CN106349407A - 一种低分子量岩藻糖化硫酸软骨素及其制备方法和在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低分子量岩藻糖化硫酸软骨素及其制备方法和在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用,本发明通过海参酶解、强阴离子交换柱纯化和自由基降解,获得主链以β‑1,4‑D‑葡萄糖醛酸和β‑1,3‑D‑乙酰氨基半乳糖为二糖重复单元、支链为α‑1,3‑L‑岩藻寡糖硫酸酯的硫酸多糖。本发明经试验证明,所述的岩藻糖化硫酸软骨素对特鲁索综合征有明显的抑制作用。本发明提供的岩藻糖化硫酸软骨素具有原料来源丰富、制备工艺简单、容易产业化及产品安全性高、稳定性好及活性独特等优点,有开发成为抗特鲁索综合征药物的技术前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋药物领域,涉及一种低分子量岩藻糖化硫酸软骨素及其制备工艺和在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用。
背景技术
心脑血管血栓性疾病是人类健康的头号杀手,随着人们生活水平的提高,其发病率也在逐年提高,并且呈现年轻化的趋势。据美国心脏协会(AHA)2016年学术年会报道,2003至2013年间,每年因疾病死亡的患者中,约有1/3死于心脑血管疾病。我国每年大约有200万人死于心脑血管疾病,并有超过300万人需要进行溶栓治疗。恶性肿瘤是造成当今社会人类死亡的第二病因。世卫组织在《全球癌症报告》中指出,2015年全球癌症新发病例1950.9万,死亡1042.2万,中国分别占22%(429万)和27%(281.4万),预计未来20年的新增病例将上升到2200万。血栓及癌症给人类健康造成了巨大威胁,并严重阻遏了社会和经济发展。
自1865年Trousseau首次提出癌症病人有自发凝血倾向以来,肿瘤诱导的血液高凝状态在很多癌症中被发现,这一现象被称为“特鲁索综合征(Trousseau’s syndrome)”。包括凝血系统的过渡活化和纤维蛋白凝块的形成(血栓生成)在内的凝血系统的功能紊乱可以看作肿瘤的第一表征。大量文献和临床病例表明,癌细胞可以促进凝血,导致血液呈现高凝状态,该状态随着肿瘤不断恶化而逐渐加剧。肿瘤细胞在血行转移的过程中会分泌与凝血相关的因子进入血液,从而引起凝血,而肿瘤自身介导的高凝血状态也可以促进肿瘤的增殖和转移。因此,肿瘤和血栓之间不是简单的因果关系, 二者在肿瘤形成和发展中可以相互促进和影响。可见,寻找具有抗血栓和抗肿瘤双重作用的药物是肿瘤治疗的一个新方向。
目前,低分子量肝素是有效预防和治疗血栓性疾病,以及由于手术、放疗、化疗破坏了机体的凝血系统造成的癌症相关血栓性疾病的常用药物,但由于有较大的出血副作用和近年来发生的肝素污染事件,限制了其临床应用,因此,寻找一种有效、安全的肝素替代物,是目前亟需解决的问题。
来源于海洋的硫酸多糖具有各种生物活性,已经成为本世纪生化药物研究开发的热点之一。海参岩藻糖化硫酸软骨素是一种天然、无污染的酸性粘多糖,虽然来源不同,但分子中一般均含有以β-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖为重复二糖单元组成的主链及α-1,3-L-岩藻寡糖硫酸酯支链,该多糖具有抗凝、抗血栓及抗肿瘤等活性。
在岩藻糖化硫酸软骨素提取分离和制备方面的文献和专利较多,如:中国专利申请(公开号CN102993327A)和中国专利申请(公开号CN101624426A)均公开了酶解提取岩藻糖化硫酸软骨素的方法,但是产物分子量高,结构不明确,生物利用度低。通过物理或化学方法对岩藻糖化硫酸软骨素进行解聚,可以得到低分子量的岩藻糖化硫酸软骨素,并能降低岩藻糖化硫酸软骨素的出血副反应并提高其生物利用度,如:中国专利申请(公开号CN103285031A)公开了一种自由基降解制备低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的方法,但该方法反应体系酸碱度不稳定,容易引起支链岩藻寡糖酸水解,造成岩藻糖硫酸酯含量降低,从而降低各种生物活性。虽然中国专利(公开号CN101057859A和公开号CN104147040A)公开了岩藻糖化硫酸软骨素在制备抗血栓药物中的应用,但是关于低分子量岩藻糖化硫酸软骨素在抗特鲁索综合征(Trousseau’s syndrome)方面的研究和应用还未见相关报道。
发明内容
针对现有技术制备低分子量岩藻糖化硫酸软骨素中存在的问题及在制备抗特鲁索综合征药物中应用的空白,本发明的目的在于提供了一种低分子量岩藻糖化硫酸软骨素及其制备方法和在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用。本发明具有所用各种海参具有来源丰富、低分子量岩藻糖化硫酸软骨素制备工艺简便、生产成本低、化合物结构明确的优点,且有良好的缓解特鲁索综合征的作用。
为实现上述发明目的,本发明采用下述技术方案予以实现:
本发明提供了一种低分子量岩藻糖化硫酸软骨素,它的化学结构式如式(Ι)所示:
(Ι)
R1=H 或 SO3Na;R2= SO3Na 或H;R3= SO3Na 或H;R4= SO3Na或 H;
R5=H或 SO3Na; m=0-5;n=2-20;
所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素是以β-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖为二糖重复单元组成的主链、以α-1,3-L-岩藻寡糖硫酸酯为支链的硫酸多糖;在主链β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖的C6和/或C4发生硫酸酯化形成主链,在岩藻糖的C2,4或C3,4位发生硫酸酯化形成作为支链的岩藻寡糖硫酸酯。
进一步的,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素中葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:岩藻糖的摩尔比=1:1:1~5。
进一步的,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的硫酸根含量为20% ~ 40%,重均分子量为2 ~30 kD。
本发明还提供了所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的制备方法,它包括以下步骤:
(1) 取干海参,匀浆,脱脂后,加入0.05~0.25 mol/L碱溶液,于50~70 ℃搅拌反应;
室温冷却后,加入盐酸中和,搅拌下加入木瓜蛋白酶、Na2EDTA溶液和半胱氨酸溶液,于50~70 ℃搅拌反应;
离心取上清液,加入乙醇,后离心收集沉淀并用乙醇和无水乙醇洗涤,烘干;
取干燥后样品,加入水溶解,加入碱溶液调pH至9~10,滴加H2O2,于30~50 ℃脱色;
反应液冷却后,加入盐酸调 pH至1~2,离心去除沉淀;
加入乙醇至醇含量为30~80%,再加入乙酸钾至终浓度为1~3 mol/L,静置过夜;
离心收集沉淀,水溶解后透析,透析液浓缩、冻干,得到粗多糖;
(2)将(1)所得粗多糖溶于水中,以氯化钠水溶液为流动相,经过强阴离子交换树脂分离,得到纯化的岩藻糖化硫酸软骨素;
(3)将(2)所得岩藻糖化硫酸软骨素溶于溶液中,加入CuAc2至终浓度为0.5~2 mmol/L,滴加H2O2溶液,35~50 ℃水浴中搅拌反应,不断滴加碱溶液使反应体系保持pH=6~8;降解完成后,加入Na2EDTA溶液终止降解反应;再加入无水乙醇,静置过夜,离心,收集沉淀,复溶后透析;
(4)将(3)所得透析液浓缩后,以NH4HCO3溶液为流动相,经过凝胶渗透色谱柱纯化,硫酸-苯酚法检测,收集含糖组分,经减压旋转蒸发除掉碳酸氢铵,用蒸馏水将样品溶出,冻干,得纯化的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素。
进一步的:所述步骤(1)中加入占干海参质量0.5~2.5%的木瓜蛋白酶、浓度为1~10 mmol/L的Na2EDTA溶液和浓度为1~10 mmol/L的半胱氨酸溶液。
进一步的:所述步骤(4)中NH4HCO3溶液的浓度为0.1~0.2 mol/L 。
本发明还提供了所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用。
进一步的,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制肺癌小鼠肿瘤的生长。
进一步的,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制肺癌小鼠肿瘤的肺部转移。
进一步的,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能有效缓解肺癌小鼠血浆的高凝状态。
与现有技术相比,本发明的优点及有益效果是:
1、本发明制备的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素产品具有来源丰富、无污染等诸多优点,并且在动物水平都具有较好的缓解特鲁索综合征的作用,为该类药物的开发提供了新的途径。
2、本发明制备的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤的生长,在给药剂量为20 mg/kg时,抑制率为48.6%。
3、本发明制备的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤的肺部转移,在给药剂量为20 mg/kg时,抑制率为69.1%。
4、本发明制备的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能有效缓解Lewis肺癌小鼠血浆的高凝状态,在给药剂量为1 mg/kg时,Lewis肺癌小鼠血浆的凝血时间延长至50 s(模型组为22 s);当给药剂量达到20 mg/kg时,荷瘤小鼠血浆的高凝状态得到明显改善,凝血时间延长至78 s(正常组为83 s)。
5、本发明提供的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素具有制备工艺简单、结构明确,容易大量制备、水溶性强、稳定性高和无毒副作用等优点,且在动物水平具有显著缓解特鲁索综合征的作用,有开发成抗特鲁索综合征药物的前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后,本发明的其他优点和特点将变得更加清晰。
附图说明
图1为本发明中不同剂量低分子量岩藻糖化硫酸软骨素对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的抑制作用,其中,CTX:阳性对照组。
图2为本发明中不同剂量低分子量岩藻糖化硫酸软骨素对Lewis肺癌小鼠肿瘤肺部转移的抑制作用,其中,CTX:阳性对照组。
图3为本发明中不同剂量低分子量岩藻糖化硫酸软骨素对Lewis肺癌小鼠血浆凝血时间的影响,其中,N:正常组;M:模型组;CTX:阳性对照组。注:##P<0.01,与正常组比;**P<0.01,与模型组比。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明。
本发明采用酶解提取和自由基降解方法获得所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素,并试验其在抗特鲁索综合征药物制备中的应用。
本发明通过碱处理、酶解、乙醇沉淀、过氧化氢脱色、酸沉除蛋白、乙酸钾沉淀、透析、Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱分离、自由基降解和Sephacryl S-300凝胶渗透色谱柱纯化制备得到低分子量岩藻糖化硫酸软骨素,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素是以β-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖(即[®4GlcAβ1®3GalNAcβ1®])为重复二糖单元组成的主链、以α-1,3-L-岩藻寡糖硫酸酯为支链的硫酸多糖(FCS)。其中乙酰氨基半乳糖主要在C6、C4和C4,6位发生硫酸化取代,而岩藻糖主要在C2,4位或C3,4位发生双硫酸化取代。该岩藻糖化硫酸软骨素中葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:岩藻糖=1:1:1~5(摩尔比),硫酸根含量为20%~40%,重均分子量为2~30 kD。
该低分子量岩藻糖化硫酸软骨素(LMFCS)可以从北大西洋海参(Cucumaria frondosa)、日本刺参(Stichopus japonicus)、仿刺参(Apostichopus japonicus)、墨西哥海参(Holothuria mexicana )、挪威红参(Stichopus tremulus)、美国肉参(Isostichopus badionotus)、 墨西哥刺参(Isostichopus fuscus )或梅花参(Thelenota ananas)中制备得到。
实施例1:低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的制备
1、取北大西洋干海参100 g,匀浆,脱脂后,加入0.1 mol/L NaOH溶液,于50 ℃搅拌反应3 h;
室温冷却后,加入盐酸中和,搅拌下加入500 mg 木瓜蛋白酶、5 mmol/L Na2EDTA溶液和 5 mmol/L半胱氨酸溶液,于50 ℃搅拌反应12 h;
合并提取液,加入3倍体积的95%乙醇沉淀,离心,沉淀用95%乙醇和无水乙醇洗涤3次,于60 ℃烘干;
取干燥后样品,加入适量水溶解,加入0.1 mol/L KOH溶液调pH至9,滴加30% H2O2,30℃脱色2 h;
反应液冷却后,加入盐酸调 pH至1~2,离心去除沉淀;
加入95%乙醇至醇含量为50%,再加入乙酸钾至终浓度为2 mol/L,4 ℃静置过夜;
次日离心收集沉淀,沉淀复溶后透析(截留分子量7000 Da),透析液浓缩、冻干,得到粗多糖。
2、将步骤1所得粗多糖溶于水中,以2mol/L的氯化钠水溶液为流动相,经过Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换树脂分离,硫酸-苯酚法检测,得纯化岩藻糖化硫酸软骨素(FCS)。
3、将步骤2所得岩藻糖化硫酸软骨素溶于5% H2O2溶液中,加入CuAc2至终浓度为0.5~2 mmol/L,以0.5 mL/min的速度持续滴加5% H2O2溶液,35 ℃水浴中搅拌反应,不断滴加1 mol/L NaOH溶液使反应体系保持pH=7。反应3 h后,加入20 mmol/L Na2EDTA溶液终止反应。加入3倍体积无水乙醇,4 ℃静置过夜。次日离心,沉淀复溶后透析(截留分子量2000Da)。
4、将步骤3所得透析液浓缩后,以0.2 mol/L NH4HCO3溶液为流动相,经过Sephacryl S-300凝胶渗透色谱柱纯化,硫酸-苯酚法检测,收集糖组分,经减压旋转蒸发除掉碳酸氢铵,用适量蒸馏水将样品溶出,冻干,得纯化低分子量岩藻糖化硫酸软骨素(LMFCS)。
(Ι)
本实施例中制备的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素如式(Ι)所示,是以β-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖为重复单元组成的主链、并以α-1,3-L-岩藻寡糖硫酸酯为支链的多糖。主链中乙酰氨基半乳糖C6位硫酸化取代占44.0%,支链中岩藻糖C3,4位和C2,4位双硫酸化取代分别是41%和39%。该岩藻糖化硫酸软骨素中葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:岩藻糖=1:1:2(摩尔比),硫酸根含量为33%,重均分子量为2~30 kD。
实施例2:低分子量岩藻糖化硫酸软骨素抗特鲁索综合征作用
1、Lewis肺癌细胞体内传代:取对数生长期的 Lewis 肺癌细胞,0.25%的胰酶消化,用生理盐水调整为 1×107个/ml 的单细胞悬液,取 0.2 ml 接种于小鼠右腋窝皮下。接种10d,无菌条件下取 Lewis 肺癌实体瘤,按瘤块(g):生理盐水(ml)为 1:3 的比例制成单细胞悬液,取 0.2 ml(含瘤细胞 2×106)接种于 C57BL/ 6J 小鼠右腋窝皮下,体内传代十次。
2、动物模型的复制和实验:无菌条件下取体内传代十次的Lewis肺癌实体瘤,按瘤块(g):生理盐水(ml)为1:3的比例制成单细胞悬液,取0.2 ml (含瘤细胞 2×106)接种于C57BL/ 6J小鼠右腋窝皮下,接种次日,随机分为模型组(注射生理盐水)、阳性对照组(注射环磷酰胺(CTX),20 mg/kg)、LMFCS低剂量组(注射LMFCS,1 mg/kg)、LMFCS中剂量组(注射LMFCS,5 mg/kg)和LMFCS高剂量组(注射LMFCS,20 mg/kg),每组10只。注射体积为 0.2ml·(10g·bw)-1,每天 1 次,连续 21天。实验期间小鼠自由饮水和进食。
3、计算抑瘤率:
(1)以肿瘤瘤重为指标,计算各组的平均瘤重,并按公式计算LMFCS对各组小鼠肿瘤生长的抑制率,公式为:
生长抑制率=(1-剂量组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%
如图1所示,给予LMFCS治疗后,Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长受到显著抑制,当给药剂量为20 mg/kg时,抑制率为48.6%。说明低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。
(2)以肿瘤的肺部转移结节为指标,计算各组的平均结节数,并按公式计算LMFCS对各组小鼠肿瘤转移的抑制率,公式为:
转移抑制率=(1-剂量组平均转移灶数/模型组平均转移灶数)×100%
如图2所示,给予LMFCS治疗后,Lewis肺癌小鼠肿瘤向肺部转移受到显著抑制,当给药剂量为20 mg/kg时,抑制率为69.1%。说明低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的转移。
4、测定凝血时间:第21天,小鼠腹腔注射给药30 min后,将小鼠固定,使用毛细玻管在眼静脉丛取血,至毛细玻管内血柱达到5 cm后,开始计时,每隔15 s折断约0.5cm长的毛细玻管,检查毛细玻管内有无血凝丝出现。记录毛细玻管内出现血凝丝的时间,即为凝血时间(CT)。
如图3所示,接种肿瘤后,模型组(M)凝血时间与正常组(N)相比显著降低(P<0.01),说明肿瘤诱发小鼠出现高凝血状态。与模型组和阳性药(CTX)相比,给予LMFCS治疗后,荷瘤小鼠血浆的凝血时间显著延长(P<0.01),在给药剂量为1 mg/kg时,Lewis肺癌小鼠血浆的凝血时间延长至50 s(模型组为22 s);当给药剂量达到20 mg/kg时,荷瘤小鼠血浆的高凝状态得到明显改善,凝血时间延长至78 s(正常组为83 s)。说明低分子量岩藻糖化硫酸软骨素可以延长荷瘤小鼠血浆的凝血时间,缓解肿瘤诱发的高凝状态,具有抗特鲁索综合征的作用。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种低分子量岩藻糖化硫酸软骨素,其特征在于它的化学结构式如式(Ι)所示:
(Ι)
R1=H 或 SO3Na;R2= SO3Na 或H;R3= SO3Na 或H;R4= SO3Na或 H;
R5=H或 SO3Na; m=0-5;n=2-20;
所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素是以β-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖为二糖重复单元组成的主链、以α-1,3-L-岩藻寡糖硫酸酯为支链的硫酸多糖;在主链β-1,3-D-乙酰氨基半乳糖的C6和/或C4发生硫酸酯化形成主链,在岩藻糖的C2,4或C3,4位发生硫酸酯化形成作为支链的岩藻寡糖硫酸酯。
2.根据权利要求1所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素,其特征在于,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素中葡萄糖醛酸:乙酰氨基半乳糖:岩藻糖的摩尔比=1:1:1~5。
3.根据权利要求1所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素,其特征在于,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的硫酸根含量为20% ~ 40%,重均分子量为2 ~30 kD。
4.权利要求1或2或3所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的制备方法,其特征在于,它包括以下步骤:
(1) 取干海参,匀浆,脱脂后,加入0.05~0.25 mol/L碱溶液,于50~70 ℃搅拌反应;
室温冷却后,加入盐酸中和,搅拌下加入木瓜蛋白酶、Na2EDTA溶液和半胱氨酸溶液,于50~70 ℃搅拌反应;
离心取上清液,加入乙醇,后离心收集沉淀并用乙醇和无水乙醇洗涤,烘干;
取干燥后样品,加入水溶解,加入碱溶液调pH至9~10,滴加H2O2,于30~50 ℃脱色;
反应液冷却后,加入盐酸调 pH至1~2,离心去除沉淀;
加入乙醇至醇含量为30~80%,再加入乙酸钾至终浓度为1~3 mol/L,静置过夜;
离心收集沉淀,水溶解后透析,透析液浓缩、冻干,得到粗多糖;
(2)将(1)所得粗多糖溶于水中,以氯化钠水溶液为流动相,经过强阴离子交换树脂分离,得到纯化的岩藻糖化硫酸软骨素;
(3)将(2)所得岩藻糖化硫酸软骨素溶于溶液中,加入CuAc2至终浓度为0.5~2 mmol/L,滴加H2O2溶液,35~50 ℃水浴中搅拌反应,不断滴加碱溶液使反应体系保持pH=6~8;降解完成后,加入Na2EDTA溶液终止降解反应;再加入无水乙醇,静置过夜,离心,收集沉淀,复溶后透析;
(4)将(3)所得透析液浓缩后,以NH4HCO3溶液为流动相,经过凝胶渗透色谱柱纯化,硫酸-苯酚法检测,收集含糖组分,经减压旋转蒸发除掉碳酸氢铵,用蒸馏水将样品溶出,冻干,得纯化的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素。
5.根据权利要求4所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中加入占干海参质量0.5~2.5%的木瓜蛋白酶、浓度为1~10 mmol/L的Na2EDTA溶液和浓度为1~10 mmol/L的半胱氨酸溶液。
6.根据权利要求4所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中NH4HCO3溶液的浓度为0.1~0.2 mol/L 。
7.权利要求1所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用,其特征在于,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制肺癌小鼠肿瘤的生长。
9.根据权利要求7所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用,其特征在于,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能显著抑制肺癌小鼠肿瘤的肺部转移。
10.根据权利要求7所述的低分子量岩藻糖化硫酸软骨素在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用,其特征在于,所述低分子量岩藻糖化硫酸软骨素能有效缓解肺癌小鼠血浆的高凝状态。
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