JPS61293923A - 抗腫瘍性を有する糖たん白複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗腫瘍活性を有する糖たん白複合体に関するも
のである。

〔従来の技術〕

本発明者等は担子菌フクロタケから抽出法により抗腫瘍
活性を有する物質を製造することに成功し、その活性成
分としてβ−１，５グルカンを確認した。（特開昭５９
−５３４２４参照）〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は更に効果的な抗腫瘍活性物質を得ることを目的
とする。

〔問題点を解決するための手段及び作用〕本発明者等は
更に研究を重ねた結果、フクロタケ中には上記のβ−１
，３グルカンとは異なった性状の抗腫瘍性物質を見出し
、本発明をなすに至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

が２０／８０〜８０／２０の範囲にあり、ジメチルスル
ホキシドを移動相とし、東洋曹達製Ｇ−５０００ＦＷ及
びａ−６０００ＦＷのカラムを用いたゲルテ過高速液体
クロマトグラフィーにおいて分子量５０００ないし５０
万の範囲に溶出する。

本発明物質の蛋白質部分のアミノ酸組成は、塩酸による
加水分解後、ニンヒドリン発色によるアミノ酸分析計で
分析した所、主成分としてアスパラギン酸、グルタミン
酸、アラニン、ロイシン。

バリン、グリシンのアミノ酸が検出された。

本物質をＫＢｒ錠剤法によって測定した赤外線吸収スペ
クトル蝙１図跡した。本物質は水、ジメチルスルホキシ
ドに可溶であり、アセトン、エチルアルコールに実質的
に溶解しない。

本発明物質の元素分析値は以下の通りである。

Ｃ：４０〜５３％ Ｈ：５８〜＆８％ Ｎ：’２．８〜１２％ ある。

と同様生理的に許容し得る薬剤に溶解または分散させて
、皮下、筋肉内、静脈内などへの注射その他の慣用の方
法によって投与することができる。

投与量は体重１にｇ当り約Ｑ、０５ないし約５（］Ｔｎ
９程度である。

以下に本発明物質の製造法を説明する。

本発明物質はフクロタケ属に属する担子菌、特にフクロ
タケ（ＶｏｌｖａｒｉｅＬｌａ　Ｖｏｌｖａｃｅａ　）
をアルカリで抽出した両分からフェノールで抽出するこ
とにより調製することができる。

本発明の方法で、原料として用いるフクロタケは、その
子実体及び菌糸体のいずれであってもよい。そしてこれ
らは生の状態であっても乾燥品であってもよい。抽出に
あたり原料をあらかじめ細断することは抽出効率をあげ
るために有効である。

抽出に用いるアルカリ水溶液としては、例えば水酸化ナ
ーリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水醸化物を
用いることができる。特に水酸化ナトリウム水溶液が便
利である。

用いるアルカリの濃度は特に限定的ではないが、約（Ｌ
１規定ないＬ約５規定の範囲内で用いるのが好ましい。

抽出に用いるアルカリ水溶液の量は通常１回の抽出あた
り、原料乾燥重量の約５ないし約１００倍量程度である
。この量は少なすぎれば抽出効率が悪く、多すぎれば後
処理が面倒である。

この抽出工程においては多糖の分解又は過酸化等の変性
を防ぐため、窒素等の不活性ガスの雰囲気下で抽出を行
うことが好ましい。またさらに水素化ホウ素ナトリウム
等の還元剤の存在下で行ってもよい。

抽出温度には格別の限定はないが、約３０℃以下が望ま
しい。さらに高温、例えば通常の、熱アルカリ抽出の温
度条件である６０ないし８０ｔ程度で抽出すると、分岐
の異なる多糖類が抽出されるからである。抽出操作はく
り返し行ってもよい。

本発明に用いるフクロタケは多くの成分をその菌体内に
含んでいる。従ってアルカリ水溶液でそのまま抽出すれ
ば種々の夾雑物が目的の多糖類中に含まれてしまう。こ
の抽出液から目的の多糖類を精製することは可能ではあ
るが煩雑な工程を必要とする。アルカリ水溶液で抽出す
る工程に先たち、水、熱水、緩衝水溶液、アルコール又
はこれらを組合せた溶媒により、これらの夾雑物を除去
しておくことが好ましい。なおこの様な操作によりアル
カリ水溶液抽出の際夾雑物となる蛋白質。

マンガノラクトン、ダリコーゲン様多糖等をあらかじめ
可成の程度除去することができる。

上記した方法で行ったアルカリ水溶液に直接フェノール
を溶解させ、本発明物質を抽出してクロマトグラフィー
等の適切な精製手段を用いてもよいし、酢酸又は塩酸で
中和後、透析した後、乾燥した混合物をフェノール抽出
の原料としてもよいし、乾燥をせずにそのまま７エ／−
ル捕出を行ってもよい。フェノール抽出を行う際の液性
はアルカリ性が好ましく、α１規定ないし３規定のアル
カリ水溶液、通常（Ｌ３規定ないし１規定の水酸化ナト
リウム水溶液中で行うことができる。

この際のアルカリ水溶液の量ならびにフェノールの量は
限定的ではなく、通常、前段のアルカリ抽出物１部に対
し、アルカリ水溶液は１０部ないし１０００部が、また
フェノールの量は１０部ないし８００部が用いられる。

冷アルカリ抽出物をアルカリ水溶液に溶解した後、フェ
ノールを加えてかくはんしてもよいし、冷アルカリ抽出
物をフェノールを溶解させたアルカリ水溶液と混合かく
はんしでもよい。この状態でこの混合物は均一な溶液と
なっている。

ついで、酢酸ないし塩酸のごとき酸性物質を加え、ｐＨ
を下げる。通常ａＯないし９．７付近として充分である
。この状態では２相となっており、下相部分をとりだし
、ついでこの部分よりフェノールおよびその他の低分子
性物質を除去する。この方法は抽出法あるいは透析法あ
るいは限外ろか法などが可能であり、もちろんこれらの
組み合せもまた当然有効である。−法としては、酢酸な
いし塩酸等の酸性物質を加え、この混合液を酸性とし、
フェノールをエーテル等の水と溶解せず、フェノールを
溶解する溶剤によって抽出することができる。この操作
をくり返し行い、大部分のフェノールを除去しうる。つ
いで水相をたとえば透析あるいはゲルろか等の手段によ
り残留するフェノールおよび塩類を除去し、本発明物質
を分離することができる。

かくして抽出した本発明物質は通常の乾燥操作によって
固形物として回収することができる。たとえば、減圧乾
燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などが用いられる。途中でアル
コール、アセトン等で洗浄してもよい。この乾燥工程に
先たち濃縮することも可能であり、あるいはアルコール
あるいはアセトン等の貧溶媒を加えて目的物を沈殿させ
て得ることも可能である。このような操作により目的物
を固形物として回収することができる。

以下本発明を実施例により詳細に説明する。

〔実施例〕

実施例１ 〔原料調製〕 風乾したフクロタケ子実体５００りをｐＨ免 ＺＯのαＩ　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液２ｔに一厘浸した後
、ミキサーおよびホモジナイザーで破砕した。さらにこ
れに同じリン酸塩緩衝液８ｔを加えて２４時間かくはん
し遠心分離した。得られた固形分を１０ｔの水に分散さ
せ、オートクレーブ中、１２０℃で３０分間加熱した。

冷却後遠心分離して沈殿を得た。この熱水抽出処理をも
う一度くり返し、水溶性画分をほぼ完全に抽出除去した
。

こうして得られた水不溶性画分を、水素化ホウ素す）　
ＩＪウム５ｇを溶解させた１規定水酸化ナトリウム水溶
液８ｔに分散させた。窒素気流下に２５℃で４時間かく
はんした後遠心分離した。この沈殿に対して１規定水酸
化す）　ＩＪウム水溶液による抽出操作をくり返した。

雨水酸化す）　ＩＪウム抽出液を合併し、ガラスフィル
ターで濾過した。

このろ液に酢酸を加え、ｐＨ７，０に中和した。中和液
を９０００Ｇで３０分間遠心分離し、生ずる沈殿を除去
し、さらに上清はガラスフィルターで濾過した。このｐ
液を約１／３量にまでロータリーエバポレーターで減圧
濃縮した後、−週間透析した。透析内液を凍結乾燥し冷
アルカリ抽出物２４．４りを得た。

〔フェノールによる抽出〕

先に調製した冷アルカリ抽出物６．０ｇを秤量し１規定
水酸化ナトリウム１８００ｄに加えよく攪拌し溶解させ
た。ついで、フェノール１２００りを少量づつ加えよく
攪拌した。ついで酢酸を少量づつ加えｐＨを９．４７と
して分液ロート中で静置した。

下相をとりだし、１規定酢酸で中和し、ｐＨ６，７とし
た。この中和液を３分しジエチルエーテルによる抽出を
した。すなわち各中和液にジエチルエーテル各１ｔを加
え、よくかくはん混合した後、下相部をとりだし合した
。同様の抽出操作をさら本目的物質５８４■を得た。

本物質の性状は以下の通りであった。

（１）元素分析値 ０：４ｕ２％ Ｈ：６４％ Ｎ　：　９．５％ （２）赤外吸収スペクトル 第１図に示した。

（３）　　ローリィーフオリン法で定量した蛋白質量に
対するフェノール硫酸法で定量した糖質量の重量比率は
６２１５３であった。

（４）　　本物質を６Ｎ−Ｈ！ＳＱ、で加水分解した後
、中和して東洋曹達部Ｔ　Ｓ　Ｋ−Ｇｏｌ　Ｇ−０１１
ｇｏ　−ｐｗ　（移動相：水：カラム内径７．８ｕ、長
さｓ　Ｏｃｍ　）をカラムとする高速液体クロマトグラ
フィーで分析した所、グルコースが検出された。

（５）本物質を６Ｎ−Ｈｏｔで加水分解した後、アミノ
酸分析計で分析した所、表１の結果を得た（アスパラギ
ン酸を１００とした時の割合−モル比−）。

表１ アスパラギン酸　　　　１００ スレオニン　　　　　　　３４ セリン　　　　　　　　３５ グルタミン酸　　　　　　　９６ プロリン　　　　　　　　　３５ グリシン　　　　　　　　４６ アラニン　　　　　　　　　６３ システィン　　　　　　ｔｒａｏｅ バリン　　　　　　　　５８ メチオニン　　　　　　　１１ イソロイシン　　　　　　４０ ロイシン　　　　　　　　　６１ チロシン　　　　　　　　　２５ フェニルアラニン　　　　３８ ヒスチジン　　　　　　　１５ リジン　　　　　　　　　　３４ トリプトファン　　　　ｔｒ＆ｃ。

アルギニン　　　　　　　２５ （６）　　ジメチルスルホキシドを移動相とし、東洋曹
達部Ｇ−６００ＦＷをカラムとして用いた　　゛場合、
分子量１万〜２０万の範囲に溶出した。

実施例２ 実施例１〔原料調製〕で得られた冷アルカリ抽出物６．
０９を秤量し、１規定水酸化す）　ＩＪウム１２００ｄ
に加え、よく攪拌し溶解させ、ついでフェノール８００
ｇを少量づつ加えよく攪拌した。

ついで酢酸を少量づつ加えｐＨを９．　ＯＯとした。

それ以降の操作は実施例１と同様に行い目的物２９４■
を得た。

本物質の性状は以下の通りであった。

（１）元素分析値 ０：４Ｆ１５％ Ｈ：　＆３％ Ｎニア、８％ （２）　　赤外吸収スペクトル 第１図と同様に３３００．２９５０，１６６０゜１５５
０．１０８０ｃ！ｒ１−’付近に強い吸収が認められた
。

（３）　　ローリイーフォリン法で定量した蛋白質量に
対するフェノール硫酸法で定量した糖質量の重量比率は
４０／６０であった。

（４）本物質を６Ｎ−Ｈ２ＳＯ，で加水分解した後、中
和して東洋曹達製ＴＳＫ−Ｇｏｌ　Ｇ−０１１ｇｏ　−
ＰＷをカラムとする高速液体クロマトグラフィーで分析
した所、グルコースが検出された。

（５）本物質を６Ｎ−ＨＯ２で加水分解した後、アミノ
酸分析計で分析した所はぼ表１と同一の結果を得た。

（６）　　ジメチルスルホキシドを移動相とし、東洋曹
達製Ｇ−５０００Ｆ　Ｗ及びａ−６０００ＦＷをカラム
として用いた場合、分子量２万〜３０万の範囲に溶出し
た。

実施例３ 体重的２３９のｌＯＲ系マウスを用い、本発明の糖たん
白複合体のザルコーマ１８０固型腫瘍に対する効果を試
験した。腹水化されたザルコーマ１８０細旭６００万個
をそけい部皮下から背部に向は皮下に接種した。実験群
は１群６匹とした。

腫瘍細胞接種後翌日より１０日間、１日１回薬剤を腹腔
内にα１Ｒ１ずつ投与した。対照群としては１５％ノカ
ルボキシメチルセルロースを含む生理食塩水を用い、試
験群は本発明の糖たん白複合体を５　Ｔｎ９／　ｋｇ／
　ｄａｙの投与量になるように上記生理食塩水に溶解さ
せ用いた。

腫瘍移植後３５日日月腫瘍を摘出してその重量を測定し
た。各群の腫瘍抑制率は次式により算出した。

−Ｔ 腫瘍抑制率（イ）＝−Ｘ１００ に こで○：対照群の平均腫瘍重量 Ｔ：試験群の平均腫瘍重量 結果を表２に示す。

表２ 〔発明の効果〕 本発明の糖たん白複合体は極めて強い抗腫瘍性を示すが
、毒性は非常に小さいので、抗腫瘍剤として有用である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の糖たん白複合体の赤外吸収スペクトル
を示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ローリィーフオリン法で定量した蛋白質量に対す
   るフェノール硫酸法で定量した糖質量の重量比率が２０
   ／８０〜８０／２０の範囲にありジメチルスルホキシド
   を移動相とし、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーに
   おいて分子量５０００ないし５０万の範囲に溶出するフ
   クロタケ由来の糖たん白複合体。
2. （２）主としてグルコースから成る糖質と、主としてア
   スパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、バ
   リン、グリシンからなるアミノ酸から構成されるたん白
   質部分を含み、元素分析値が ａ：４０〜５３％ Ｈ：５．８〜６．８％ Ｎ：２．８〜１２％ である特許請求の範囲第１項記載の糖たん白複合体。
3. （３）フクロタケを冷アルカリで抽出し、得られた抽出
   画分をフェノールで抽出することを特徴とする、ローリ
   ィーフオリン法で定量した蛋白質量に対するフェノール
   硫酸法で定量した糖質量の重量比率が２０／８０〜８０
   ／ ２０の範囲にあり、ジメチルスルホキシドを移動相とし
   、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーにおいて分子量
   ５０００ないし５０万の範囲に溶出するフクロタケ由来
   の糖たん白複合体の製造法。
4. （４）主としてグルコースから成る糖質と、主としてア
   スパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、バ
   リン、グリシンからなるアミノ酸から構成されるたん白
   質部分を含み、元素分析値が Ｃ：４０〜５３％ Ｈ：５８〜６．８％ Ｎ：２．８〜１２％ である糖たん白質複合体を得る、特許請求の範囲第３項
   記載の製造法。
5. （５）ローリィフオリン法で定量した蛋白質量に対する
   フェノール硫酸法で定量した糖質量の重量比率が２０／
   ８０〜８０／２０であり、ジメチルスルホキシドを移動
   相とするゲルろ過高速液体クロマトグラフィーにおいて
   、分子量５０００ないし５０万の範囲に溶出するフクロ
   タケ由来の糖たん白複合体を有効成分とする抗腫瘍剤。