CN102093440B - 一种猪脑水解蛋白与单唾液酸四己糖神经节苷脂联产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从新鲜猪脑中分步提取获得猪脑水解蛋白和单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）的方法。主要工艺路线为：（1）首先添加极性有机溶剂匀浆新鲜猪脑；过滤后分别收集滤饼和滤液；（2）向步骤（1）的滤液中加入一定量弱极性有机溶剂和纯化水进行Folch分层后，先后经树脂柱层析、水解和硅胶柱层析，获得高纯单唾液酸四己糖神经节苷酯；（3）向步骤（1）的滤饼中加入一定量丙酮进行脱脂后，过滤干燥，再加入盐缓冲溶液和水解酶进行水解，后经灭活、超滤纯化、纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得医用注射级猪脑水解蛋白。

Description

一种猪脑水解蛋白与单唾液酸四己糖神经节苷脂联产工艺

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种猪脑水解蛋白与单唾液酸四己糖神经节苷脂联产工艺。

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）是含有N-乙酰神经氨酸（唾液酸）的膜糖脂，是从新鲜猪脑中经提取和精制获得，具有修复神经损伤，增强人脑功能发育，对神经系统疾病具有很好的治疗和保健功效。对于GM1的分离纯化，国内外有许多报道，中国专利CN1158295C公开了一种用超滤膜结合亲和层析或是高效液相制备GM1的方法，尽管该发明所得GM1的纯度高，但是所用设备要求高，投资大，而且产量小，不适合工业化生产。中国专利CN1400216A公开了一种根据神经节苷脂性质选择合适的有机溶剂提取，从而提高GM1收率和纯度的工艺，但该发明获得的GM1纯度只有81%，远未达到药用注射剂的标准。专利CN101328196A、US20080312165A1和CN1814610分别公开了制备注射级原料GM1的工艺和方法。目前关于神经节苷脂的已公开专利中猪脑的蛋白成分均作为废弃物被处理掉，不但是一种浪费，而且污染环境。

脑蛋白水解物是用健康猪脑经脱脂、水解和纯化精制而成的口服或注射原料药，主要成分是小分子量短肽和氨基酸的混合物。对于治疗人脑功能性疾病临床效果显著。对于脑蛋白水解物分离纯化，中国专利CN101524370公开了一种猪脑蛋白水解物的制备工艺，但该工艺制备的脑蛋白水解物只能满足食用或口服药物的要求，还未达到医用注射级。中国专利CN1562339公开了一种制备医用注射级猪脑蛋白水解物的方法，该方法中涉及高温灭菌工艺，会对脑蛋白水解物的品质产生很大影响。

发明内容                                                

[0007] 本发明的目的是提供一种利用猪脑原料，根据蛋白与脂类的物化性质差异，分别制备医用注射级脑水解蛋白和GM1的工艺，从而提高生物材料利用度，提高脑蛋白水解物的品质，降低生产成本。

本发明采用下述技术方案：

（1）先去除新鲜猪脑表面的包膜和血管，用胶体磨粉碎后，加入1~4倍体积的极性有机溶剂，在室温条件下匀浆2~4小时，减压过滤分别收集滤饼和滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入一定比例的弱极性有机溶剂和纯化水的混合溶液；制备神经节苷脂总脂；用纯化水溶解神经节苷脂总脂，神经节苷脂浓度为80~100g/L，用乙酸或磷酸调节pH为2~5，加热至70~100°C，保温水解1~6小时，水解结束后加入1~3倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相洗脱硅胶柱，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂；

（3）向步骤（1）滤饼中加入1~3倍体积的丙酮，室温条件下匀浆1~2小时脱去磷脂后，减压过滤后收集滤饼，20~30°C条件下，真空干燥后获得脱脂猪脑粉；向脱脂猪脑粉中加入盐缓冲液，调节pH为5~7，按照1-3g/L的比例分别加入两种或三种水解酶，在25~42°C条件下水解2~10小时，水解结束后70~100°C灭活5~15min，室温放置降温；之后将水解液经一定分子量的超滤膜过滤，所得滤液再经截留分子量为100~500的纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得医用注射级猪脑水解蛋白。

其中，步骤（1）所述极性有机溶剂优选为无水乙醇。

步骤（2）所述滤液中加入的弱极性有机溶剂可以是乙酸乙酯或氯仿，具体地，可以加入0.5~1倍体积的乙酸乙酯和0.1~0.5倍体积的纯化水，或者0.5~1倍体积的氯仿和0.1~0.5倍体积的纯化水，使加入弱极性溶剂和纯化水后的溶剂比例为极性溶剂/弱极性溶剂/纯化水=1~2：1：1~0.1。

步骤（2）所述制备神经节苷脂总脂的方法为：在30~40°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层乙醇水相，调整乙醇浓度为30%~60%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在55-60°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入1~3倍体积的预冷丙酮，沉淀2~10小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂。

步骤（2）所述流动相比例为氯仿/甲醇/水=40~60：30~50：1~10。

步骤（3）中所述的盐缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，所述的水解酶可以是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰酶中的任意两种或三种，所述的超滤膜截留分子量为5000~30000 Dal。

本发明通过溶剂的选择、反应条件的优化，实现了脑水解蛋白与神经节苷脂的联产，而且，所制备的脑水解蛋白和GM1均达到医用注射级。既提高了生物材料利用度，避免了浪费，降低了生产成本，又提高了脑蛋白水解物的品质。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明的具体实施方式进行说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。                    

实施例1 

（1）取100kg新鲜猪脑，去除表面的包膜和血管，用120目胶体磨粉碎后，加入1倍体积的无水乙醇，在室温条件下匀浆4小时，减压过滤分别收集滤饼和乙醇滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入1倍体积的乙酸乙酯和0.5倍体积的纯化水，在35°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层乙醇水相，加入纯化水调整乙醇浓度为60%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在60°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入2倍体积的预冷丙酮，沉淀6小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂约180g；

用纯化水溶解神经节苷脂总脂，过滤除去不溶物后，用乙酸调节pH为3.5，加热至85°C，保温水解1小时，水解结束后加入1倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相氯仿/甲醇/水=40：50：5洗脱硅胶柱，控制流速为5L/h，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂约35g，纯度为98.7%，收率为23%；

（3）向步骤（1）滤饼中加入1倍体积的丙酮，室温条件下匀浆2小时脱去中性脂后，减压过滤后收集滤饼，20°C条件下真空干燥后获得脱脂猪脑粉约26kg；

向脱脂猪脑粉中加入磷酸盐缓冲液120L，调节pH为6.5，分别加入140g的木瓜蛋白酶和胰酶，在37°C条件下水解5小时，水解结束后70°C灭活15min，室温放置降温；

将水解液用截留分子量为15000 Dal的超滤膜过滤纯化，所得滤液再经截留分子量为100的纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白25.1kg，收率为62%，总氮量为8.4%，氨基氮为5.7%。

实施例2 

（1）取100kg新鲜猪脑，去除表面的包膜和血管，用120目胶体磨粉碎后，加入4倍体积的无水乙醇，在室温条件下匀浆2小时，减压过滤分别收集滤饼和乙醇滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入0.5倍体积的乙酸乙酯和0.1倍体积的纯化水，在30°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层乙醇水相，加入纯化水调整乙醇浓度为30%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在57°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入1倍体积的预冷丙酮，沉淀10小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂约250g；

用纯化水溶解神经节苷脂总脂，过滤除去不溶物后，用乙酸调节pH为2.0，加热至100°C，保温水解3小时，水解结束后加入3倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相氯仿/甲醇/水=50：40：10洗脱硅胶柱，控制流速为4L/h，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂约53g，纯度为99.2%，收率为35%；

（3）向步骤（1）滤饼中加入2倍体积的丙酮，室温条件下匀浆1小时脱去中性脂后，减压过滤后收集滤饼，25°C条件下真空干燥后获得脱脂猪脑粉约23kg；

向脱脂猪脑粉中加入醋酸盐缓冲液120L，调节pH为7，分别加入280g的胃蛋白酶和胰酶，在25°C条件下水解10小时，水解结束后85°C灭活10min，室温放置降温；

将水解液用截留分子量为30000 Dal的超滤膜过滤纯化，所得滤液再经截留分子量为300纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白约21.5kg，收率为53%，总氮含量为6.7%，氨基氮含量为4.2%。

实施例3

（1）取100kg新鲜猪脑，去除表面的包膜和血管，用120目胶体磨粉碎后，加入2倍体积的无水乙醇，在室温条件下匀浆3小时，减压过滤分别收集滤饼和乙醇滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入1倍体积的乙酸乙酯和0.1倍体积的纯化水，在40°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层乙醇水相，加入纯化水调整乙醇浓度为50%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在55°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入2倍体积的预冷丙酮，沉淀5小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂约235g；

用纯化水溶解神经节苷脂总脂，过滤除去不溶物后，用乙酸调节pH为4.0，加热至70°C，保温水解6小时，水解结束后加入2倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相氯仿/甲醇/水=50：45：1洗脱硅胶柱，控制流速为4L/h，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂约45g，纯度为98.9%，收率为30% ；

（3）向步骤（1）滤饼中加入3倍体积的丙酮，室温条件下匀浆2小时脱去中性脂后，减压过滤后收集滤饼，30°C条件下真空干燥后获得脱脂猪脑粉约23kg；

向脱脂猪脑粉中加入柠檬酸盐缓冲液120L，调节pH为6，分别加入420g胃蛋白酶和胰酶，在42°C条件下水解3小时，水解结束后100°C灭活5min，室温放置降温；

将水解液用截留分子量为5000 Dal的超滤膜过滤纯化，所得滤液再经截留分子量为500纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白约22kg，收率为55%，总氮含量为6.7%，氨基氮含量为4.2%。

实施例4

（1）取100kg新鲜猪脑，去除表面的包膜和血管，用120目胶体磨粉碎后，加入3倍体积的无水乙醇，在室温条件下匀浆3小时，减压过滤分别收集滤饼和乙醇滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入0.5倍体积的乙酸乙酯和0.5倍体积的纯化水，在37°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层乙醇水相，加入纯化水调整乙醇浓度为40%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在60°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入3倍体积的预冷丙酮，沉淀2小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂约240g；

用纯化水溶解神经节苷脂总脂，过滤除去不溶物后，用乙酸调节pH为5.0，加热至70°C，保温水解6小时，水解结束后加入2倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相氯仿/甲醇/水=60：30：1洗脱硅胶柱，控制流速为3L/h，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂约49g，纯度为99.2%，收率为32% ；

（3）向步骤（1）滤饼中加入3倍体积的丙酮，室温条件下匀浆2小时脱去中性脂后，减压过滤后收集滤饼，30°C条件下真空干燥后获得脱脂猪脑粉约24.5kg；

向脱脂猪脑粉中加入醋酸盐缓冲液120L，调节pH为5，分别加入140g木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰酶，在42°C条件下水解2小时，水解结束后100°C灭活5min，室温放置降温；

将水解液用截留分子量为10000 Dal的超滤膜过滤纯化，所得滤液再经截留分子量为500纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白约23kg，收率为57.5%，总氮含量为6.2%，氨基氮含量为4.5%。

实施例5

（1）取100kg新鲜猪脑，去除表面的包膜和血管，用120目胶体磨粉碎后，加入2倍体积的甲醇，在室温条件下匀浆4小时，减压过滤分别收集滤饼和甲醇滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入1倍体积的氯仿和0.1倍体积的纯化水，在40°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层甲醇水相，加入纯化水调整甲醇浓度为30%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。在55°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入1倍体积的预冷丙酮，沉淀10小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂约225g；

用纯化水溶解神经节苷脂总脂，过滤除去不溶物后，用乙酸调节pH为5.0，加热至70°C，保温水解6小时，水解结束后加入3倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相氯仿/甲醇/水=60：30：10洗脱硅胶柱，控制流速为5L/h，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂约41g，纯度为99.1%，收率为27% ；

（3）向步骤（1）滤饼中加入3倍体积的丙酮，室温条件下匀浆2小时脱去中性脂后，减压过滤后收集滤饼，30°C条件下真空干燥后获得脱脂猪脑粉约24kg；

向脱脂猪脑粉中加入醋酸盐缓冲液120L，调节pH为7，分别加入140g胃蛋白酶和胰酶，在42°C条件下水解2小时，水解结束后100°C灭活5min，室温放置降温；

将水解液用截留分子量为5000 Dal的超滤膜过滤纯化，所得滤液再经截留分子量为500纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白约23kg，收率为57%，总氮含量为5.5%，氨基氮含量为4.7%。

实施例6

（1）取100kg新鲜猪脑，去除表面的包膜和血管，用120目胶体磨粉碎后，加入4倍体积的无水乙醇，在室温条件下匀浆4小时，减压过滤分别收集滤饼和乙醇滤液；

（2）向步骤（1）滤液中加入0.5倍体积的氯仿和0.5倍体积的纯化水，在30°C条件下，搅拌30min后静置分层，取下层乙醇水相，加入纯化水调整乙醇浓度为60%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在60°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入3倍体积的预冷丙酮，沉淀2小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂约260g；

用纯化水溶解神经节苷脂总脂，过滤除去不溶物后，用乙酸调节pH为2.0，加热至100°C，保温水解1小时，水解结束后加入1倍预冷丙酮，获得水解物沉淀，过滤干燥后用氯仿/甲醇（50：50）溶液溶解，上样硅胶柱，用流动相氯仿/甲醇/水=40：50：1洗脱硅胶柱，控制流速为3L/h，收集纯度大于98.5%的组份，经减压浓缩和真空干燥后获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂约58g，纯度为98.8%，收率为38% ；

（3）向步骤（1）滤饼中加入1倍体积的丙酮，室温条件下匀浆1小时脱去中性脂后，减压过滤后收集滤饼，20°C条件下真空干燥后获得脱脂猪脑粉约21kg；

向脱脂猪脑粉中加入磷酸盐缓冲液120L，调节pH为5，分别加入420g木瓜蛋白酶和胰酶，在25°C条件下水解10小时，水解结束后70°C灭活15min，室温放置降温；

将水解液用截留分子量为30000 Dal的超滤膜过滤纯化，所得滤液再经截留分子量为100纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白约19.5kg，收率为48%，总氮含量为5.0%，氨基氮含量为3.7%。

Claims (1)

1.一种猪脑水解蛋白和单唾液酸四己糖神经节苷脂的联产工艺，包含以下步骤：

（1）将食品级新鲜猪脑粉碎后加入1~4倍体积极性有机溶剂，匀浆2~4小时后过滤，分别收集滤饼和滤液；

（2）向步骤（1）所得滤液中加入弱极性有机溶剂和纯化水的混合溶液；制备神经节苷脂总脂；用纯化水溶解神经节苷脂总脂，用乙酸或磷酸调节pH至2~5，在70~100°C加热保温水解，水解时间为1~6小时，水解结束后加入1~3倍体积的预冷丙酮，获得水解物沉淀；将水解物沉淀过滤干燥后用氯仿/甲醇= 50：50的溶液溶解，上样硅胶柱，用洗脱液洗脱硅胶柱，控制流速3-5L/h，收集纯度大于98.5%的组份，获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂；

（3）向步骤（1）所得滤饼中加入1~3倍体积的丙酮，匀浆1~2小时脱去磷脂，过滤，减压浓缩，20~30°C干燥，获得脱脂猪脑粉；向脱脂猪脑粉中加入盐缓冲液调节pH为5~7，按照1-3g/L的比例分别加入两种或三种水解酶，在25~42°C条件下水解2~10小时，水解结束后70~100°C灭活5~15min，室温放置降温；之后将水解液经截留分子量为5000~30000 Dal的超滤膜过滤，所得滤液再经截留分子量为100~500的纳滤浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪脑水解蛋白。

2. 如权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：步骤（1）所述极性有机溶剂为无水乙醇。

3. 如权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：步骤（2）所述滤液中加入的弱极性有机溶剂是乙酸乙酯或氯仿，且加入弱极性有机溶剂后溶液比例为极性有机溶剂：弱极性有机溶剂：纯化水=1~2：1：1~0.1。

4. 如权利要求3所述的联产工艺，其特征在于：步骤（2）所述滤液中加入的弱极性有机溶剂是乙酸乙酯。

5. 如权利要求1或2所述的联产工艺，其特征在于：步骤（2）所述制备神经节苷脂总脂的方法为：在30-40°C条件下，搅拌30min后静置进行Folch分层，取下层乙醇水相，加入纯化水调整乙醇浓度为30%~60%，上样非极性大孔吸附树脂，吸附饱和后用纯化水洗涤2倍柱体积，用浓度为80%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。在55-60°C条件下减压浓缩至原体积1/4时，加入1-3倍体积的预冷丙酮，沉淀2-10小时，经减压过滤和真空干燥，获得神经节苷脂总脂。

6. 如权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：步骤（2）所述洗脱液为氯仿/甲醇/水=40~60：30~50：1~10。

7.  如权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：步骤（3）所述的盐缓冲液选自磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。

8. 如权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：步骤（3）所述的水解酶可以是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶中的任意两种或三种。