上清，沉淀干燥后制得硫酸酯化的HS。
步骤(2)所述的反应条件优选为0.2～0.8gHS溶胀于20～40mL无水DMF加入2～3g(CH3)3N·SO3，在75～85℃下酯化反应2～4小时，进一步优选为0.5gHS用30mL无水DMF溶胀，加入2.5g(CH3)3N·SO3，在80℃下搅拌反应3h；所述用终浓度为45～95%的乙醇沉淀优选为60～90%，进一步优选为80%。
本发明还提供了上述硫酸酯化的HS多糖片段在抑制肿瘤细胞和内皮细胞增殖中的用途。本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖活性可以用于包括治疗和预防肿瘤及其转移和复发。
附图说明
图1 A为HS的主要双糖序列，B为HS的可变双糖序列（X=H或 
；Y=Ac，，或H）。
图2为硫酸酯化的HS结构通式。
图3为高效液相凝胶排阻色谱法测定硫酸酯化的HS分子量的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
实施例1
将参照专利《一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法》制备的HS冷冻干燥后取0.5g溶于30mL无水DMF，充分溶胀，加入2.5g(CH3)3N·SO3，在80℃下搅拌反应3h。冷却到室温后，清出上清液，沉淀经蒸馏水溶解、透析、冻干后用10%的氢氧化钠溶解，配制成100mg/mL的溶液，用终浓度为80%的乙醇沉淀，干燥后制得硫酸酯化的HS。
实施例2
硫酸酯化的HS的分子量测定采用高效液相凝胶排阻色谱法。流动相为0.1mol/L乙酸铵和0.02%叠氮化钠混合溶液，分子量对照品为肝素钠(NIBSC code 07/324)，串联色谱柱TSK Guard column(7.8mm×30cm)、TSK SW xl4000(7.8mm×30cm)和TSK SW xl3000(7.8mm×30cm)，柱温30℃，洗脱流速为0.6ml/min，示差折光检测器，温度为30℃。GPC软件绘制肝素钠对照品分子量和保留时间的标准曲线为：LogMw=1.09e+001-5.06e-001T+1.41e-002T2 -1.55e-004T3(R2=9999)。GPC软件计算硫酸酯化的HS分子量Mw=27521Da，分子量分布为2196～87845Da，分子量大于24000Da的组分占49.55%，分子量小于8000Da的组分占9.05%。
实施例3
取一块96孔细胞培养板，每孔分别加入约5×103个人肝癌细胞 (HepG2)，于5%的CO2培养箱中37℃培养12h，分别加入含1mg/mL和0.1mg/mL硫酸酯化的HS的DMEM培养基；另以DMEM培养基为空白对照，在CO2培养箱中培养48h，每孔加入10μLMTT，孵育4h后，吸去培养基，加入150μLDMSO，充分摇匀后，在酶联免疫分析仪上490nm检测，样品吸光值为A1，空白吸光度为A2，抑制率(%)=
。在浓度为1mg/mL和0.1mg/mL硫酸酯化的HS对HepG2抑制率为47.12%和41.53%。
实施例4
取一块96孔细胞培养板，每孔分别加入约5×103个人宫颈癌细胞株(Hele)，于5%的CO2培养箱中37℃培养12h，分别加入含1mg/mL和0.1mg/mL硫酸酯化的HS的DMEM培养基；另以DMEM培养基为空白对照，在CO2培养箱中培养48h，每孔加入10μLMTT，孵育4h后，吸去培养基，加入150μLDMSO，充分摇匀后，在酶联免疫分析仪上490nm检测，样品吸光值为A1，空白吸光度为A2，抑制率(%)=
。在浓度为1mg/mL和0.1mg/mL硫酸酯化的HS对Hele抑制率为38.32%和31.77%。
实施例5
取一块96孔细胞培养板，每孔分别加入约5×103个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，于5%的CO2培养箱中37℃培养12h，分别加入含1mg/mL和0.1mg/mL硫酸酯化的HS的ECM培养基；另以ECM培养基为空白对照，在CO2培养箱中培养48h，每孔加入10μLMTT，孵育4h后，吸去培养基，加入150μLDMSO，充分摇匀后，在酶联免疫分析仪上490nm检测，样品吸光值为A1，空白吸光度为A2，抑制率(%)=
。在浓度为1mg/mL和0.1mg/mL硫酸酯化的HS对HUVEC抑制率为46.40%和29.80%。
Claims (6)
1.一种结构修饰的硫酸乙酰肝素，含有不同程度O-硫酸化的糖醛酸残基和葡萄糖胺残基。
2.权利要求1的衍生物，具有以下结构式(Ⅰ)：
(Ⅰ)的硫酸酯化的硫酸乙酰肝素分子量Mw=27521Da，分子量分布为2196～87845Da，其中大于24000Da的组分占49.55%，小于8000Da的组分占9.05%；各双糖分别为m1、m2、m3……mn，3< n <232；其中每个双糖可能相同也可能不同，各双糖通过糖苷键连接组成的序列为m1m2m3……；R1、R2、R6、R7是OH、SO3Na、SO3H，可以相同也可以不同；R3是SO3Na、SO3H、COO，可以相同也可以不同；R4是NH、NH2、SO3H、SO3Na可以相同也可以不同；若R4是NH，则R5为SO3Na、SO3H、Ac，可以相同也可以不同；若R4是SO3H、SO3Na、NH2，可以相同也可以不同，则R5不存在。
3.制备权利要求1～2的衍生物的方法，包括下列步骤：
(1)制备高纯度硫酸乙酰肝素的方法参照专利《一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法》(中国专利申请号：200910039359.9)；
(2)将步骤(1)的产物冷冻干燥后用无水DMF溶胀，加入(CH3)3N·SO3，其中DMF、(CH3)3N·SO3和硫酸乙酰肝素分别为10～50mL，0.5～5g，0.1～2g；上述混合物在60～90℃下酯化反应1～6小时，冷却到室温后，去上清，沉淀经蒸馏水溶解、透析、冻干，再用10%NaCl溶解，将其配制成100mg/mL的溶液，用终浓度为45～95%的乙醇沉淀，离心去上清，沉淀干燥后制得硫酸酯化的硫酸乙酰肝素。
4.由权利要求1～3的经硫酸酯化修饰得到的具有抑制肿瘤细胞增殖的硫酸酯化的硫酸乙酰肝素寡糖混合物或单一分子。
5.含有至少一种权利要求1～4所述的寡糖混合物或单一分子作为活性成分并与药学可接受载体和赋形剂混合的药物组合物。
6.权利要求1～4所述的寡糖混合物或单一分子在制备用于治疗肿瘤、任意与肿瘤转移有关的药物中的用途。
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