JPH0655766B2 - グルコサミノオリゴ糖の精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグルコサミノオリゴ糖を分子量（重合度）に応
じて分別する方法に関する。

〔従来の技術〕

グルコサミノオリゴ糖（以下、オリゴ糖と略記する）お
よびその誘導体であるＮアセチルグルコサミノオリゴ糖
は、抗菌作用のあることから食品への添加、抗感染症効
果、制癌効果のあることから医薬品への応用、リゾチー
ムの基質となり得ることから診断薬としての応用、また
植物生理活性物質であることが報告されている。特に４
量体以上のオリゴ糖は、応用範囲が広く今後の発展が期
待される物質である。

ところでオリゴ糖は、キトサンを酵素または、酸により
部分加水分解することにより得られる糖である。

なおキトサンはえび、かになどの甲殻類の殻、昆虫類の
外殻、菌類の細胞壁の構成成分として含まれているキチ
ンを、熱濃アルカリ処理することにより得られる脱アセ
チル体である。

上記キトサンの加水分解液は種々雑多な分子量（重合
度）のオリゴ糖を含む混合液である。オリゴ糖を高度に
利用するためには、各分子量（重合度）別に分け、それ
ぞれの用途に利用することが重要である。通常オリゴ糖
混合液から各分子量毎に分別する方法としては、アンバ
ーライト−120、ダウエックス50Ｗ等の強酸型のイオン
交換樹脂を用い、塩酸を順次１Ｎ〜６Ｎまで濃度を上昇
させて溶出する方法が採用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来の溶出方法では強酸性のイオン交換樹脂をカラ
ム充填剤として使用しているので、カラム充填剤とオリ
ゴ糖との吸着親和力がつよく、オリゴ糖の溶出には高濃
度強酸（１Ｎ〜６Ｎ塩酸）が必要であった。

したがって、溶出液は、強酸性であり、溶出液中におい
て、溶出したオリゴ糖の二次的な分解が起る可能性があ
り、通常は溶出後冷却し直ちに炭酸鉛等で酸を中和除去
する必要があった。

しかも溶出液は、多量の強酸中に微量のオリゴ糖を含む
ので、酸を中和沈澱分離するときオリゴ糖が沈澱に吸着
することも多く、また中和剤も多量に必要であった。

本発明は上記従来の欠点を解消し、溶出に高濃度強酸を
使用する必要がなく、従って溶出液中の酸を中和除去す
る必要もなく、従来のような沈澱物へのオリゴ糖の吸着
を解消することができる方法を提供することを目的とす
るものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成する本発明のグルコサミノオリゴ糖の精
製法は、水酸基を有する高分子に、カルボキシメチル基
を導入した高分子をクロマト充填剤として用いることを
特徴とするものである。

以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明によれば、たとえばキトサンの加水分解により得
られたグルコサミノオリゴ糖混合溶液を、水酸基および
カルボキシメチル基を有するイオン交換樹脂を充填した
カラムに供給して前記グルコサミノオリゴ糖を該イオン
交換樹脂に吸着させ、次いで酸、塩またはそれらの混合
溶液を供給してイオン交換樹脂に吸着したグルコサミノ
オリゴ糖を溶出させる。

また、このようにして用いるカラム充填剤の強度を適当
にするため一部架橋処理を行なっても良い。

本発明において重要なことは、水酸基およびカルボキシ
メチル基（以後ＣＭ基と記す）を含有するイオン交換樹
脂をカラム充填剤として用い、このカラム充填剤にオリ
ゴ糖を吸着させることにある。

ＣＭ基は極めて弱酸性基であるので、ＣＭ基を含むイオ
ン交換樹脂はほとんどの中性塩を分解しないが、水酸基
はオリゴ糖中の水酸基と水素結合により弱い結合力を示
す。この水酸基およびＣＭ基を含む弱酸性イオン交換樹
脂（以後充填剤と記す）をカラムに充填し、オリゴ糖混
合液を供給するとオリゴ糖、充填剤との間に微弱な吸着
力が働きオリゴ糖は充填剤に吸着される。

次いでオリゴ糖が吸着された充填剤に、溶出液として酸
溶液、塩溶液またはこれらの混合液を流すと、充填剤と
オリゴ糖の吸着力の差（オリゴ糖の分子量の相違）によ
ってオリゴ糖は順次溶出される。

オリゴ糖の溶出法としては通常のクロマト法で用いられ
る方法が用いられる。すなわち、上述した一定濃度の溶
出液で溶出する方法や、溶出液を一定量づつ流し段階的
に順次濃度を上昇させる方法（stepwise法）、溶出液に
濃度勾配をつける方法（Gradient法）などが適用でき
る。

いずれの溶出法を用いるかは、充填剤と溶出液の組み合
わせ、操作の難易により決めることができる。

本発明において用いる充填剤としては、ＣＭトヨパール
650（東ソー製）ＣＭ−セファデックス（Sephadex、Phar
macis Fine Chemicals製）セルロファイン（Cellulofin
e、チッソ製）ＣＭバイオゲルＡ（バイオ・ラッド製）
セレックスＣＭ（バイオ・ラッド製）なとが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。

また溶出液としては、塩酸、酢酸、硫酸、食塩、酢酸ナ
トリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の0.
001〜1.0Ｎ希薄水溶液が用いられ、塩酸、食塩等の希薄
溶液が経費、後処理の関係上好ましい。

特に塩酸は揮発性であること、およびオリゴ糖の塩酸塩
が比較的溶解度が低いことからオリゴ糖を得る上でより
好ましい。

分別に供するオリゴ糖混合液としては、キトサンの加水
分解等により得られる雑多な分子量のオリゴ糖を含むも
のをそのまま用いても良いが、充填剤による分別効果を
より高めるために、オリゴ糖のメタノールに対する溶解
度を利用して、キトサンの加水分解により得られたオリ
ゴ糖混合液を粗分別し、目的とするオリゴ糖を多く含む
試料にあらかじめ調整しておくことが好ましい。すなわ
ちメタノール／水１／１混合溶媒に不溶部（Ａ区分）は
分子量が高くカラムを通す前に除去しておくことが望ま
しい。９／１不溶部（Ｂ区分）には８量体以上のオリゴ
糖が含まれ、純メタノール不溶部（Ｃ区分）からは６−
８量体を多く含む試料が得られ、純メタノール可溶部
（Ｄ区分）は２−５量体を多く含む試料となる。したが
って分別目的に応じて必要なオリゴ糖を多く含む区分を
カラムに供給することが能率的である。

以下、本発明の実施例を示す。

実施例１ オリゴ糖の調製 キトサン10ｇを水500mlに分散させ良くぼうじゅんさせ
てから氷酢酸12mlを注入しキトサンを溶解させた。この
キトサン溶解液に５％炭酸ナトリウム溶液を加え、pH5.
6とした。次いで酵素２ｇを含む水溶液を加え全体を１
にした。40℃で６時間反応させた後、１Ｎ塩酸50mlを
加え酵素反応を停止させた。反応液を煮沸し、酵素を沈
澱させた。得られたオリゴ糖溶液をろ過濃縮し、メタノ
ールを加えることにより前記Ａ−Ｄ区分にそれぞれ分別
した。

オリゴ糖の分別 ＣＭトヨパール650Sを充填したカラム（カラム径10mm、
長さ900mm）を用意し、オリゴ糖Ｃ区分250mgを供給し
た。次いで初め水を200ml流した後に、0.01Ｎ塩酸で、2
50ml溶出させ、フラクションコレクターで分取した。液
体クロマトグラフィーで溶出成分を検出し同じ成分を含
む区分を集めた。それぞれ集めた区分を通常の結晶化
法、すなわち塩酸酸性溶液を減圧下でゆっくり濃縮する
ことにより結晶化させた。以下の要点を表１に示す。

実施例２ 充填剤としてセルロファインC-200を実施例１と同様に
用い、オリゴ糖Ｂ区分を分別した。溶出には塩酸をstep
wiseに用いた。要点を表１に併記する。

実施例３ 充填剤としてＣＭバイオゲルＡを用いて実施例１と同様
にオリゴ糖Ｂ区分を分別した。溶出には酢酸ナトリウム
と食塩の混合溶液を用いた。要点を表１に示す。

実施例４ 充填剤としてＣＭセファデックスを用いて実施例１と同
様にオリゴ糖Ｄ区分を分別した。溶出は食塩溶液をgrad
ientに用いた。要点を表１に示す。

実施例５ 実施例１と同じカラムに、予備分別していないオリゴ糖
250mgを含む試料を吸着させて0.01N HCl 300mlで溶出さ
せた。初めに３，４，５量体が同時に溶出し、次いで
６，７，８量体がそれぞれ溶出した。しかしそれ以上の
ものは吸着されたままのため0.5N HCl 200mlで洗浄し
た。洗浄液に９量体以上の分子量区分が含まれていた。

〔発明の効果〕

グルコサミノオリゴ糖を分離精製する場合、本発明によ
る充填剤を用いることにより、希薄な酸、塩でオリゴ糖
を溶出することが可能となり、以後結晶を得るまで装
置、操作が容易となった。本発明は、オリゴ糖を得る有
力な手段となり得るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 31/73 ＡＤＺ 8314−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｐ 8310−2Ｊ 30/88 Ｎ 8310−2Ｊ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水酸基を有する高分子に、カルボキシメチ
   ル基を導入した高分子をクロマト充填剤として用いるこ
   とを特徴とするグルコサミノオリゴ糖の精製法。
2. 【請求項２】水酸基を有する高分子がポリビニルアルコ
   ール、セルロース、アガロースおよびデキストランから
   なる群から選ばれる請求項１記載のグルコサミノオリゴ
   糖の精製法。