RU2483736C2 - Способ получения чистого моносиалоганглиозида gm1 для применения в медицине - Google Patents

Способ получения чистого моносиалоганглиозида gm1 для применения в медицине Download PDF

Info

Publication number
RU2483736C2
RU2483736C2 RU2008124890/15A RU2008124890A RU2483736C2 RU 2483736 C2 RU2483736 C2 RU 2483736C2 RU 2008124890/15 A RU2008124890/15 A RU 2008124890/15A RU 2008124890 A RU2008124890 A RU 2008124890A RU 2483736 C2 RU2483736 C2 RU 2483736C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
monosialoganglioside
solution
diafiltration
potassium
fucosyl
Prior art date
Application number
RU2008124890/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008124890A (ru
Inventor
Стефано КАРЛИНО
Рене-Пьер БЮНТЕР
Original Assignee
Лаборатуар Медидом С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лаборатуар Медидом С.А. filed Critical Лаборатуар Медидом С.А.
Publication of RU2008124890A publication Critical patent/RU2008124890A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2483736C2 publication Critical patent/RU2483736C2/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G3/00—Glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения и очистки моносиалоганглиозида GM1. Способ получения чистого моносиалоганглиозида GM1 в форме его натриевой соли включает а) отделение GM1 от Фукозил GM1 в липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, с помощью колоночной ионообменной хроматографии с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия, (б) извлечение растворенного вещества из элюированного раствора, (в) диафильтрацию водного раствора извлеченного растворенного вещества стадии (б), (г) добавление натриевой соли и диафильтрацию полученного водного раствора, (д) извлечение GM1 в форме его натриевой соли. Способ очистки моносиалоганглиозида GM1 от Фукозила-GM1 в липидной смеси, ионообменной колоночной хроматографией с использованием элюента, содержащего ионы цезия или калия. Препарат моносиалоганглиозида GM1 имеет чистоту 99,0% или более и содержит менее 0,1% Фукозил GM1. Способ лечения нарушений и заболеваний центральной нервной системы и периферической нервной системы, включающий введение пациенту препарата моносиалоганглиозида GM1 в его эффективном количестве. Применение препарата моносиалоганглиозида GM1 в производстве фармацевтической композиции. Использование вышеописанного препарата моносиалоганглиозида GM1 при лечении имеет значительные преимущества за счет уменьшения побочных эффектов. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моносиаганглиозидам GM1, более конкретно, к способам получения и очистки моносиаганглиозида GM1.
Уровень техники
Ганглиозиды представляют собой класс гликосфинголипидов, имеющих один или более остатков сиаловой кислоты, и находятся в большом количестве в мозговой и нервной ткани людей и животных. Известно много фармацевтических применений моносиалоганглиозида GM1, особенно в восстановлении и лечении расстройств центральной и периферической нервных систем.
Согласно US 4,849,413, ганглиозиды удобно экстрагировать из мозговой ткани быков или свиней. Для того чтобы быть пригодным для фармацевтического применения, моносиалоганглиозид GM1 должен быть потом выделен и очищен.
Известно, что для увеличения выхода моносиалоганглиозида GM1 экстрагированную липидную смесь обрабатывают химическими или ферментативными способами для превращения прочих ганглиозидных компонентов в моносиалоганглиозид GM1. Такие способы включают кислотный гидролиз разбавленной кислотой, как, например, описано в CN 1353112, или энзиматический гидролиз с использованием сиалидазы, например, как описано в US 5,296,360.
Дальнейшая очистка такой обогащенной GM1 липидной смеси вытеснительной хроматографией с использованием элюента хлороформ: метанол: вода 60:30:4,5 описана в ЕР 0150712. ЕР 0489352 описывает очистку обогащенной GM1 липидной смеси ультрафильтрацией раствора липидной смеси с альфа-циклодекстрином с последующим извлечением GM1 селективной экстракцией этанолом. Сообщают, что GM1 может быть получен с чистотой 95%.
Ранее было показано, что при использовании в промышленном масштабе такие процессы имеют недостатки в отношении чистоты и выхода GM1, и в отношении стоимости, эффективности и экономичности.
Для фармацевтического применения требуется производить ганглиозид GM1 высокой чистоты. Соответственно, сохраняется постоянная потребность в способах получения ганглиозида GM1 высокой чистоты.
Раскрытие изобретения
Авторы настоящей заявки неожиданно обнаружили, что ганглиозид GM1 может быть эффективно отделен от других ганглиозидов способом, основанным на ионообменной хроматографии.
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что ганглиозид GM1 может быть получен с высокой чистотой способом, в котором GM1 отделяют из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, ионообменной колоночной хроматографией с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия.
Согласно настоящему изобретению, предоставляется способ выделения и очистки ганглиозида GM1 по п.1.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предоставляется способ, включающий общие стадии:
(а) выделение GM1 из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, ионообменной колоночной хроматографией с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия,
(б) извлечение растворенного вещества из элюированного раствора,
(в) диафильтрация водного раствора извлеченного растворенного вещества,
(г) добавление натриевой соли и диафильтрация полученного раствора, и
(д) извлечение GM1.
Преимущественно способ настоящего изобретения дает препарат моноганглиозида GM1 высокой степени очистки. Согласно настоящему изобретению препарат моносиалоганглиозида GM1 может иметь чистоту, более высокую, чем 98%, даже выше, чем 99,0% и даже 99,9%.
Способ настоящего изобретения использует также преимущественно простые стадии, экономичен и пригоден для применения в промышленном масштабе.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из формулы и из следующего подробного описания и примеров.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение относится к способу очистки моноганглиозида GM1, в котором GM1 выделяют из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, хроматографией на ионообменной колонке с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия.
В предпочтительном варианте реализации предоставляется способ получения моносиалоганглиозида GM1 высокой чистоты, включающий стадии:
(а) выделение GM1 из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента хроматографией на ионообменной колонке с использованием элюента, содержащего ионы цезия или калия.
(б) извлечение растворенного вещества из элюированного раствора стадии (в),
(в) диафильтрация водного раствора извлеченного растворенного вещества стадии (г) для удаления остаточных солей калия или цезия,
(г) добавление ионов натрия, предпочтительно в форме подходящей натриевой соли, для вытеснения ионов калия или цезия, связанных с GM1, и диафильтрация водного раствора для удаления остаточной натриевой соли, и
(д) извлечение GM1 в форме его натриевой соли.
Липидную смесь можно получать из сырого липидного экстракта мозговой ткани быка, овцы, лошади или свиньи.
Преимущественно липидную смесь, содержащую моноганглиозид GM1 в качестве преобладающего ганглиозидного компонента, можно получать из липидного экстракта, содержащего по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50% и более предпочтительно по меньшей мере 70% смеси ганглиозидов. Остаток липидного экстракта может в общем случае состоять из сульфатидов, цереброзидов, жирных кислот и белков.
Для обессоливания раствора липидный экстракт можно сначала подвергать диафильтрации через мембрану, имеющую размер пор от 10000 до 100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон. Для диафильтрации можно использовать любую обычную диализную мембрану. Преимущественно можно использовать фильтровальные кассеты, например тип полисульфоновых кассет SARTOCON® (Sartorius), например, с границей пропускания примерно 50000 дальтон.
Предпочтительно липидный экстракт подвергают обработке гидролизом для превращения других основных ганглиозидных компонентов, таких как GT1b, GD1a и GD1b, в GM1 для увеличения содержания GM1.
Гидролиз можно осуществлять с использованием обычных способов. Преимущественно гидролиз можно осуществлять с использованием любого из двух общих способов гидролиза ганглиозидов, известных в литературе, а именно кислотного гидролиза или ферментативного гидролиза.
Кислотный гидролиз можно осуществлять, например, с использованием разбавленной неорганической кислоты, такой как разбавленная соляная кислота, серная и азотная кислота. Гидролиз в кислой среде можно осуществлять изменением рН водного раствора липидного экстракта до рН между 3,5 и 5, предпочтительно рН около 4,0, и нагреванием раствора до температуры предпочтительно между 90°С и 100°С в течение времени, необходимого для завершения конверсии других основных ганглиозидных компонентов в GM1. Время, необходимое для гидролиза основных ганглиозидов в GM1, зависит от рН и выбранной температуры. В общем случае, чем выше рН, тем более длительное время требуется для завершения гидролиза, и чем выше температура реакции, тем короче время, требуемое для завершения гидролиза. Реакцию гидролиза можно в общем случае проводить более 2-5 часов. Например, если гидролиз осуществляют при рН 4,0 и 95°С, время, требуемое для завершения реакции гидролиза, составляет примерно 3 часа.
Ферментативный гидролиз можно осуществлять с использованием любой подходящей сиалидазы. Предпочтительно можно использовать сиалидазу Arthrobacter ureafaciens штамма S или сиалидазу Vibrio cholerae. Сиалидаза Arthrobacter ureafaciens штамма S и сиалидаза Vibrio cholerae активны преимущественно в отношении GT1a, GD1a, GD1b, но не GM1. Ферментативный гидролиз можно осуществлять, например, изменением рН водного раствора липидного экстракта до рН, при котором используемый фермент имеет свою оптимальную активность, например между рН 4 и рН 6, например, примерно рН 5, добавлением подходящего буфера, такого как ацетатный буфер, добавлением ионов Са2+ в случае, если сиалидаза является сиалидазой Vibrio cholerae, и нагреванием раствора при температуре, при которой используемый фермент имеет оптимальную активность, например около 37°С, в течение времени, необходимого для завершения превращения. Гидролиз можно в общем случае осуществлять более 12-24 часов, в зависимости от добавленных единиц активности фермента.
Кислотный гидролиз является менее предпочтительным, поскольку он является неспецифическим способом гидролиза и в общем случае обеспечивает более низкий выход GM1 вследствие конверсии в другие ганглиозиды. Способ кислотного гидролиза приводит также к образованию примеси асиало-GM1.
Способы ферментативного гидролиза являются предпочтительными, поскольку они в общем случае обеспечивают более высокий выход GM1 вследствие высокой специфичности химического превращения. Для ферментативного гидролиза предпочтительна сиалидаза Arthrobacter ureafaciens, поскольку для ее активности не требуется добавления ионов Са2+. Также вследствие молекулярной массы 52000 дальтон (по сравнению с 82000 дальтон для сиалидазы Vibrio cholerae) ее можно преимущественно вымывать диафильтрацией.
Для извлечения полученной таким образом липидной смеси, имеющей повышенное содержание моносиалоганглиозида GM1, из реакционного раствора реакционный раствор можно преимущественно диафильтровать, например, через мембрану, имеющую размер пор 10000-100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон. Для диафильтрации можно использовать любую обычную диализную мембрану. Преимущественно можно использовать фильтровальные кассеты, такие как тип полисульфоновых кассет SARTOCON® (Sartorius), предпочтительно с границей пропускания 50000 дальтон. Растворенное вещество можно затем высушить для получения порошка липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента. Сушку можно осуществлять обычными способами. Преимущественно сушку можно осуществлять распылительной сушкой или вакуумной сушкой.
Липидная смесь может в общем случае иметь концентрацию GM1 от 10 до 200 г/л и предпочтительно по меньшей мере 100 г/л.
Согласно способу настоящего изобретения ганглиозид GM1 отделяют от других ганглиозидов в липидной смеси с использованием ионообменной хроматографии.
Неожиданно было обнаружено, что при использовании элюента, содержащего ионы калия или цезия, можно успешно отделить GM1 от других моносиалоганглиозидов.
В большинстве случаев было найдено, что традиционно использующиеся методики ионного обмена не позволяют эффективно отделять GM1 от других моносиалоганглиозидов. Особенно известен моносиалоганглиозид Фукозил-GM1, присутствующий в качестве основной ганглиозидной примеси в свиной липидной смеси, произведенной известными обработками гидролизом.
Две молекулы GM1 и Фукозил-GM1 имеют очень похожие физические свойства. Обе имеют единичный отрицательный заряд, предоставленный карбоксильной группой сиаловой кислоты, и имеют близкие молекулярные массы: 1558 и 1704, соответственно. Соответственно, при загрузке в предварительно уравновешенную ионообменную колонку сила связывания двух данных ганглиозидов со смолой является одинаковой.
До настоящего времени наблюдалось, что если к элюенту для увеличения ионной силы элюента добавляют ацетат натрия и обеспечивают условия для замещения ганглиозидов, то как GM1, так и Фукозил-GM1 элюируются при той же самой ионной силе в то же самое время. Разделение данных двух моносиалоганглиозидов не может быть достигнуто.
Тогда как авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что при использовании ионов цезия или калия, например, добавлением метанольного раствора ацетата калия или цезия, GM1 и Фукозил-GM1 элюируются раздельно, при этом первым элюируется Фукозил-GM1. Разделение является полным, и может быть выделен каждый из ганглиозидов GM1 и Фукозил-GM1.
Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что наблюдаемое разделение может быть обусловлено тем фактом, что вопреки общепринятой теории ионного обмена растворенные вещества, GM1 и Фукозил-GM1, не только высвобождаются из колонки в порядке прочности их связывания со смолой, но также и в порядке их сродства к противоиону, с которым они должны быть связаны для того, чтобы быть отщепленными из геля. Соответственно, из этой теории следует, что если одно из этих двух растворенных веществ имеет различное сродство к противоиону, то растворенные вещества будут высвобождаться при двух различных ионных силах и может осуществляться очистка.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что моносиалоганглиозиды GM1 и Fuc-GM1 имеют одинаковое сродство к натрию, но не одинаковое сродство к калию или цезию, несмотря на то, что все три металла принадлежат к одной и той же группе. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что Fuc-GM1 имеет более высокое сродство к калию и цезию, чем GM1, и элюируется первым.
Способ ионообменной хроматографии настоящего изобретения преимущественно дает возможность эффективно отделять GM1 от Фукозил-GM1. Далее, способ настоящего изобретения преимущественно также обеспечивает отделение GM1 от соответствующих жирных кислот. Жирные кислоты имеют такой же заряд, как ганглиозид, но более высокое сродство к ионам цезия или калия.
Для ионообменной хроматографии можно использовать любую подходящую смолу. Преимущественно можно использовать смолу, имеющую четверичную аминогруппу, например, FRACTOGEL® EMD TMAE (S) или смолы Sepharose, например, смолы Q-Sepharose HP.
На первой стадии смолу уравновешивают с подходящим растворителем. Подходящие растворители включают этанол, метанол или смесь метанола и хлороформа. Предпочтительно растворитель является метанолом, потому что он является растворителем, в котором растворимы ганглиозиды и соли калия и цезия.
Затем в колонку можно загрузить раствор липидной смеси в подходящем для элюирования растворителе. Растворитель для элюирования должен содержать такие же компоненты растворителя, как растворитель, используемый для уравновешивания смолы. Предпочтительно выбранный растворитель является метанолом. Предварительное элюирование с растворителем для элюирования позволяет элюировать свободные вещества, например, цереброзиды.
Затем к растворителю для элюирования добавляют ионы калия или цезия. Ионы калия или цезия предпочтительно предоставляются в виде метанольного раствора ацетата калия или цезия, формиата, пропионата или в виде соли другой органической кислоты. Предпочтителен метанольный раствор ацетата натрия или калия. Преимущественно ацетаты калия или цезия могут присутствовать в элюенте в количестве, достаточном для обеспечения удельной проводимости элюента 1100-1400 мкСм/см, предпочтительна удельная проводимость 1200-1300 мкСм/см. Данный раствор элюента, содержащий соль натрия или калия, может проходить через колонку изократически при любой подходящей скорости потока, например, при скорости потока от 100 мл/час до 140 мл/час.
Если разделение осуществляют с использованием способа ионообменной хроматографии согласно настоящему изобретению, жирные кислоты и Fuc-GM1 элюируются перед GM1, в то время как сульфатиды, остающиеся связанными с колонкой, могут элюироваться во время промывания колонки.
Элюат, содержащий GM1, собирают, и, преимущественно, элюирующий растворитель, элюированный из колонки, может извлекаться перегонкой.
Раствор, содержащий GM1, может извлекаться сушкой раствора элюата с образованием порошка, содержащего GM1. Сушку можно осуществлять с использованием обычных способов, например, распылительной сушкой или вакуумной сушкой.
Раствор, содержащий GM1, может затем быть очищен диафильтрацией его водного раствора через мембрану, имеющую размер пор 10000-100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон, для удаления остаточных солей калия или цезия. Необязательно, неорганическая кислота, такая как водная серная кислота, азотная кислота, или предпочтительно соляная кислота, может быть добавлена к раствору для доведения рН между рН 6-8, предпочтительно примерно рН 7 до диафильтрации.
Ионы натрия, соответственно в виде водного раствора натриевой соли, предпочтительно NaCl, можно затем добавить к раствору для вытеснения ионов калия или цезия, связанных с GM1, и получения GM1 в виде физиологической натриевой соли. Раствор можно затем подвергать второй диафильтрации для удаления остаточной соли (например, NaCl), с использованием мембраны, имеющей размер пор от 10000 до 100000 дальтон, предпочтительно примерно 50000 дальтон. Преимущественно можно использовать фильтровальные кассеты, такие как кассеты полисульфонового типа SARTOCON® (Sartorius), предпочтительно с границей пропускания 50000 дальтон.
Раствор можно затем высушить для извлечения GM1 в виде порошка. Сушку можно осуществлять обычными способами. Преимущественно сушку можно осуществлять распылительной сушкой или вакуумной сушкой.
GM1, полученный согласно настоящему изобретению, имеет степень чистоты 98% или более, в общем случае примерно от 99,0 до 99,9%. GM1, полученный согласно процессу настоящего изобретения, содержит менее 0,1% примеси Фукозил-GM1.
Способ настоящего изобретения преимущественно позволяет эффективно отделять GM1 от других моносиалоганглиозидов. В частности, способ настоящего изобретения позволяет отделять GM1 от примеси Фукозил-GM1.
Преимущественно способ настоящего изобретения дает препарат моносиалоганглиозида GM1 с высоким уровнем чистоты с хорошим выходом.
GM1, очищенный согласно способу настоящего изобретения, может использоваться в лечении испытуемых людей или животных. В частности, GM1, очищенный согласно настоящему изобретению, рассматривается для лечения людей или млекопитающих, особенно для восстановления и лечения нарушений и заболеваний центральной и периферийной нервной системы, включая мозговой инсульт, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга, болезнь Альцгеймера, позднюю дискинезию, амиотрофический боковой склероз, периферийную невропатию и автономную невропатию.
Настоящее изобретение далее поясняется следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозида
Липидный экстракт, содержащий смесь ганглиозидов, имеющих чистоту 70%, растворяют в очищенной воде при концентрации примерно 25 г/л. Затем данный раствор диафильтруют через полисульфоновые фильтровальные кассеты SARTOCON® (Sartorius), имеющие границу пропускания 50000 дальтон.
Затем 200 л раствора уравновешивают до рН 5,5 добавлением 50 мМ ацетатного буфера и 4 мМ хлорида кальция. Добавляют 30000 единиц сиалидазы Vibrio cholerae и нагревают раствор до 37°С в течение 12 часов для завершения превращения других основных ганглиозидов (GT1b, GD1a, GD1b) в GM1. Концентрация GM1 в полученном растворе равна 14-15 г/л.
После энзиматического гидролиза раствор диафильтруют через фильтровальные кассеты, имеющие границу пропускания 50000 дальтон. Затем к ретентату добавляют 1 М NaCl и подвергают раствор второй диафильтрации. После второй диафильтрации ретентат концентрируют до концентрации GM1 100 г/л, оставляя поток пермеата без какого-либо замещения водой. Затем раствор сушат под вакуумом для получения примерно 3200 г порошка, имеющего концентрацию GM1 85%, измеренную ВЭЖХ.
Очистка GM1 из липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозида
Готовят метанольный раствор при концентрации 10 г/л с использованием порошка, полученного на предыдущей стадии, и фильтруют раствор через 0,22 мкм фильтровальный картридж Sartopore (произведенный Sartorius AG).
Затем для каждого цикла загружают 7 л отфильтрованного раствора в колонку ВЭЖХ, содержащую 20 л смолы Fractogel ® EMD TMAE (S), уравновешенной в метаноле. Затем колонку элюируют метанолом: метанольным раствором ацетата калия, имеющим удельную проводимость 1200-1300 мкСм/см, при расходе 120 л/ч. Циклы повторялись до исчерпания раствора GM1.
Затем элюат (примерно 60-70 л) концентрируют перегонкой, а потом сушат для получения порошка, а метанол регенерируют. Полученный таким образом порошок является смесью чистого GM1 и ацетата калия.
Полученный таким образом порошок растворяют в очищенной воде при концентрации 25 г/л и уравновешивают до рН 7 добавлением 18% HCl. Раствор диафильтруют через кассетный фильтр, имеющий границу пропускания 50 000 дальтон. Затем добавляют 1М NaCl и раствор снова диафильтруют через кассетный фильтр, имеющий границу пропускания 50 000 дальтон. После данной второй диафильтрации ретентат концентрируют до 100-120 г/л, оставляя поток пермеата без какого-либо замещения водой.
Затем концентрированный раствор фильтруют через 0,22 мкм фильтр и сушат распылительной сушкой для получения примерно 2700 г от белого до бело-бежевого порошка GM1, идентифицированного ТСХ, при этом данный порошок GM1 имеет чистоту 99,8%, измеренную ВЭЖХ. Полученный порошок GM1 имеет содержание Fuc-GM1 менее 0,1%, измеренное ВЭЖХ.
Сравнительный пример
Осуществляли способ получения и очистки GM1, как в вышеописанном Примере 1, за исключением того, что в колоночной хроматографии метанол: метанольный раствор ацетата калия заменяли на метанол: метанольный раствор ацетата натрия.
Получили 3100 г порошка GM1, содержащего 91% GM1 и 8% Fuc-GM1, как измерено ВЭЖХ.
Из вышеупомянутых примеров можно видеть, что получается намного более низкая чистота GM1, если для элюирования GM1 используют ацетат натрия. Данный результат может быть обусловлен тем фактом, что противоион натрия не делает различия между GM1 и Fuc-GM1 в процессе элюирования, по сравнению с противоионами калия или цезия, которые, напротив, полностью разделяют оба пика.

Claims (17)

1. Способ выделения и очистки моносиалоганглиозида GM1, включающий стадии:
(а) отделения GM1 от Фукозила GM1 в липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, с помощью колоночной ионообменной хроматографии с использованием элюента, содержащего ионы калия или цезия,
(б) извлечения растворенного вещества из элюированного раствора,
(в) диафильтрации водного раствора извлеченного растворенного вещества стадии (б),
(г) добавления натриевой соли и диафильтрации полученного водного раствора,
(д) извлечение GM1 в форме его натриевой соли.
2. Способ по п.1, в котором элюент содержит ацетат цезия или калия.
3. Способ по п.2, в котором элюент является метанольным раствором ацетата цезия или калия.
4. Способ по п.1, в котором ионообменная колонка содержит смолу, имеющую четвертичную аминогруппу.
5. Способ по п.1, в котором ионообменную колонку сначала уравновешивают метанолом.
6. Способ по п.1, в котором NaCl добавляют на стадии (г).
7. Способ по п.1, в котором диафильтрацию осуществляют с использованием мембраны, имеющей размер пор 10000-100000 Да.
8. Способ по п.1, в котором извлечение GM1 на стадии (д) включает сушку раствора пермеата распылительной сушкой или вакуумной сушкой с образованием порошка.
9. Способ по п.1, включающий стадию предварительной очистки GM1 перед разделением ионообменной хроматографией, причем указанная стадия очистки включает:
(a) диафильтрацию водного раствора липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, через мембрану, имеющую размер пор 10000-100000 Да,
(b) концентрирование пермеата и извлечение растворенного вещества липидной смеси, содержащей GM1.
10. Способ по п.1, в котором липидную смесь, содержащую моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, получают гидролизом липидного экстракта, содержащего смесь ганглиозидов, имеющую чистоту по меньшей мере 50%.
11. Способ по п.10, в котором гидролиз осуществляют обработкой липидного экстракта сиалидазой Arthrobacter ureafaciens штамма S или сиалидазой Vibrio cholerae.
12. Способ очистки моносиалоганглиозида GM1, включающий отделение моносиалоганглиозида GM1 от Фукозила-GM1 в липидной смеси, содержащей моносиалоганглиозид GM1 в качестве основного ганглиозидного компонента, ионообменной колоночной хроматографией с использованием элюента, содержащего ионы цезия или калия.
13. Препарат моносиалоганглиозида GM1 из свиньи, полученный способом по п.12, имеющий чистоту 99,0% или более и содержащий менее 0,1% Фукозила GM1.
14. Препарат моносиалоганглиозида GM1 по п.13 для применения в качестве медикамента.
15. Способ лечения нарушений и заболеваний центральной и периферической нервной системы, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество препарата моносиалоганглиозида GM1 по п.13.
16. Способ по п.15, в котором нарушение или заболевание центральной или периферической нервной системы выбрано из группы, состоящей из мозгового инсульта, болезни Паркинсона, повреждения спинного мозга, болезни Альцгеймера, поздней дискинезии, амиотрофического бокового склероза, периферической невропатии и автономной невропатии.
17. Применение препарата моноганглиозида GM1 по п.13 для производства фармацевтической композиции для лечения нарушений и заболеваний центральной и периферической нервной системы.
RU2008124890/15A 2007-06-18 2008-06-17 Способ получения чистого моносиалоганглиозида gm1 для применения в медицине RU2483736C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/812,331 US7943750B2 (en) 2007-06-18 2007-06-18 Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use
US11/812,331 2007-06-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008124890A RU2008124890A (ru) 2009-12-27
RU2483736C2 true RU2483736C2 (ru) 2013-06-10

Family

ID=39670910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008124890/15A RU2483736C2 (ru) 2007-06-18 2008-06-17 Способ получения чистого моносиалоганглиозида gm1 для применения в медицине

Country Status (13)

Country Link
US (4) US7943750B2 (ru)
EP (2) EP2377872B1 (ru)
KR (2) KR101503882B1 (ru)
CN (2) CN103951715A (ru)
CH (1) CH704106B1 (ru)
DK (2) DK2011799T3 (ru)
ES (2) ES2542347T3 (ru)
HK (1) HK1123559A1 (ru)
MY (1) MY157713A (ru)
PL (2) PL2377872T3 (ru)
PT (2) PT2011799E (ru)
RU (1) RU2483736C2 (ru)
TW (2) TWI415615B (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9394558B2 (en) 2009-09-01 2016-07-19 Lz Therapeutics, Inc. Methods for extraction and purification of gangliosides
US9556467B2 (en) 2012-01-20 2017-01-31 Garnet Bio Therapeutics, Inc. Methods of ganglioside production
RU2632710C2 (ru) * 2016-03-31 2017-10-09 Лонг Шенг Фарма Лимитед Способ получения натрий моносиалового ганглиозида и нейропротекторное средство на его основе
RU2632709C1 (ru) * 2016-07-27 2017-10-09 Лонг Шенг Фарма Лимитед Нейропротекторный агент из свиного мозга на основе натрий моносиалового ганглиозида
US11091591B2 (en) 2015-09-16 2021-08-17 Universität Basel Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103191196B (zh) * 2013-04-03 2015-04-01 中国科学院过程工程研究所 肉苁蓉功能成分的集成化超声循环提取及分离工艺
CN104195200A (zh) * 2014-09-01 2014-12-10 华东理工大学 一种运用重组唾液酸酶转化多唾液酸神经节苷脂制备单唾液四己糖神经节苷脂的方法
CN106986902A (zh) * 2017-03-20 2017-07-28 泸州瑞兴生物工程有限公司 提高单唾液酸四己糖神经节苷脂钠成品纯度的精制方法
CN106905387A (zh) * 2017-03-20 2017-06-30 泸州瑞兴生物工程有限公司 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制备方法
CN107688093B (zh) * 2017-08-25 2020-04-07 李红俊 肺癌检测试纸条、试剂盒及其使用方法
CN109721632B (zh) * 2017-10-27 2023-10-31 齐鲁制药有限公司 一种高纯度神经节苷脂gm1及其制备方法
CN110075817A (zh) * 2019-03-15 2019-08-02 无锡加莱克色谱科技有限公司 一种用于分离总神经节苷脂的疏水色谱填料及其制备方法
CN112961202A (zh) * 2021-03-15 2021-06-15 武汉糖智药业有限公司 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法
KR102586733B1 (ko) * 2021-03-30 2023-10-16 경성대학교 산학협력단 강글리오사이드 GM3, GM4, GD1b, GD1a 및 GM1을 포함하는 비경구용 제제의 제조 방법
CN113866310B (zh) * 2021-09-28 2023-01-17 吉林天成制药有限公司 含猪脑神经节苷脂成分药物制剂的指纹图谱检测方法及应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0150712A2 (en) * 1984-01-04 1985-08-07 Bioiberica, S.A. Method for the obtention of a glycosphingolipid complex
EP0451270A1 (en) * 1988-05-02 1991-10-16 Marukin Shoyu Co., Ltd. Process for preparing asialo gm1
EP0540790A1 (en) * 1991-11-05 1993-05-12 Beta Pharmaceuticals Co. Method of obtaining monosialogangliosides
US5532141A (en) * 1995-06-13 1996-07-02 Holler; Larry D. Process for obtaining ganglioside lipids
US5756314A (en) * 1996-03-01 1998-05-26 Takara Shuzo Co., Ltd. Method for preparation of monosialoganglioside GM1
EP0770389B1 (en) * 1992-03-13 2001-09-26 FIDIA FARMACEUTICI S.p.A. Use of monosialoganglioside GM1 or N-dichloro-acetyl-lyso-GM1 for preventing or reversing neuronal degeneration induced by a long term treatment with L-DOPA in the therapy of Parkinson's disease
RU2195296C2 (ru) * 2000-04-12 2002-12-27 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Способ получения ганглиозидов
CN1814610A (zh) * 2005-02-02 2006-08-09 商宗一 大批量高纯度神经节苷脂化合物的制备方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5877894A (ja) 1981-11-05 1983-05-11 Mitsui Toatsu Chem Inc 蛋白質の除去方法
IT1199116B (it) 1984-07-03 1988-12-30 Fidia Farmaceutici Derivati di gangliosidi
JP2724588B2 (ja) 1988-05-02 1998-03-09 丸金醤油株式会社 ノイラミニダーゼ・アイソザイムｓ及びガングリオシド類の製造法
IN170630B (ru) 1988-11-04 1992-04-25 Council Scient Ind Res
WO1990009185A1 (en) * 1989-02-16 1990-08-23 Angio-Medical Corp. Composition and method for treatment of gastric and duodenal ulcers and mucosal erosions
IT1243340B (it) * 1990-07-13 1994-06-10 Crinos Industria Farmaco Metodo per isolare e purificare il monosialoganglioside ad elevato grado di purezza da una miscela lipidica che lo contiene e relativo composto intermedio
IT1241332B (it) 1990-12-04 1994-01-10 Firestone Int Dev Spa Metodo per la realizzazione di un componente armato di una carcassa di pneumatico di veicolo
ES2148150T3 (es) 1991-05-16 2000-10-16 Fidia Spa Metodo para la preparacion y purificacion de una mezcla de glicoesfingolipidos libre de contaminacion por virus no convencionales.
IT1254706B (it) * 1991-12-23 1995-10-09 Fidia Spa Uso terapeutico del ganglioside gm1 nel trattamento del danno al midollo spinale
WO1998003529A1 (fr) 1996-07-19 1998-01-29 Takara Shuzo Co., Ltd. Procede de preparation de sphingolipides et de derives de sphingolipides
JP3929085B2 (ja) 1996-04-26 2007-06-13 雪印乳業株式会社 ガングリオシド高含有組成物の製造法
CN1189488C (zh) 2000-11-03 2005-02-16 中国石油天然气股份有限公司 高反应活性聚异丁烯的制备方法
CN1353112A (zh) * 2000-11-09 2002-06-12 重庆富进生物医药有限公司 单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺
CN1182253C (zh) 2001-10-30 2004-12-29 齐鲁制药厂 单唾液酸四己糖神经节苷脂gm1的制备方法
CN1158295C (zh) 2002-04-16 2004-07-21 广州市力拓发展有限公司 一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0150712A2 (en) * 1984-01-04 1985-08-07 Bioiberica, S.A. Method for the obtention of a glycosphingolipid complex
EP0451270A1 (en) * 1988-05-02 1991-10-16 Marukin Shoyu Co., Ltd. Process for preparing asialo gm1
EP0540790A1 (en) * 1991-11-05 1993-05-12 Beta Pharmaceuticals Co. Method of obtaining monosialogangliosides
EP0770389B1 (en) * 1992-03-13 2001-09-26 FIDIA FARMACEUTICI S.p.A. Use of monosialoganglioside GM1 or N-dichloro-acetyl-lyso-GM1 for preventing or reversing neuronal degeneration induced by a long term treatment with L-DOPA in the therapy of Parkinson's disease
US5532141A (en) * 1995-06-13 1996-07-02 Holler; Larry D. Process for obtaining ganglioside lipids
US5756314A (en) * 1996-03-01 1998-05-26 Takara Shuzo Co., Ltd. Method for preparation of monosialoganglioside GM1
RU2195296C2 (ru) * 2000-04-12 2002-12-27 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Способ получения ганглиозидов
CN1814610A (zh) * 2005-02-02 2006-08-09 商宗一 大批量高纯度神经节苷脂化合物的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KADOWAKI H. et al Separation of brain monosialoganglioside molecular species by high-performance liquid chromatography. J Lipid Res., 1984, v.25(10), p.1132-9. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9394558B2 (en) 2009-09-01 2016-07-19 Lz Therapeutics, Inc. Methods for extraction and purification of gangliosides
US9556467B2 (en) 2012-01-20 2017-01-31 Garnet Bio Therapeutics, Inc. Methods of ganglioside production
US11091591B2 (en) 2015-09-16 2021-08-17 Universität Basel Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids
RU2632710C2 (ru) * 2016-03-31 2017-10-09 Лонг Шенг Фарма Лимитед Способ получения натрий моносиалового ганглиозида и нейропротекторное средство на его основе
RU2632709C1 (ru) * 2016-07-27 2017-10-09 Лонг Шенг Фарма Лимитед Нейропротекторный агент из свиного мозга на основе натрий моносиалового ганглиозида

Also Published As

Publication number Publication date
US7943750B2 (en) 2011-05-17
TWI415615B (zh) 2013-11-21
KR20140130404A (ko) 2014-11-10
DK2011799T3 (en) 2015-07-06
ES2844301T3 (es) 2021-07-21
PT2011799E (pt) 2015-08-27
EP2377872B1 (en) 2020-10-21
US20110178035A1 (en) 2011-07-21
PL2377872T3 (pl) 2021-04-06
CN101328196B (zh) 2014-05-14
MY157713A (en) 2016-07-15
CN101328196A (zh) 2008-12-24
PT2377872T (pt) 2021-01-14
EP2377872A1 (en) 2011-10-19
ES2542347T3 (es) 2015-08-04
US20160375046A1 (en) 2016-12-29
PL2011799T3 (pl) 2015-09-30
CN103951715A (zh) 2014-07-30
US9498490B2 (en) 2016-11-22
KR20080111398A (ko) 2008-12-23
TWI530291B (zh) 2016-04-21
TW200906420A (en) 2009-02-16
EP2011799A1 (en) 2009-01-07
US20140107045A1 (en) 2014-04-17
RU2008124890A (ru) 2009-12-27
HK1123559A1 (en) 2009-06-19
DK2377872T3 (da) 2021-01-18
CH704106B1 (fr) 2012-05-31
TW201350123A (zh) 2013-12-16
US20080312165A1 (en) 2008-12-18
KR101503882B1 (ko) 2015-03-18
EP2011799B1 (en) 2015-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2483736C2 (ru) Способ получения чистого моносиалоганглиозида gm1 для применения в медицине
CN101108868B (zh) 制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法
AU2004209371B2 (en) Process for producing sugar chain asparagine derivative
KR20140050605A (ko) 간암의 재발, 악화 또는 전이 억제용 의약조성물
US20070141678A1 (en) Processes for purifying oligosaccharides
US3163636A (en) Genuine escin from horse chestnut extracts, and process of producing same
US6734300B2 (en) Acarbose purification process
ITMI971880A1 (it) Procedimento per la preparazione di acarbosio
CN111250068B (zh) 乙酰化介质填料用于分离纯化茶儿茶素的用途和方法
JP5569877B2 (ja) キチンオリゴ糖誘導体及びｎ−アセチルラクトサミン誘導体並びにそれらの製造方法
JPH0655766B2 (ja) グルコサミノオリゴ糖の精製法
JP2835152B2 (ja) アラビノキシロオリゴ糖
JP3048628B2 (ja) 還元ヘキサ―ｎ―アセチル―キトヘキサオースを有効成分とする抗腫瘍剤
RU2632709C1 (ru) Нейропротекторный агент из свиного мозга на основе натрий моносиалового ганглиозида
JPH0469160B2 (ru)
JPH03135991A (ja) 哺乳類の神経組織からガングリオシド類を得る方法及び該物質組成物を用いた精神的器質性疾患の治療方法
CN112812142A (zh) 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的精制方法
JPH06253879A (ja) グルクロン酸結合オリゴ糖の分離方法