JPS6219530A - 糖蛋白複合体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 するものである。

本発明者らは、担子菌フクロタケ（学名’Ｖｏｌｖａｒ
ｉａｌｌ＆マｏｌｖ閘ｅａ　）から、抽出法により抗腫
癖活性を有する物質を製造することに成功し、その活性
成分としてβ−１．３グルカンを提供した（特開昭５９
−５３４２４参照）。

本発明者らは、その後さらに鋭意研究なかさねた結果、
担子菌フクロタテ（゛以下７クロタヶと称す）の中には
、上記のβ−１．５グルカンとは全く異った性状の抗腫
瘍性物質を見出し本発明をなすにいたった。

従って本発明の目的は、抗腫瘍性を有する新規な糖蛋白
複合体を提供すること忙ある。本発明の糖蛋白複合体は
、後述するごとくザルコーマ１８０固型癌に対し、非常
に強い抑制作用を示し、毒性は極めて低い。

本発明の目的はさらに１上記糖蛋白複合体を製造する方
法を提供することにある。

本発明の方法によれば、上記糖蛋白複合体は、フクロタ
フの冷アルカリ抽出画分をイオン交換クロマトグラフィ
ーで処理後ひきつづきゲル濾過処理することによって製
造される。

本発明は第１に、フクｐタケより得られる下記特性を有
する糖蛋白複合体からなる。

（イ）色と形状 白色であり、無定形状の粉末である。

（ロ）溶解性 水に可溶であり、ジメチルスルホキシドにも可溶である
。

メタノール，アセトン，ジエチルエーテル。

ベンゼン，クロロホルムなどＫは不溶である。

（ハ）分子量 移動相として１１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衡液
を用い、ゲル濾過剤としてセ７アクリルーＳ−４００を
用いたゲル濾過法（よれば、分子量は１万〜５万である
。

に）組成 レーリーフォリン法で定量した蛋白質量に対するフェノ
ール硫酸法で定量した糖質量の重量比率が２０／８０〜
８０／２０の範囲にある。糖質はグルコースのみからな
り、蛋白質は、主としてアスパラギン酸、グルタミン酸
、アラニン、ロイシン、バリン、グリシンからなるアミ
ノ酸から構成される。

（ホ）元素分析値 下記の値を与える。

０：４０〜５３％ Ｈ：５．８〜＆８％ Ｎ：２．８〜１２％ （へ）赤外吸収スペクトル 第１図に示す。

本発明は第２に、フクロタケの冷アルカリ抽出画分をイ
オン交換クロマトグラフィーで処理し、しかる後ゲルｐ
適法で処理して上記特性を有する糖蛋白複合体の製造法
からなる。

本発明は第５に、上記イオン交換クロマトグラフィー処
理において、まずフクロタケの冷アルカリ抽出画分を、
陰イオン交換型のカラムを用いてまず第１番目にリン酸
緩衡液で溶出させ、第２番目に塩化ナトリウム溶液で溶
出させ、さらに第５番目に水酸化ナトリウム溶液で溶出
させた画分のうち、第２番目の画分を採取し、ひきつづ
いてこれを分画分子量１万〜５０万のゲル濾過剤を用い
て、ｃＬ１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衡液とする
ゲル濾過法罠供し、分子量１万〜５万に溶出する画分を
採取してなる上記糖蛋白複合体の製造法からなる。

以下に１本発明物質の製造法を詳しく説明する。

本発明物質は、フクロタケを冷アルカリで抽出した画分
をイオン交換クロマトグラフィーで処理し、しかる後ゲ
ルｐ適法で処理することによって調製することができる
。

本発明の方法で原料として用いるフクロタケは、その子
実体及び菌糸体のいずれであってもよい。

そしてこれらは生の状態であっても乾燥品であってもよ
い。

抽出にあたり、原料をあらかじめ細断することは、抽出
効率をあげるために有効である。

抽出に用いるアルカリ水溶液としては、例えば水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物を
用いることができる。特に水酸化ナトリウム水溶液が便
利である。

用いるアルカリの濃度は特に限定的ではないが、約１１
規定ないし約３規定の範囲内で用いるのが好ましい。

抽出に用いるアルカリ水溶液の量は、通常１回の抽出あ
たり、原料乾燥重量の約５ないし約１００倍箪量程度で
ある。この量は少なすぎれば抽出効率が悪く、多すぎれ
ば後処理が面倒である。

この抽出工程においては、多糖の分解又は過酸化等の変
性を防ぐため、窒素等の不活性ガスの芥凹気下で抽出を
行うことが好ましい。

また、さらに水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在
下で行ってもよい。

抽出温度には格別の限定はないが、約３０℃以下が望ま
しい。さらに高温、例えば通常の熱アルカリ抽出の温度
条件である６０ないし８０℃程度で抽出すると、抗腫瘍
活性の小さい多糖類なども抽出されるからである。

抽出操作は、くり返し行ってもよい。

本発明に用いるフクロタケは、多くの成分をその菌体内
に含んでいる。従って、アルカリ水溶液でそのまま抽出
すれば、種々の夾雑物がアルカリ水溶液中に含まれてし
まう。この抽出液から目的の糖蛋白複合体を精製するこ
とは可能ではあるが煩雑な工程を必要とする。従って、
アルカリ水溶液で抽出する工程に先たち、水、熱水、緩
衝水溶液、アルコール又はこれらを組合せた溶媒により
、これらの夾雑物を除去しておくことが好ましい。

上記方法で調製した目的物質を含むアルカリ水溶液は、
陰イオン交換クロマトグラフィーに供する前にアルカリ
金属水酸化物を除いておく必要がある。即ち、アルカリ
水溶液のまま陰イオン交換クロマトグラフィーに供すれ
ば、実質的にイオン交換能を喪失し、すべての溶質が溶
出してしまうからである。

アルカリ金属水酸化物を除く方法としては、セリファン
チュブなどを用いた透析操作、あるいは一般的な限外濾
過操作など通常用いられる脱塩方法が使用できる。

又、上記透析操作において透析外液にリン酸緩衡液を用
いて透析を行い、目的物質を含む画分をリン酸緩衝溶液
としておくと、長期にわたり析出物などを生ずることが
なく便利である。この除用いるリン酸緩衡液は、ｐＨが
約８．濃度が約α０１Ｍのものを用いるのが良い。

上記のようにして得た目的物質を含む冷アルカリ抽出画
分の水溶液もしくはリン酸緩衝溶液を陰イオン交換クロ
マトグラフィーに供する。

用いる陰イオン交換体としては、ＤＩ！：ＡＥ−セルロ
ース、ＤＫＡＥ−セファデックス、ＤＩＣＡＥ−セファ
セル、ＤＥＡＩＣ−）ヨパールナト通常用いられる陰イ
オン交換体であればいずれでもよい。

溶出操作は以下のようＫして行う。

第１番目に用いる溶離液としては、リン酸緩衡液を用い
る。用いるリン酸緩衡液は、その濃度がαＯＩ　ＭＰ−
α１Ｍで、ｐＨが７以上８以下であればよく、望ましく
は、濃度が約α０１Ｍ、ｐＨがｚ８のものがよい。又、
溶離液量量はカラム容量の１〜１０倍容、好ましくは２
倍容程度がよい。

ひきつづいて、塩化ナトリウム溶液による２番目の溶出
操作を行う。この際、塩化ナトリウム溶液の濃度は、ｃ
Ｌ１〜１Ｍのものが用いられる。

（ＬＩＭより濃度が低いと目的物を溶出し得ないし、１
Ｍ以上でも溶出能は変わらない。通常は、ＩｌｌＬ５Ｍ
程度の塩化す）　リウム溶液が用いられる。溶離液量は
、カラム容量の１〜１０倍容、好ましくは２倍容程度が
よい。

この２番目の溶出操作によって、目的物質を含む画分が
得られる。

第３番目の溶出操作は、カラム再生のための操作であり
、目的物を溶出させた後もなお残る不純物の除去を行う
ものである。

この際の溶離液は、水酸化ナトリウム溶液が用いられ、
濃度が［Ｌ１規定以上であれば十分その目的を達成し得
る。このあと水洗を十分行えば、再び使用に供すること
ができる。

上記のようにして得た塩化す）　ＩＪウム溶液溶出画分
は、ひきつづき行われるゲル濾過処理に供する。

この際、得られた塩化す）　ＩＪウム溶液溶出画分を、
そのままゲル濾過に供してもよいし、必要とあれば透析
操作、限外ｐ過操作など通常の方法で脱塩した後、ゲル
濾過に供してもよい。もちろん上記操作で脱塩後凍結乾
燥などで固体とし、そのあと後述する移動相に再溶解し
てゲル濾過してもなんらさしつかえない。但し、塩化ナ
トリウム溶液溶出画分をそのままゲル濾過に供する場合
には、塩濃度がα１Ｍ以下になるように水で希釈する必
要がある。このようにしないとゲル濾過でよい分離が得
られない。

用いるゲル濾過剤は、分画分子量１万〜５０万であるセ
ファデックス、セファロース、セファクリル、トヨパー
ルなど通常用いられるゲル濾過剤が使用できる。

移動相としては、１１Ｍの塩化ナトリウムを含むリン酸
緩衡液が、目的物質を含む画分のよい分離能を与える。

リン酸緩衡液の濃度は、約１０１Ｍのものがよい。溶出
液量は、カラム容量の１〜１０倍容好ましくは２倍容程
度が用いられる。

採取する溶出画分は、分子量既知の物質（例えば既知分
子量のデキストラン）を用いて、目的とする分子量範囲
のものが溶出する時間あるいは溶出液量を決めておきそ
の画分を採取するが、本発明では、分子量１万〜５万に
目的物質が含まれているので、この画分を集める。

上記採取した画分には、リン酸塩などの塩が含まれてい
るので、透析操作あるいは限外口過操作など通常の方法
で脱塩し、必要とあればロータリーエバポレーターなど
で濃縮し、そのまま真空乾燥器などで乾固もしくは凍結
乾燥などを行って本発明の目的物を得る。

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 〔原料調製〕 風乾したフクロタケ子実体５００ｇを、ｐＨ７，０゜（
ＬＩＭのリン酸緩衡液２ｔに一夜浸した後、ミキサーお
よびホモジナイザーで破砕した。さらにこれに同じリン
酸緩衡液８Ｌを加えて２４時間攪拌し遠心分離した。得
られた固型分を、１０ｔの水に分散させ、オートクレー
ブ中、１２０℃で３０分間加熱した。冷却後、遠心分離
して沈澱を得た。

この熱水抽出処理をもう一度くり返し、水溶性画分をほ
ぼ完全圧抽出除去した。

こうして得られた水不溶性画分を、水素化ホウ素ナトリ
ウム５９を溶解させた１規定水酸化ナトリウム水溶液Ｂ
ｔＫ分散させた。窒素気流下に２５℃で４時間攪拌した
後、遠心分離した。この沈澱に対して１規定水酸化ナト
リウム水溶液による抽出操作をくり返した。雨水酸化す
）　ＩＪウム抽出液を合併し、ガラスフィルターで濾過
した。

このＰ液に酢酸を加え、ｐＨ７，ＯＫ中和した。

中和液を９．０００　Ｇで５０分間遠心分離し、生ずる
沈澱を除失し、ざらに上清はガラスフィルターで濾過し
た。このＦ液を４を迄ロータリーエバポレーターで濃縮
し、−液水道水で流水透析した後再び透析内液をロータ
リーエバポレータ−テ２．５を迄濃縮し、今度は透析外
液をα０１Ｍ、ｐＨ７，８のリン酸緩衡液として、毎日
透析外液を上記リン酸緩衡液Ｋかえながら１週間透析し
た。

このようにして冷アルカリ抽出画分を固型物として２５
ｇを含む１０１Ｍ、ｐＨ７，８（７）リン酸緩衝溶液１
ｓｔを得た。

〔陰イオン交換クロマトグラフィー処理及びゲル濾過処理〕

先Ｋｌｉ製した冷アルカリ抽出物１００ｓ９を含む（Ｌ
ＯＩＭ、ｑＨ７，８のリン酸緩衝溶液１０ＩＩＬｔを、
ファルマシア製ＤＩＡＩＩＣ−セファセルカラム（内径
３０．長さ４０　ｃｍ　）に供し、まず１０１Ｍ。

ｐＨ７，８のリン酸緩衡液１００ＩＬｔを流し、非吸着
画分を溶出させ、吸着画分を吸着させた。その後０．５
Ｍ塩化す）　ＩＪウム溶液１ｏｏＩＬｔを用いて溶出操
作を行った。このあと［１１規定水酸化ナトリウム溶液
１００ＩＬｔをカラムに流しよく水洗してカラムを再生
した。

α５Ｍ塩化ナトリウム溶液溶出画分１００−を集め、セ
ロファンチューブに入れ２日間流水透析した。透析内液
を凍結乾燥し、イオン交換クロマトグラフィー処理画分
５５■を得た。ついで上記画分のうち３０■をα１Ｍ塩
化ナトリウムを含む１０１Ｍ、ｐＨ７，８のリン酸緩衡
液に溶解させ、ファルマシア製セファクリル−５−４０
０（内径ｔ８ｃｒｎ、長さ１ｍ　）のカラムを用い、［
ＬＩＭの塩化ナトリウムを含むα０１Ｍ、ｐＨ７，８の
リン酸緩衡液を移動相としてゲル濾過を行い、分子量１
万〜５万の画分１５ａＪを集め、これを２日間流水透析
した後、透析内液を凍結乾燥して、白色で粉末状の本発
明の目的物２５■を得た。

（乾燥フクロタケ子実体からの収率的１．４５％）この
物の性質は下記の通りであった。

（イ）　ローリ−フォリン法で蛋白をフェノール硫酸法
で糖を定量したところ蛋白と糖のｆｆｉ量比率は２０／
８０であった。

（ロ）本物質を２規定硫酸で１００℃、２時間加水分解
した後アルジテートア＊チー）Ｋ変換し、ガスクロマト
グラフィーで分析したところ、グルコースのみが検出さ
れた。

（ハ）本物質を６規定塩酸で加水分解後アミノ酸分析計
で分析したところ第１表の結果を得た。

に）元素分析値 ０：　　４２．１％ Ｈ：　　　５．９％ Ｎ：　　　２．９％ （ホ）赤外吸収スペクトル 第１図と同様に、　３３００．２９５０．１６６０゜１
５５０．１０８０　ｃｍ−”付近に強い吸収が認められ
る。

第１表　アミノ酸分析の結果 （数字はアスパラギン酸を１００とした時の割合−モル
比−） 実施例２ 体本約２３９のＩＯＲ系マウスを用い、本発明物質の糖
蛋白複合体のザルコーマ１８０固型腫瘍に対する効果を
試験した。腹水化されたザルコーマ１８０細胞６×１ｆ
個をマウスのそけい部皮下から背部に向は皮下接種した
。実験群は１群６匹とした。腫瘍細胞移植後翌日より１
０日間、１日１回薬剤を腹腔内にα１１Ｌｔずつ投与し
た。対照群としては、１１５％のカルボキシメチルセル
ロースを含む生理食塩水を用い、試験群は、本発明の糖
蛋白複合体を５■／　’９　／　＋１！Ｌ７の投与量に
なるように上記生理食塩水に溶解させて用いた。腫瘍移
植後３５日目に腫瘍を摘出して、その重量を測定した。

各群の腫瘍抑制率は次式により算出した。

ここで０：　対照群の平均腫瘍重量 Ｔ：　試験群の平均腫瘍重量 結果を第２表に示す。

第２表　抗腫瘍性試験結果 実施例３ 本発明の糖蛋白複合体を、平均体重的２３９の１ＯＲ雌
性マ′ウスに投与して急性毒性試験を行った結果、ＬＤ
、値は腹腔的投与で１０１００Ｏ／に９以上であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の糖蛋白複合体の赤外吸収スペクトル
である。 特許出願人　東洋曹達工業株式会社 手続ＩＩ甫正書（方式） 昭和６０年１１月２７日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）フクロタケより得られる下記特性を有する糖蛋白
   複合体。 （イ）色と形状 白色であり、無定形状の粉末である。 （ロ）溶解性 水に可溶であり、ジメチルスルホキシドにも可溶である
   。 メタノール、アセトン、ジエチルエーテル、ベンゼン、
   クロロホルムなどには不溶である。 （ハ）分子量 移動相として０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衡
   液を用い、ゲルろ過剤としてセファクリル−Ｓ−４００
   を用いたゲルろ過法によれば、分子量は１万〜５万であ
   る。 （ニ）組成 ローリーフォリン法で定量した蛋白質量に対するフェノ
   ール硫酸法で定量した糖質量の重量比率が２０／８０〜
   ８０／２０の範囲にある。 糖質は、グルコースのみからなり、蛋白質は、主として
   アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、
   バリン、グリシンからなるアミノ酸から構成される。 （ホ）元素分析値 下記の値を与える。 ０：４０〜５３％ Ｈ：５．８〜６．８％ Ｎ：２．８〜１２％
2. （２）フクロタケの冷アルカリ抽出画分を、イオン交換
   クロマトグラフィーで処理し、しかる後ゲルろ過法で処
   理することを特徴とする下記特性を有する糖蛋白複合体
   の製造法。 （イ）色と形状 白色であり、無定形状の粉末である。 （ロ）溶解性 水に可溶であり、ジメチルスルホキシドにも可溶である
   。 メタノール、アセトン、ジエチルエーテル、ベンゼン、
   クロロホルムなどには不溶である。 （ハ）分子量 移動相として０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衡
   液を用い、ゲルろ過剤としてセファクリル−Ｓ−４００
   を用いたゲルろ過法によれば、分子量は１万〜５万であ
   る。 （ニ）組成 ローリーフォリン法で定量した蛋白質量に対するフェノ
   ール硫酸法で定量した糖質量の重量比率が２０／８０〜
   ８０／２０の範囲にある。 糖質は、グルコースのみからなり、蛋白質は、主として
   アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、
   バリン、グリシンからなるアミノ酸から構成される。 （ホ）元素分析値 下記の値を与える。 Ｃ：４０〜５３％ Ｈ：５．８〜６．８％ Ｎ：２．８〜１２％
3. （３）イオン交換クロマトグラフィー処理において、ま
   ずフクロタケの冷アルカリ抽出画分を陰イオン交換型の
   カラムを用いて、まず第１番目にリン酸緩衡液で溶出さ
   せ、第２番目に塩化ナトリウム溶液で溶出させ、さらに
   第３番目に水酸化ナトリウム溶液で溶出させた画分のう
   ち、第２番目の画分を採取し、ひきつづいてこれを分画
   分子量１万〜５０万のゲルろ過剤を用いて、０．１Ｍ塩
   化ナトリウムを含むリン酸緩衡液を移動相とするゲルろ
   過法に供し、分子量１万〜５万に溶出する画分を採取す
   ることを特徴とする特許請求の範囲の第２項記載の糖蛋
   白複合体の製造法。