CN109251255A

CN109251255A - 一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS hm及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109251255A
Application number: CN201710564187.1A
Authority: CN
Inventors: 李国云; 李芹英; 于广利; 蔡超; 郝杰杰; 蒋昊
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN109251255B

Abstract

本发明提供了一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm及其制备方法和应用。所述岩藻糖化硫酸软骨素的分子量为50~200 kDa，硫酸根含量为20~40%，其主链主要由硫酸软骨素A和硫酸软骨素E组成，所述FCS_hm主要由四种结构片段组成，且其侧链含有1~5个岩藻糖。所述FCS_hm通过内源性凝血途径发挥较好的抗凝血及抗血栓活性，与低分子量肝素类似，且对抗凝血酶III介导的FIIa和FXa均具有抑制作用。此外，所述FCS_hm还与成纤维细胞生长因子FGF1和FGF2具有较高的亲和力，存在抗血管生成作用。本发明提供的化合物制备工艺成本低、操作简单，容易产业化生产。

Description

一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCShm及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm及其制备方法和应用。

背景技术

岩藻糖化硫酸软骨素（Fucosylated chondroitin sulfate，FCS）是来源于海参体壁中的一种糖胺聚糖（GAG），是带有岩藻糖支链的天然酸性粘多糖。其主链结构由葡萄糖醛酸（GlcA）和乙酰氨基半乳糖（GalNAc）通过β-1,3/β-1,4糖苷键交替连接构成，GlcA在 C3位通过 α-1,3糖苷键连接岩藻糖（Fuc）支链，这是目前报道的绝大多数FCS的基本结构。中国专利（公开号：CN106349407A）公开了主链以β-1,4-D-GlcA和β-1,3-D-GalNAc为二糖重复单元、支链为α-1,3-L-岩藻寡糖硫酸酯的FCS在制备抗特鲁索综合征的药物中的应用。然而Fuc的连接位置并不固定，也有文献通过核磁手段证明Fuc通过α-1,6或α-1,4糖苷键连接于GalNAc的C6或C4位，但目前对此种类型的FCS研究较少。

FCS具有多种潜在的生物活性，但目前大部分研究仍集中于其抗凝与抗血栓作用上。如中国专利（公开号：CN104147040A）公开了重均分子量为大于54,500Da的海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用；中国专利（公开号：CN104147040A）公开了重均分子量为大于 20,000Da 的黑海参解聚海参糖胺聚糖或天然分子段的黑海参海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用，且其抗凝活性呈剂量依赖性，其随剂量增加凝血作用递增缓和，并且在同一剂量下随着重均分子量增加起效时间延迟的同时药效持续时间增加；中国专利（公开号：CN103536621A）公开了重均分子量为 90kDa 至 130kDa 海参糖胺聚糖在动物水平上具有显著的抗血小板聚集、抗凝、促进纤溶、降低血粘度、调节血脂、抗病毒等多种生理活性，可以用于制备治疗冠脉综合症药物。此外，国际专利（WO2013/026113A1）公开了海参来源的FCS在动物体内可用于肿瘤转移的预防和/或治疗。

成纤维细胞生长因子（FGF）能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用。作为内皮细胞迁移和增殖的修饰因子以及血管生成因子，FGF1在血管生成和肿瘤发生中起重要作用。 FGF2也称为碱性成纤维细胞生长因子，存在于正常组织中的基底膜和血管内皮细胞外基质中。在正常组织的伤口愈合和肿瘤发展过程中，活化的FGF2介导新血管的形成。目前并未有专利或文献报道FCS与成纤维细胞生长因子之间的相互作用。

发明内容

针对目前技术对阐明FCS精细结构中存在的问题及FCS与成纤维细胞生长因子相互作用研究的空白，本发明提供了一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm及其制备方法和应用。本发明从Holothuria Mexicana海参中提取了一种新型岩藻糖化硫酸软骨素（FCS_hm），并通过核磁和液质两种方式对其结构进行了阐述，并进一步证明所得FCS_hm具有较好的抗凝活性及与FGF1和FGF2的高亲和活性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm，所述FCS_hm的分子量为50~200 kDa，硫酸根的质量比为20~40%，所述FCS_hm的主链由硫酸软骨素A和硫酸软骨素E组成，所述FCS_hm的侧链包含1~5个岩藻糖，所述FCS_hm包括四种结构片段：α-Fuc-2S4S通过O-3 连接于葡萄糖醛酸上的结构片段Ⅰ、α-L-Fuc-4S通过 O-3 连接于葡萄糖醛酸上的结构片段Ⅱ、α-L-Fuc-4S通过O-6 连接于乙酰氨基半乳糖上的结构片段Ⅲ和α-L-Fuc-3S4S通过O-6 连接于乙酰氨基半乳糖上的结构片段Ⅳ，其四种结构片段结构如下：

。

进一步的：所述FCS_hm来源于Holothuria Mexicana海参。

进一步的：所述I~IV四种结构片段分别占结构片段总量的摩尔比均为5~40%。

进一步的：带有1个Fuc侧链的结构片段占结构片段总量的摩尔比为40~80%，带有2~5个Fuc侧链的结构片段占结构片段总量的摩尔比为20~60%。

本发明还提供了所述的FCS_hm的制备方法，它包括以下步骤：

(1) 粗多糖制备：首先取干海参，磨碎后用丙酮以1:5~1:20的体积脱脂，离心后复溶于水，加入木瓜蛋白酶在50~70℃下反应6~12小时；加入2~10倍体积乙醇沉淀多糖，离心后复溶于水，加入稀 HCl调pH至2~4，离心除去酸性白蛋白；向上清中加入2~10倍体积的含有1~5M KAc的乙醇，离心即得粗多糖；

(2) 阴离子交换树脂柱纯化：将步骤(1)所得粗多糖组分复溶于水，以氯化钠水溶液为流动相线性洗脱，经阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，透析后减压浓缩、冻干；

(3) 凝胶渗透色谱柱纯化：将步骤(2)所得冻干组分复溶于水，以NH₄HCO₃水溶液为流动相，经凝胶渗透色谱柱纯化，硫酸苯酚法检测，透析后减压浓缩、冻干，即得所述FCS_hm。

进一步的：所述步骤(1)中木瓜蛋白酶的用量为10~100 U·g^-1。

本发明还提供了所述的FCS_hm在制备抗凝制剂与抗血栓制剂中的应用。

进一步的：所述FCS_hm通过内源性凝血途径发挥作用，且在抗凝血酶III介导下抑制FIIa和FXa的作用而起到抗凝作用。

本发明还提供了所述的FCS_hm在制备抗血管生成制剂中的应用。

进一步的：所述FCS_hm与成纤维细胞生长因子FGF1和FGF2具有高亲和作用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

(1) 本发明通过酶解、强阴离子交换色谱及凝胶渗透色谱纯化步骤，制备了一种来源于Holothuria Mexicana海参的新型岩藻糖化硫酸软骨素（FCS_hm），本发明提供的岩藻糖化硫酸软骨素制备工艺成本低、操作简单，容易产业化生产。

(2) 本发明制备的岩藻糖化硫酸软骨素产品纯度高，其分子量为50~200 kDa，硫酸根含量为20~40%，其主链主要由硫酸软骨素A（CSA）和硫酸软骨素E（CSE）组成，并通过多维核磁共振谱和液质联用两种方法对其精细结构进行解析，发现其主要由四种结构片段组成：其中两种是α-岩藻糖（Fuc）-2S4S和 α-L-Fuc-4S 通过 O-3 连接于葡萄糖醛酸（GlcA）上，另外两种为α-L-Fuc-4S和 α-L-Fuc-3S4S通过O-6 连接于乙酰氨基半乳糖（GalNAc）上，且FCS_hm侧链包含1~5个Fuc，带有1个Fuc侧链的结构片段摩尔比为40~80%，而带有2~5个Fuc侧链的结构片段摩尔比为20~60%。

(3) 本发明提供的岩藻糖化硫酸软骨素具有较好的抗凝及抗血栓活性，且主要通过内源性凝血途径发挥作用。进一步探究其抗凝机制，发现其主要通过抗凝血酶III介导，抑制FIIa和FXa的作用。

(4) 本发明提供的岩藻糖化硫酸软骨素具有抗血管生成作用，与成纤维细胞生长因子FGF1和FGF2具有较高的亲和作用。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其它优点和特点将变得更加清晰。

附图说明

图1为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的结构示意图。

图2为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的示差与激光信号图。

图3 为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的二糖组成色谱图。

图4为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的一维核磁共振氢谱图，U, A, FI,FII, FIII 和 FIV 分别代表GlcA, GalNAc, Fuc-2S4S, Fuc-4S, Fuc-4S (通过 O-6 连接于GalNAc) 和 Fuc-3S4S (通过 O-6连接于 GalNAc)。

图5为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的一维核磁共振碳谱图。

图6为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的¹H-¹H NOESY谱图。

图7为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的¹H-¹³C HMBC谱图。

图8为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm自由基降解产物的HILIC -FTMS分析图。

图9为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm岩藻糖侧链经HILIC-FTMS分析后提取的离子流图。

图10为本发明所述岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm对APTT（A）及TT（B）的作用图，及对抗凝血酶III介导的FIIa（C）和FXa（D）抑制活性图。

图11为本发明所述供的岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm对FGF1和FGF2的结合作用图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。

实施例1：新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的制备

本发明提供的所述新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm，所述FCS_hm来源于Holothuria Mexicana海参，其分子量为50~200 kDa，硫酸根的质量比为20~40%，所述FCS_hm主链由硫酸软骨素A（CSA）和硫酸软骨素E（CSE）组成，并通过多维核磁共振谱和液质联用方法对其精细结构进行解析，发现其主要由四种结构片段组成：两种是α- Fuc-2S4S和 α-L-Fuc-4S 通过O-3 连接于葡萄糖醛酸（GlcA）上，另外两种为α-L-Fuc-4S和 α-L-Fuc-3S4S通过O-6 连接于乙酰氨基半乳糖（GalNAc）上，且FCS_hm侧链包含1~5个Fuc，带有1个Fuc侧链的结构片段的摩尔比例为40~80%，而带有2~5个Fuc侧链的结构片段的摩尔比例为20~60%，其结构示意图如图1所示。

本发明所述的新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的制备方法包括以下步骤：

(1) 粗多糖制备：首先取干海参Holothuria Mexicana，磨碎后用丙酮以1:5~1:20的体积脱脂。离心后复溶于水，加入10~100 U·g^-1木瓜蛋白酶（含有1～20 mmol/L EDTA和1～20 mmol/L半胱氨酸，pH为5~8）在50~70℃下反应6~12小时。加入2~10倍体积乙醇沉淀多糖，离心后复溶于水，加入稀 HCl调pH至2~4，离心除去酸性白蛋白。向上清中加入2~10倍体积的含有1~5M KAc的乙醇，离心即得粗多糖。

(2) 阴离子交换树脂柱纯化：将步骤(1)所得粗多糖组分复溶于水，以氯化钠水溶液为流动相线性洗脱，经阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，透析后减压浓缩、冻干。

所述阴离子交换树脂的填料为Q-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF、Capto-QSepharose FF、DEAE-Cellulose或Capto-DEAE Sepharose FF。

(3) 凝胶渗透色谱柱纯化：将步骤(2)所得冻干组分复溶于水，以NH₄HCO₃水溶液为流动相，经凝胶渗透色谱柱纯化，硫酸苯酚法检测，透析后减压浓缩、冻干，即得新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm。

所述步骤(3)中所述凝胶渗透色谱的填料为Sephadex G-150、Sephadex G-200、Sephacryl S-200 HR 或Sephacryl S-300 HR。

实施例2：新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的结构表征

（1）绝对分子量测定与纯度分析：采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）-多角度激光散射法（MALLS）联用法测定所述FCS_hm的绝对分子质量及纯度。

将制得的所述FCS_hm样品用0.1 mol·L^-1Na₂SO₄溶解配制成5 mg·mL^-1水溶液。色谱分析条件：色谱柱为Shodex OHpak SB-804 HQ 与Shodex OHpak SB-802.5 HQ串联使用，流动相为0.1 mol·L^-1 Na₂SO₄ 水溶液，进样量为100 μL，柱温为35℃，流速为0.6 mL·min^-1，采集时间为45min，检测器为示差检测器与多角度激光散射仪联用。实验结果如图2所示，示差与激光信号均呈现单一对称峰，分子量在50~200kDa之间。

（2）二糖组成分析：将 FCS_hm样品溶于0.1 mol/L H₂SO₄溶液中，于 80 ℃降解 1h，加入 Ba(OH)₂ 饱和溶液至不再有沉淀产生，离心取上清，3kDa超滤离心去除岩藻糖侧链。去岩藻糖支链的多糖溶于0.05 mol/L醋酸铵（2 mmol/L氯化钙，pH 7.0），加入20 mU 硫酸软骨素酶 ABC，于 37 ℃酶解 12 h，反应结束后，100 ℃灭活，离心取上清液进行高效液相色谱分析。采用XB-SAX 色谱柱，2 mol/L NaCl（pH 3.5）和 H₂O（pH 3.5）为流动相进行分离。如图3所示，FCS_hm主链主要由CSA和CSE组成。

（2）核磁共振波谱分析：取30 mg FCS_hm用重水交换后转至核磁管中，以DSS为内标，于60℃采用600MHz核磁共振波谱仪分析。从如图4~7可知，FCS_hm纯度很高，不含蛋白和核酸及其他杂质。在其¹H-NMR中（图4），δ5.0~5.7 ppm 之间为不同硫酸化取代的α-构型岩藻糖异头氢信号，δ 5.67 ppm、δ 5.40 ppm 、δ 5.31 ppm和δ 5.27 ppm 左右信号分别为 2,4-di-S（FI）、4-S（FII）、2,3-di-S（FIV）和 4-S（FIII）岩藻糖的异头氢信号。δ 4.48 ppm和 δ4.64 ppm 左右分别是 β-D-GlcA和β-D-GalNAc的异头氢信号。δ 3.5~5.0 ppm 之间的多重峰为糖环上 C2~C6 的氢信号。δ 1.32 ppm 和 2.07 ppm 处分别为Fuc和GalNAc上的甲基吸收峰。在其¹³C-NMR中（图5），δ100~110 ppm之间为GlcA、GalNAc及不同硫酸化取代的四种岩藻糖异头碳吸收。δ176 ppm 处为GlcA及GalNAc上羰基碳吸收峰，δ18 ppm 及25 ppm 处分别为Fuc和GalNAc上的甲基吸收峰，GalNAc 中 C2 吸收峰在54 ppm处，说明其脱氧与被乙酰氨基取代。在¹H-¹³C HMBC中（图7），U4/A1和A3/U1的相关信号证明了GlcA和GalNAc之间β-(1-4)和 β-(1-3)糖苷键的存在。同理，U3/FI1和U3/FII1的相关信号证明了FI、FII和GlcA之间为α-(1-3)连接，且在¹H-¹H NOESY也可得到证实（图6）。此外，根据¹H-¹H NOESY谱中FIII1/A6和¹H-¹³C HMBC谱中的A6 / FIII1相关信号可知，FIII和GalNAc之间为α-(1-6)连接（图6和图7）。

（3）HILIC-FTMS分析：所述FCS_hm彻底降解后进行HILIC-FTMS分析。色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna HILIC 200Å（150×2.00 mm，3μm），流动相：A：乙腈（含5 mM 醋酸铵），B：5 mM 醋酸铵水溶液，柱温25℃，流速0.15 mL·min^-1， 0~58 min内流动相A 由92%变为60%。结果如图8所示，FCS_hm经自由基降解后得到Fuc-GalNAc-aSO₃ (a=0,1,2,3)片段，由此可以判断FIV和GalNAc之间也是α-(1-6)连接。

（4）岩藻糖侧链结构分析：将（2）中降解得到的岩藻糖侧链样品进行HLIC-FTMS分析，其提取的离子流图如图9所示。可以看出，所述FCS_hm侧链由1~5个岩藻糖组成。

实施例3：新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm的抗凝作用

（1）抗凝活性测定：使用凝血分析仪和购自南京建成生物科技公司的试剂盒测定活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶时间（TT）和凝血酶原时间（PT）。如图10A、10B所示，与阴性对照相比，FCS_hm样品可显著延长血浆的 APTT与TT，而对PT无活性，说明FCS通过内源性凝血途径发挥抗凝活性，且这一作用呈剂量依赖性，活性与低分子量肝素类似。此外，CSA、CSE标准品均无抗凝活性，证明其岩藻糖侧链对其抗凝作用至关重要。

（2）抗凝机制探究：采用微孔板法于 96 孔板上进行实验，每组三个平行。首先向20 μL FCS_hm样品（空白对照为20 μL缓冲液）中加入 20 μL 0.5 IU/mL 抗凝血酶III，混匀，于 37 ^oC孵育 2 min；然后加入 40 μL 5 IU/m L FIIa 或0.25 IU/mL FXa ，混匀，于 37^oC孵育2 min；再加入 50 μL 0.5 mM FIIa 发色底物 S-2238或FXa 发色底物 S-2765，混匀，于 37 ^oC孵育1 min；最后加入80 μL 30%醋酸溶液以终止反应，混匀后，将微孔板置入酶标仪中，记录405 nm处吸光值。如图10C、10D所示，FCS_hm对ATIII介导的FIIa和FXa具有抑制作用，且随其浓度增大而增强。

实施例4：新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm与成纤维细胞生长因子的结合活性

采用表面等离子共振技术（SPR）测定FCS_hm与FGF1和FGF2的结合活性。如图11所示，FCS_hm对FGF1和 FGF2均具有较强的结合活性，K_D值分别为2.7ⅹ10^-7、1.89×10^-8, 且其结合作用与肝素 (K_D值分别为1.06×10^-7和1.27×10^-8) 类似。

综上，本发明以Holothuria Mexicana海参为原料，通过酶解、强阴离子交换色谱及凝胶渗透色谱纯化，制备了一种新型岩藻糖化硫酸软骨素（FCS_hm），其分子量为50~200kDa，硫酸根含量为20~40%，其主链由CSA和CSE组成。基于多维核磁共振谱和液质联用方法对其结构进行解析，发现其主要由四种结构片段组成：其中两种是α-Fuc-2S4S和 α-L-Fuc-4S 通过 O-3 连接于GlcA 上, 另外两种为α-L-Fuc-4S和 α-L-Fuc-3S4S通过O-6 连接于GalNAc上，且其侧链包含1~5个Fuc，带有1个Fuc侧链的结构片段比例为40~80%，而带有2~5个Fuc侧链的结构片段比例为20~60%。本发明所制备的FCS_hm通过内源性凝血途径发挥较好的抗凝血活性，活性与低分子量肝素类似，且对抗凝血酶III介导的FIIa和FXa均具有抑制作用。此外，本发明所制备的FCS_hm还与成纤维细胞生长因子FGF1和FGF2具有较高的亲和作用。

以上实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm，其特征在于：所述FCS_hm的分子量为50~200 kDa，硫酸根的质量比为20~40%，所述FCS_hm的主链由硫酸软骨素A和硫酸软骨素E组成，所述FCS_hm的侧链包含1~5个岩藻糖，所述FCS_hm包括四种结构片段：α-Fuc-2S4S通过O-3 连接于葡萄糖醛酸上的结构片段Ⅰ、α-L-Fuc-4S通过 O-3 连接于葡萄糖醛酸上的结构片段Ⅱ、α-L-Fuc-4S通过O-6 连接于乙酰氨基半乳糖上的结构片段Ⅲ和α-L-Fuc-3S4S通过O-6 连接于乙酰氨基半乳糖上的结构片段Ⅳ，其四种结构片段结构如下：

。

2.根据权利要求1所述的新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm，其特征在于：所述FCS_hm来源于Holothuria Mexicana海参。

3.根据权利要求1所述的新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm，其特征在于：所述I~IV四种结构片段分别占结构片段总量的摩尔比均为5~40%。

4.根据权利要求1所述的新型岩藻糖化硫酸软骨素FCS_hm，其特征在于：带有1个Fuc侧链的结构片段占结构片段总量的摩尔比为40~80%，带有2~5个Fuc侧链的结构片段占结构片段总量的摩尔比为20~60%。

5.权利要求1所述的FCS_hm的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的FCS_hm的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中木瓜蛋白酶的用量为10~100 U·g^-1。

7.权利要求1-4任一项所述的FCS_hm在制备抗凝制剂与抗血栓制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的FCS_hm在制备抗凝制剂与抗血栓制剂中的应用，其特征在于：所述FCS_hm通过内源性凝血途径发挥作用，且在抗凝血酶III介导下抑制FIIa和FXa的作用而起到抗凝作用。

9.权利要求1-4任一项所述的FCS_hm在制备抗血管生成制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的FCS_hm在制备抗血管生成制剂中的应用，其特征在于：所述FCS_hm与成纤维细胞生长因子FGF1和FGF2具有高亲和作用。