JP2019501263A

JP2019501263A - 硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖及びその調製法と施用

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Publication number: JP2019501263A
Application number: JP2018534943A
Authority: JP
Inventors: リ，　リ; リリ，
Original assignee: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2019-01-17
Anticipated expiration: 2035-12-30
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Abstract

硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖及びその調製法と施用を提供する。この硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は、ウロン酸誘導体及びグリコシルアミン誘導体を含有する硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖分子の非還元末端がヘパリナーゼによる酵素分解から生じた不飽和二重結合、並びにことを特徴とし、この硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄが独立してＳＯ３−又はＨであり、Ｒｘ’、Ｒｙ’及びＲｚ’が独立してＣＯＣＨ３又はＳＯ３−であり、ｎが１〜３である式Ｉによって表される構造を有する。この調製法は、制御可能な硫酸化度で硫酸化オリゴ糖を得る。この硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は、ｉｎｖｉｔｒｏでのヘパラナーゼ阻害に関する高活性、細胞接着と移動の阻害に関してヘパリンの活性より４〜５倍高い活性、及びマウスにおける腫瘍転移の抵抗に関してヘパリンの活性より２〜３倍高い活性を有し、したがって腫瘍転移の抵抗における比較的優れた効果及び比較的高い特異性がある。【選択図】なし

Description

本発明は抗腫瘍薬の分野に存し、硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖及びその調製法と使用に関する。

腫瘍は人間の健康に対する主たる脅威であり、更に深刻なことに、例えば肝臓がん及び肺がん等の悪性腫瘍は転移する傾向がある。現在、腫瘍転移を阻害するための薬物は存在せず、腫瘍転移の治療は難しくなり、したがって腫瘍転移はがん患者の最も重大な死因となる。２つのプロセスが、腫瘍細胞の侵入及び移動を実施するのに非常に重要である。１つは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と基底膜（ＢＭ）により形成された障壁を介しての破壊であり、もう１つは新たな血管の形成である。ＥＣＭとＢＭは腫瘍細胞の侵入及び転移に対する障壁であり、悪性腫瘍細胞はＥＣＭとＢＭを介して循環系に侵入し、蔓延し転移するはずである。このプロセス中、ＥＣＭ及びヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）の様々な成分の分解が必須である。ヘパラナーゼ（ＨＰＡ）は、現在哺乳動物において見られヘパラン硫酸（ＨＳ）を切断することができる唯一のエンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼである。ＨＰＡはＨＳの特異的構造を識別し、ＨＰＡはＨＳ側鎖を完全には切断せず、１０〜１５糖単位の短い糖鎖として分解されるＨＳ側鎖中の特定部位におけるグリコシド結合のみを切断する。更にＨＳ側鎖は、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、モルフォゲン及び血液凝固因子タンパク質等の様々な生物活性分子と結合することができる。ＨＰＡはＨＳを分解して、腫瘍血管形成、並びに腫瘍増殖、侵入及び転移を促進し得る活性増殖因子を放出する。したがって、ＨＰＡは腫瘍細胞の侵入及び転移において重要な役割を果たし、ＨＰＡ阻害剤の研究及びスクリーニングによって、人間はがん治療の可能性がある薬物を探し求める新たな方向に向かっている。

長い間、臨床的エビデンスはヘパリンに抗腫瘍効果があることを示し、近年、低分子量ヘパリン補助型抗腫瘍療法に関する臨床試験が行われている。長期の研究後、ヘパリンの抗腫瘍効果は産業界で広く認識及び理解されており、それは主に腫瘍転移を阻害することによって実現することができ、ｉｎｖｉｖｏのヘパラナーゼ活性を阻害することによって更に実現することができる。

ヘパリンは、伝統的な抗凝固因子として、その抗凝固活性に関して主に使用される。しかしながらヘパリンは、その構造多様性のため広範囲の生物活性を有する。ヘパリンの非抗凝固施用では、その抗凝固活性が共通の重大な副作用である。このように、ヘパリンの抗凝固活性は抗腫瘍転移の施用における主たる不利な要因であり、それは出血等の副作用を引き起こす傾向がある。ヘパリンの非抗凝固活性の施用に関する研究における重要な一態様は、ヘパリンの基本構造を維持しながらの抗凝固活性の破壊である。抗腫瘍転移に関して、ヘパリンはヘパラナーゼに対する高い阻害活性を有するが、腫瘍増殖の阻害、及び細胞レベルでの腫瘍細胞の侵入と接着に対する阻害活性に対して有意な影響はなく、マウスの抗腫瘍転移実験において良くない結果を得て、したがって腫瘍転移の発生を有意に阻害することができない。その主な理由はヘパリンの特異性が高くないことである可能性があり、したがってヘパリンは様々な内在物質と相互作用する可能性があり、ヘパラナーゼと結合するその能力は低下する可能性がある。

ＣＮ１０１８２４１００Ａは、以下の構造式：

を有し、血管平滑筋細胞の増殖を予防する用途がある、ヘパリン由来オリゴ糖ドデカマーを開示する。しかしながら、その発明のオリゴ糖には、腫瘍細胞の接着と移動を阻害する有意な能力はない。

ＣＮ１０４７６４８４７Ａは、Ｎ−アセチル化構造を含むヘパリン由来オリゴ糖を調製する方法を開示し、以下の４つの六糖断片と３つの八糖断片がこの参照文献中に開示される：

その発明は、Ｎ−アセチル化構造を含むヘパリン由来オリゴ糖の調製及び構造確認における難点に対処しているだけで、ｉｎｖｉｖｏヘパラナーゼ阻害活性の有意な改善は達成していない。

このように、当技術分野では、ｉｎｖｉｖｏヘパラナーゼ阻害活性及び低い抗凝固活性を有するヘパリン由来オリゴ糖を得ることが望まれる。

従来技術の欠点に対処するため、本発明の目的は、硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖及びその調製法と使用を提供することである。

本発明の目的を遂行するため、以下の技術的解決策を本発明において利用する。

第１の態様では、本発明は、その非還元末端にヘパリナーゼによる酵素分解から生じた不飽和二重結合を含有し、ウロン酸誘導体及びグリコシルアミン誘導体を含み、式Ｉ：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_ａ、Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃ及びＲ_ｄが独立してＳＯ_３ ⁻又はＨであり、Ｒ_ｘ’、Ｒ_ｙ’及びＲ_ｚ’が独立してＣＯＣＨ_３又はＳＯ_３ ⁻であり、ｎが１〜３である）
によって表される構造を有する硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を提供する。

本発明中、ｎは１〜３、すなわち１、２、又は３である。ｎ＝１のとき硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は硫酸化ヘパリン由来六糖であり、ｎ＝２のとき硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は硫酸化ヘパリン由来八糖であり、ｎ＝３のとき硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は硫酸化ヘパリン由来十糖である。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の構造中には二重結合が存在し、したがってこれは約２３２ｎｍでの紫外線領域中に強い吸収ピークがあり、ヘパリン由来オリゴ糖の定性及び定量決定に非常に都合よく利用することができる。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は、ヘパラナーゼ及び腫瘍転移に対する優れた阻害活性を有する。それは短い糖鎖及び低分子量を有し、抗凝固活性は全くない。一方、硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は高い特異性を有し、したがってヘパラナーゼを特異的に阻害し腫瘍転移を阻害することができる。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖では、式Ｉ中、各二糖単位内のスルホン基の数は平均２以上であり、例えば各二糖単位内のスルホン基の数は平均２、３、４、又は５であってよく、各二糖単位内のアセチル基の数は平均０．５以下であり、例えばそれは０．５又は０．４であってよく、各二糖単位内グルコサミン中６位及び３位におけるスルホン基の数はいずれも平均０．５以上であり、例えばそれは０．５、０．８、１、１．５、又は２であってよい。

各二糖単位内の基（例えばスルホン基、アセチル基、又はグルコサミン中６位及び３位におけるスルホン基）の数は、ヘパリン由来オリゴ糖全体中のスルホン基の数を各二糖単位に平均化することによって得られる数を指し、例えば硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖中に合計２個のアセチル基が存在する場合、各二糖単位内のアセチル基の数は平均０．５である。

式Ｉ中のウロン酸は、グルクロン酸又はイズロン酸であることが好ましい。

式Ｉ中に含有されるカルボキシル及び／又はスルホン基と塩を形成する陽イオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋又はＣａ^２＋からなる群から選択されることが好ましい。

前述の構造式中、グルクロン酸におけるカルボキシル又はスルホン基は負に帯電しており、したがって一般に特定陽イオン、典型的にはＮａ^＋、Ｋ^＋及びＣａ^２＋と塩を形成する。

硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は、以下の構造を有する化合物：
ＤＰ６、ヘパリン由来六糖誘導体：
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ＤＰ８、ヘパリン由来八糖誘導体：
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ＤＰ１０、ヘパリン由来十糖誘導体：
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
のいずれか１つである、又はその少なくとも２つの組合せであることが好ましい。

上記の構造中、ΔＵは

を表し、Ｉはα−Ｌ−イズロン酸を表し、Ｇはβ−Ｄ−グルクロン酸を表し、Ａはα−Ｄ−グルコサミンを表す。ＮＳはアミノ基におけるスルホン基を表し、２Ｓ、３Ｓ、６Ｓ等は糖環上の２−Ｏ、３−Ｏ、及び６−Ｏ位におけるスルホン基を表す。

第２の態様では、本発明は、以下のステップ：
（１）ヘパリナーゼでヘパリンを分解し、分離し精製してヘパリン由来オリゴ糖を得るステップ、及び
（２）ステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖を硫酸化試薬で硫酸化して硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得るステップを含む、第１の態様において記載した硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製法を提供する。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製法において、ステップ（１）中のヘパリナーゼはヘパリナーゼＩである。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製法において、ステップ（１）においてヘパリナーゼでヘパリンを分解するとき、バッファー、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０を加える必要がある。

ステップ（１）中で加えるヘパリナーゼの量は、１５〜２５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、例えば１６ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１６．５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１７ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１７．５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１８ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１８．５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１９ＩＵ／ヘパリン１ｇ、１９．５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、２０ＩＵ／ヘパリン１ｇ、２１．５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、２２ＩＵ／ヘパリン１ｇ、２３ＩＵ／ヘパリン１ｇ又は２４ＩＵ／ヘパリン１ｇ、及び好ましくは１８〜２３ＩＵ／ヘパリン１ｇであることが好ましい。

ステップ（１）中のヘパリナーゼによるヘパリン分解に関する温度は、４℃〜３７℃、例えば５℃、８℃、１０℃、１２℃、１５℃、１８℃、２０℃、２２℃、２５℃、２８℃、３０℃、３２℃、３５℃又は３７℃、及び好ましくは８℃〜２５℃であることが好ましい。

ステップ（１）中の分解に関する時間は、８〜２４時間、例えば９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間又は２３時間、及び好ましくは１０〜２０時間であることが好ましい。

ステップ（１）中のヘパリナーゼによるヘパリンの分解は、分解後に５〜１０分間、例えば５．５分間、６分間、６．５分間、７分間、７．５分間、８分間、８．５分間、９分間、９．５分間又は９．８分間、好ましくは５〜８分間、及びより好ましくは６分間、９５℃での不活性化を含むことが好ましい。

ステップ（１）中の分離は限外濾過、好ましくは１０ｋＤａの限外濾過遠心分離用チューブを用いた限外濾過を含むことが好ましい。

ステップ（１）中の精製はカラムクロマトグラフィーによる分離及び精製であることが好ましい。

カラムクロマトグラフィーによる分離後、濃縮、脱塩及び凍結乾燥等の方法によってヘパリン由来オリゴ糖を得る。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製法において、ステップ（２）中の硫酸化の前に、ステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖に膨張処理を施す。

膨張処理に使用する溶媒はＤＭＦであることが好ましい。

ステップ（２）中の硫酸化試薬は（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３であることが好ましい。

ヘパリン由来オリゴ糖１ｇに対して、硫酸化試薬の量は１〜１０ｇ、例えば１．２ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は９．８ｇであることが好ましい。

ステップ（２）中の硫酸化に関する温度は６０℃〜１２０℃、例えば６３℃、６５℃、７０℃、７３℃、７５℃、７８℃、８０℃、８３℃、８５℃、８８℃、９０℃、９３℃、９５℃、９８℃、１００℃、１１５℃、１１８℃又は１２０℃であることが好ましい。

ステップ（２）中の硫酸化に関する時間は１〜１２時間、例えば１．５時間、２時間、２．３時間、２．５時間、２．８時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１０．５時間、１１時間又は１１．５時間であることが好ましい。

本発明中、ヘパリン由来オリゴ糖の硫酸化度は、ヘパリン由来オリゴ糖の硫酸化試薬に対する比、反応温度、及び反応時間を制御することにより制御することができ、様々な程度の硫酸基置換があるヘパリン由来オリゴ糖を得ることができる。

本発明中、硫酸化試薬を用いてステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖を硫酸化した後、反応混合物に後処理を施し精製する必要がある。すなわち、反応混合物に１０倍体積の精製水を加えて沈殿を溶かし、１００〜５００Ｄａの分子量カットオフがある透析用バッグに移し、３日間の透析後Ｐ１０カラムで脱塩し、陽イオン交換カラムで陽イオン不純物を除去する前に濃縮し、高純度ＮａＯＨ、ＫＯＨ又はＣａ（ＯＨ）_２等で中和し、凍結乾燥又はエタノール沈殿前に濃縮し、相当する硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得る。

本発明の好ましい技術的解決策として、本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製法は、以下のステップ：
（１）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０であるバッファー内で８時間〜２４時間４℃〜３７℃において、１５〜２５ＩＵ／ヘパリン１ｇの量で加えるヘパリナーゼＩでヘパリンを分解し、分解後に５〜１０分間９５℃で不活性化し、１０ｋＤａの限外濾過遠心分離用チューブを用いて限外濾過し、次いでカラムクロマトグラフィーにより分離し精製してヘパリン由来オリゴ糖を得るステップ、及び
（２）ステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖を１〜１２時間６０℃〜１２０℃において硫酸化試薬で硫酸化して硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得るステップを含む。

本発明の調製法を利用して、様々な硫酸化度の硫酸化オリゴ糖を得ることができる。硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖のそれぞれの糖鎖は、その非還元末端におけるヘパリナーゼによる酵素分解の除去反応から生じた二重結合を含有する。その構造中に二重結合が存在するため、オリゴ糖は約２３２ｎｍでの紫外線領域中に強い吸収ピークがあり、ヘパリン由来オリゴ糖の定性及び定量決定に非常に都合よく利用することができる。二重結合は、ヘパリン由来オリゴ糖の硫酸化中は実質的に変化しない。ヘパリン自体には強く特徴的な吸収ピークはなく、したがってヘパリン物質は単にＤＭＢ染色等によって検出することはできるが、しかしながら低い感受性を有し複合系に順応し得ない。このように、二重結合の存在によってヘパリン由来オリゴ糖及びその誘導体の検出が非常に容易になり、生物学的代謝プロセスの検出においても重要な役割を果たし得る。

第３の態様では、本発明は、抗腫瘍転移用医薬品の製造における、第１の態様において記載した硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の使用を提供する。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖は、ヘパラナーゼ及び腫瘍転移に対する優れた阻害活性を有し、腫瘍の治療用の抗腫瘍医薬品の製造用、並びに腫瘍転移の予防及び阻害用の抗腫瘍薬物として、又は抗腫瘍活性成分として使用することができる。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖において、様々なスルホン化度のヘパリン由来六糖、ヘパリン由来八糖及びヘパリン由来十糖は、いずれも有意な阻害活性を有する。同じスルホン化度では、異なる鎖長がヘパラナーゼに対する異なる阻害活性をもたらし、阻害活性レベルは、詳細にはスルホン化ヘパリン由来六糖＜スルホン化ヘパリン由来十糖＜スルホン化ヘパリン由来八糖である。同じ鎖長では、ヘパリン由来オリゴ糖の異なる硫酸化度がヘパラナーゼに対する異なる阻害活性をもたらし、詳細には低硫酸化（１０〜４０％）ヘパリン由来オリゴ糖＜高硫酸化（６０〜９０％）ヘパリン由来オリゴ糖＜中硫酸化（４０〜６０％）ヘパリン由来オリゴ糖である。硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の構造中、グリコシルアミン中の６位におけるスルホン化及びグリコシルアミン中の３位におけるスルホン化が、よりヘパラナーゼ阻害活性に貢献する。

従来技術と比較して、本発明は以下の有利な効果を得る。

本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖はヘパラナーゼ及び腫瘍転移に対する優れた阻害活性を有し、短い糖鎖及び低分子量を含み、抗凝固活性は全くなく、抗凝固活性及び出血リスクはない。本発明の調製法は、ｉｎｖｉｔｒｏでのヘパラナーゼに対する高い阻害活性、ヘパリンの活性より４〜５倍高い細胞接着及び移動に対する阻害活性、及びヘパリンの活性より２〜３倍高いマウスにおけるｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍転移活性を有し、したがって優れた抗腫瘍転移効果及び高い特異性を有する、硫酸化度が制御可能な硫酸化オリゴ糖を調製することができる。

本発明の実施例１におけるＢｉｏ−ＧｅｌＰ−１０（２．５×１００ｃｍ）クロマトグラフィー用カラムによるヘパリン由来オリゴ糖の分離の結果を示すグラフである。本発明の実施例１における同一重合度を有するヘパリン由来オリゴ糖の分子量分布を示すグラフである。本発明の実施例１において得たヘパリン由来十糖のＵＰＬＣ−ＭＳにおける全体イオンスペクトルである。本発明の実施例１において得たヘパリン由来十糖のＵＰＬＣ−ＭＳにおける全体イオンスペクトル（一部分）、及び対応するピークの属性である。ヘパリン由来八糖（Ａ）及び４０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖（Ｂ）のＨＳＱＣスペクトル及び対応する一次元水素スペクトルを示す図である（δＨｐｐｍ６．１〜３．１６５／δＣｐｐｍ１１２〜５２．６）。ヘパラナーゼに対する硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の阻害活性の結果を示すグラフである。ＨｅＬａ細胞の細胞接着に対する硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の阻害活性の結果を示すグラフである。ＨｅＬａ細胞の細胞移動に対する硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の阻害活性の結果を示すグラフである。

本発明の技術的解決策を、以下の具体的実施形態によりここで更に例証する。当業者によって理解され得るように、実施例は単に本発明の理解を助長するために与えられ、本発明に関して限定的であると考えるべきではない。

実施例１．ヘパリン由来オリゴ糖の調製
２４ｇのヘパリンを採取し、２４０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液を加え、それを攪拌して溶かし、４８０ＩＵのヘパリナーゼＩを加え、均質状態まで攪拌し、１６時間１０℃で酵素反応を施した。反応が終了した後、反応混合物を６分間の不活性化のため９５℃まで加熱し、１０ｋＤａの限外濾過遠心分離用チューブを用いて限外濾過した。Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−１０（２．５×１００ｃｍ）クロマトグラフィー用カラム及び溶離剤として０．２ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３を用いて濾過物を分離し、１．７５〜２．１５倍のカラム体積分画を回収しヘパリン四糖混合物を得て、１．３５〜１．７５倍のカラム体積分画を回収しヘパリン由来六糖混合物を得て、１．０５〜１．３５倍のカラム体積分画を回収しヘパリン由来八糖混合物を得て、０．８５〜１．０５倍のカラム体積分画を回収しヘパリン由来十糖混合物を得て、０．７５〜０．８５倍のカラム体積分画を回収しヘパリン由来十二糖混合物を得た。ロータリーエバポレーションによりＮＨ_４ＨＣＯ_３を除去した後、対応するヘパリン由来オリゴ糖を凍結乾燥によって得た。

Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−１０（２．５×１００ｃｍ）クロマトグラフィー用カラムによるヘパリン由来オリゴ糖の分離を示すグラフである図１中に示したように、Ｐ１０カラムによる分離後、ヘパリン由来オリゴ糖は異なる分子量に基づき異なるピークに分離されることを見ることができ、ピークの先端で分画を回収することによって異なる重合度を有するオリゴ糖を得ることができる。

図２は、同一重合度を有する得られたヘパリン由来オリゴ糖の分子量分布を示す。オリゴ糖の分子量分布ピークは急激で対称的であることをグラフから見ることができ、オリゴ糖の分子量分布は狭い範囲内にあったことを示し、一方で分子量分布は十二糖から四糖に徐々に減少し、これらのオリゴ糖が品質要件に見合うことを示した。

ヘパリン由来オリゴ糖の構造をＵＰＬＣ−ＭＳ等の手段によって特徴付けし検証した。例えば、図３は本発明中で得たヘパリン由来十糖のＵＰＬＣ−ＭＳにおける全体イオン質量スペクトルであり、図４はヘパリン由来十糖の全体イオンスペクトルにおける対応するピークの属性を示すグラフであり、（ｘ、ｙ及びｚの具体的な値をグラフ中に与える）ΔＵｘ、ｙ、ｚにおいて、ｘはオリゴ糖鎖中の糖単位の数を表し、ｙはオリゴ糖鎖中のスルホン基の全数を表し、ｚはオリゴ糖鎖中のアセチル基の全数を表し、ＬＲは連結領域を表す。図４中の構造属性によれば、ヘパリン由来十糖中、オリゴ糖は大部分がヘパリン由来十糖であり、わずか一部分のみが高硫酸化ヘパリン由来八糖である。前述の特徴結果は、オリゴ糖の調製は成功であり純度要件に見合うことを示す。

実施例２．２０％〜８０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製
０．５４ｇのヘパリン由来オリゴ糖の出発物質を計量し、反応フラスコに移し、２５ｍＬの無水ＤＭＦを加え、攪拌して溶かした。攪拌しながら、０．８６ｇの（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３を計量し、前述の溶液に徐々に加え、１０分間攪拌した。反応フラスコには適切にキャップを付け、油浴中に８０℃で置き４時間攪拌した。室温まで冷却放置する前に反応を停止させた。固体は９０ｍＬの精製水中に溶かし、ｐＨは２ＭのＮａＯＨでほぼ中性に調節した。１００〜５００Ｄａの分子量カットオフがある透析用バッグに溶液を移し、３日間の透析後、ＢａＣｌ_２を用いて透析物を検出し、多量のサルフェートラジカル（ｓｕｌｆａｔｅｒａｄｉｃａｌｓ）がその中に存在するかどうか決定した。存在しない場合、最初にｐＨを２ＭのＮａＯＨで中性に調節し、ロータリーエバポレーターで約１０ｍＬに濃縮した。混合物はＰ２カラムに充填し、精製水で溶出し、溶出液はフラクションコレクターを用いて回収した。２３２ｎｍにおける吸光度を検出してヘパリン由来八糖誘導体の位置を決定し、回収した溶液はＢａＣｌ_２を用いて検出して多量のサルフェートラジカルがその中に存在するかどうか決定し、ヘパリン由来八糖硫酸化誘導体の無塩分画を回収した。この物質を約１０ｍＬに濃縮し、Ｄｏｗｅｘ陽イオン交換カラムに充填し、精製水で溶出し、溶出液はフラクションコレクターを用いて回収し、２３２ｎｍにおける吸光度を検出してヘパリン由来八糖誘導体の位置を決定した。ヘパリン由来八糖誘導体を含む分画を回収し、０．１Ｍ高純度ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ７．０に慎重に調節し、濃縮し凍結乾燥して２０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得た。

０．５４ｇのヘパリン由来オリゴ糖の出発物質に関して、表１中に示したように反応の出発物質における（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３の供給量を調節すること、及び反応温度と反応時間を調節することによって、制御可能な形式で、示した硫酸化度を有するヘパリン由来オリゴ糖を得ることができる。

例えば、以下に示したような反応条件及び供給量の調節によって、対応する硫酸化度を有するヘパリン由来オリゴ糖を得ることができる。

（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３の量を１．６７ｇに調節し、反応温度は９０℃に調節し、反応時間は４時間に調節し、残りの手順は同一で、４０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得た。

（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３の量を３．３４ｇに調節し、反応温度は９０℃に調節し、反応時間は６時間に調節し、残りの手順は同一で、６０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得た。

（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３の量を５．０１ｇに調節し、反応温度は１００℃に調節し、反応時間は８時間に調節し、残りの手順は同一で、８０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得た。

図５は、ヘパリン由来八糖（Ａ）及び４０％硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖（Ｂ）のＨＳＱＣスペクトル及び対応する一次元水素スペクトルを示す（δＨｐｐｍ６．１〜３．１６５／δＣｐｐｍ１１２〜５２．６）。硫酸化反応後、ヘパリン由来八糖のシグナルピークが有意に変化し、天然ヘパリンと異なる構造の存在を示す多くの新たなシグナルが存在することをグラフから見ることができ、これは硫酸化誘導体の予想と一致する。

実施例３．４０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖のヘパラナーゼ阻害活性
硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖のヘパラナーゼ阻害活性を、参照文献［ＨａｍｍｏｎｄＥ，ＬｉＣＰ，ＦｅｒｒｏＶ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙｆｏｒｈｅｐａｒａｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｋｉｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１；３９６：１１２−１１６］中に記載された方法で決定した。詳細には、実験手順は以下の通りであった。

試験群の反応溶液は、４０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、１００ｍＭのフォンダパリヌクス、及び特定濃度の硫酸化ヘパリン由来八糖を含んでおり、対照群の反応溶液中では、硫酸化ヘパリン由来八糖の濃度と同じＳＳＴ０００１対照に硫酸化ヘパリン由来八糖を置き換えた。試験群又は対照群の反応溶液１００μＬを９６ウエルプレート中の各ウエルに加え、ヘパラナーゼを１４０ｐＭの最終濃度までそれぞれ加えて反応を開始した。９６ウエルプレートはテープで密封し、３７℃で２〜２４時間インキュベートした。反応が終了した後、０．１ＭＮａＯＨ中１．６９ｍＭＷＳＴ−１を含有する溶液１００μＬを加えて反応を停止させた。９６ウエルプレートを再度密封し、６０℃で６０分間インキュベートした。室温まで冷却した後、５８４ｎｍにおける吸光度値を測定した。作用物質の阻害率は以下の方法に従い計算した：
阻害率＝（１−試料の吸光度値／対照の吸光度値）×１００％

前述の方法に従い測定した硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖のヘパラナーゼ阻害活性を図６中に示す。ヘパラナーゼに対する４０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−４０％）の半数最大阻害濃度（ＩＣ５０）は４３ｎｇ／ｍＬであり、ヘパラナーゼに対する６０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−６０％）の半数最大阻害濃度（ＩＣ５０）は５７ｎｇ／ｍＬであったことをグラフから見ることができる。

実施例４．２０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖の細胞接着アッセイ
この実施例中では、以下の方法を利用して２０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖の細胞接着を決定した。

（１）基底膜のコーティング：それぞれ滅菌２回蒸留水で２溶液を調製し、１０ｇ／ＬのＢＳＡ（１％）、及び５０ｍｇ／Ｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、１：８希釈、マトリゲルはそれぞれ５０μＬ／ウエルで９６ウエル培養プレートに加え、４℃で一晩インキュベートした；

（２）基底膜の水和：残留液を培養プレートから吸引し、１０ｇ／ＬのＢＳＡを含有する５０μＬの無血清培地を各ウエルに加え、３７℃で３０分間放置した。

（３）細胞の調製：正常培養したＨｅＬａ細胞を採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞は（薬剤を加えず対応する体積のＰＢＳのみ加えた）対照群と（ヘパリンと硫酸化ヘパリン由来八糖をいずれも６２．５μｇ／ｍＬの濃度で加えた）試験群に分け、２４時間培養した。

（４）細胞の接種：ステップ（３）中で２４時間正常培養した又はヘパリン／ＨＳオリゴ糖誘導体を用いて処理した腫瘍細胞を採取し、０．５ｍＬのパンクレアチンで消化する前にＰＢＳで３回洗浄した。消化は注意深くモニタリングし、消化後、５ｍＬの培養培地を加え、細胞は全体ピペッティングにより分散させ単細胞懸濁液を形成した。細胞を計数し、細胞懸濁液の濃度を計数結果に従い調節して１ｍＬあたり１０^５個細胞の細胞密度を得た。細胞懸濁液はマトリゲルをコーティングした９６ウエル培養プレートにウエルあたり１００μＬ接種し、試料は三連で処理した；

（５）細胞の培養：細胞を３７℃において１時間二酸化炭素インキュベーター内で培養し、各ウエル中の培養液を廃棄した後ＰＢＳで１回洗浄した。次いでウエルあたり２００μＬの新たな培養培地を加え、プレートを観察し写真撮影した。

（６）検出：１０μＬのＣＣＫ−８色素溶液を各ウエルに加え、プレートは３７℃において３時間二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートし、多機能性マイクロプレートリーダーで読み取った。ヘパリン対照群を参照として、阻害率を以下の式に従い計算した。
阻害率＝（１−処理群の吸光度値／対照群の吸光度値）×１００％

前述の方法に従うと、ＨｅＬａ細胞接着に対するヘパリンの阻害率は８．３％であり、ＨｅＬａ細胞接着に対する２０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−２０％）の阻害率は４５．３％であり、ＨｅＬａ細胞接着に対する６０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−６０％）の阻害率は３７．９％であった。

実施例５．４０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖の細胞移動アッセイ
この実施例中では、以下の方法により４０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖で細胞移動を測定した。
（１）試験前に、トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）チャンバーを２４ウエルプレート中に置き、６００μＬのＤＭＥＭ液体培地を下部チャンバーに加え、１００μＬのＤＭＥＭ液体培地を上部チャンバーに加え、チャンバーは更なる使用のためインキュベーター内に一晩放置した；
（２）細胞の調製：対数増殖期中のＨｅＬａ細胞を採取し、パンクレアチンで消化し、細胞濃度を計算し、細胞は（ヘパリン又はヘパリン由来オリゴ糖を加えず対応する体積のＰＢＳのみ加えた）対照群と（ヘパリンと硫酸化ヘパリン由来八糖をいずれも６２．５μｇ／ｍＬの濃度で加えた）試験群に分けた。２．５％ＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ培地及び対応するヘパリン由来オリゴ糖を含有する無血清、２．５％ＢＳＡＤＭＥＭ培地で細胞を希釈し、細胞濃度を１ｍＬあたり２．５×１０^５個細胞に調節した。
（３）５％ＦＢＳを含有する８００μＬの培養培地をトランスウエルチャンバーの下部チャンバーに加えた。
（４）ステップ（２）中の４００μＬの細胞懸濁液をトランスウエルチャンバーの上部チャンバーに加えた。
（５）チャンバーを８時間５％ＣＯ_２下で３７℃において、インキュベーター内でインキュベートした。
（６）上部チャンバー中の液体を注意深く除去し、チャンバー膜の内部表面をコットンスワブで軽く拭いて非移動細胞を除去した。チャンバー膜の損傷を回避するため、作業は穏やかでなければならないことに留意しなければならない。
（７）４００μＬの細胞染色液を含有する別の２４ウエルプレートにチャンバーを移し、細胞は１０分間室温で染色した。
（８）トランスウエルチャンバーを蒸留水で３〜５回軽く洗浄し、自然乾燥させるため室温で放置した。
（９）細胞は顕微鏡下で計数し写真撮影した。
（１０）別のクリーンな２４ウエルプレートにチャンバーを移し、２００μＬの細胞溶解液を各ウエルに加え、チャンバーはシェーカー上に置いた。
（１１）室温で１０分間のインキュベーション後、１００μＬの細胞溶解液を９６ウエルプレートに加え、吸光度値を５６０ｎｍで読み取った。ヘパリン対照群を参照として、移動率及び阻害率を以下の式に従い計算した：
移動率＝処理群の吸光度値／対照群の吸光度値×１００％
阻害率＝［１−（処理群の接着率／対照群の接着率）］×１００％

前述の方法に従った細胞接着の結果は図７中に示し、ＨｅＬａ細胞移動に対するヘパリンの阻害率は１２．６％であり、ＨｅＬａ細胞移動に対する４０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−４０％）の阻害率は５７．３％であり、ＨｅＬａ細胞移動に対する６０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−６０％）の阻害率は４３．５％であることを示す。

実施例６．４０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖の抗腫瘍転移活性
この実施例中では、以下の方法に従い４０％及び６０％硫酸化ヘパリン由来八糖の抗腫瘍転移活性を決定した。

Ｂ１６−ＢＬ６マウスメラノーマ細胞（２×１０^５個）を、尾静脈を介してＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、マウスは、群あたり１０マウスで、（ヘパリン由来オリゴ糖を加えず対照としてＰＢＳを利用した）対照群と（それぞれのマウスに２００μｇ、４０％硫酸化ヘパリン由来八糖を加えた）試験群に分けた。３週間後、マウスを解剖し、マウスの肺をブアン液中に固定し、マウスの肺中の腫瘍の数を計算した。本発明者らは、ルシフェラーゼ標識Ｂ１６−ＢＬ６マウスメラノーマ細胞を利用することによりＩＶＩＳ−２００蛍光イメージングシステムを介して、週に１回転移性腫瘍の形成を検出した。２．５ｍｇフルオレセインの腹腔内注射後１０分で写真を撮影した。

前述の方法に従った抗腫瘍転移活性の結果は図８中に示す。マウスにおける腫瘍転移に対するヘパリンの阻害率は１７．３％であり、マウスにおける腫瘍転移に対する４０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−４０％）の阻害率は６５．１％であり、マウスにおける腫瘍転移に対する６０％硫酸化ヘパリン由来八糖（Ｈｅｐ８−６０％）の阻害率は５６．２％であることをグラフから見ることができる。

ここで本出願人は、本発明における前述の実施例は、本発明の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖、その調製法及び使用を例証するために提供するが、本発明は前述の実施例に限定されない、すなわち、本発明が実現を前述の実施例に依存しなければならないことを意味するわけではないことを言及する。本発明に対する任意の変更、本発明における利用材料の同等の交換及び補助成分の追加、並びに具体的実施形態の選択等は、本発明の保護及び開示範囲内にあり得ることは、当業者によって理解されるはずである。

Claims

硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖分子がその非還元末端にヘパリナーゼによる酵素分解から生じた不飽和二重結合を含有し、ウロン酸誘導体及びグリコシルアミン誘導体を含み、式Ｉ：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_ａ、Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃ及びＲ_ｄが独立してＳＯ_３ ⁻又はＨであり、Ｒ_ｘ’、Ｒ_ｙ’及びＲ_ｚ’が独立してＣＯＣＨ_３又はＳＯ_３ ⁻であり、ｎが１〜３である）
によって表される構造を有することを特徴とする、硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖。
式Ｉ中、各二糖単位内のスルホン基の数が平均２以上であり、各二糖単位内のアセチル基の数が平均０．５以下であり、各二糖単位内グルコサミン中６位及び３位におけるスルホン基の数がいずれも平均０．５以上であり、
式Ｉ中のウロン酸がグルクロン酸又はイズロン酸であることが好ましく、
式Ｉ中に含有されるカルボキシル及び／又はスルホン基と塩を形成する陽イオンがＮａ^＋、Ｋ^＋又はＣａ^２＋からなる群から選択されることが好ましいことを特徴とする、請求項１に記載の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖。
以下の構造を有する化合物：
ＤＰ６、ヘパリン由来六糖誘導体：
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ＤＰ８、ヘパリン由来八糖誘導体：
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ＤＰ１０、ヘパリン由来十糖誘導体：
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ３Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_ＮＳ６Ｓ−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
ΔＵ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｉ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}−Ｇ_２Ｓ３Ｓ−Ａ_{ＮＳ３Ｓ６Ｓ}
のいずれか１つである、又はその少なくとも２つの組合せであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖。
以下のステップ：
（１）ヘパリナーゼでヘパリンを分解し、分離し精製してヘパリン由来オリゴ糖を得るステップ、及び
（２）ステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖を硫酸化試薬で硫酸化して硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得るステップを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の調製法。
ステップ（１）中のヘパリナーゼがヘパリナーゼＩであることを特徴とする、請求項４に記載の調製法。
ステップ（１）においてヘパリナーゼでヘパリンを分解するとき、バッファー、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０を加える必要があり、
ステップ（１）中で加えるヘパリナーゼの量が１５〜２５ＩＵ／ヘパリン１ｇ、好ましくは１８〜２３ＩＵ／ヘパリン１ｇであることが好ましく、
ステップ（１）中のヘパリナーゼによるヘパリン分解に関する温度が４℃〜３７℃、好ましくは８℃〜２５℃であることが好ましく、
ステップ（１）中の分解に関する時間が８〜２４時間、好ましくは１０〜２０時間であることが好ましく、
ステップ（１）中のヘパリナーゼによるヘパリンの分解が、分解後に５〜１０分間、好ましくは５〜８分間、及びより好ましくは６分間、９５℃での不活性化を含むことが好ましく、
ステップ（１）中の分離が限外濾過、好ましくは１０ｋＤａの限外濾過遠心分離用チューブを用いた限外濾過を含むことが好ましく、
ステップ（１）中の精製がカラムクロマトグラフィーによる分離及び精製であることが好ましいことを特徴とする、請求項４又は５に記載の調製法。
ステップ（２）中の硫酸化の前に、ステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖に膨張処理を施し、
膨張処理に使用する溶媒がＤＭＦであることが好ましいことを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の調製法。
ステップ（２）中の硫酸化試薬が（ＣＨ_３）_３Ｎ・ＳＯ_３であり、
ヘパリン由来オリゴ糖１ｇに対して、硫酸化試薬の量が１〜１０ｇであることが好ましく、
ステップ（２）中の硫酸化に関する温度が６０℃〜１２０℃であることが好ましく、ステップ（２）中の硫酸化に関する時間が１〜１２時間であることが好ましいことを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の調製法。
以下のステップ：
（１）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０であるバッファー内で８時間〜２４時間４℃〜３７℃において、１５〜２５ＩＵ／ヘパリン１ｇの量で加えるヘパリナーゼＩでヘパリンを分解し、分解後に５〜１０分間９５℃で不活性化し、１０ｋＤａの限外濾過遠心分離用チューブを用いて限外濾過し、次いでカラムクロマトグラフィーにより分離し精製してヘパリン由来オリゴ糖を得るステップ、及び
（２）ステップ（１）中で得たヘパリン由来オリゴ糖を１〜１２時間６０℃〜１２０℃において硫酸化試薬で硫酸化して硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖を得るステップを含むことを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載の調製法。
抗腫瘍転移用医薬品の製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖の使用。