KR20080111398A - 의약 용도용 순수 모노시알로강글리오사이드 ｇｍ１을수득하는 방법 - Google Patents

의약 용도용 순수 모노시알로강글리오사이드 ｇｍ１을수득하는 방법 Download PDF

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Abstract

나트륨염의 형태의 순수 모노시알로강글리오사이드 GM1을 제조하는 방법을 제공한다. (a) 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통하여 GM1을 분리하는 단계, (b)용리된 용액에서 용질을 회수하는 단계; (c) 상기 회수한 용질의 수용액을 정용여과하는 단계; 및 (d) 1M NaCl의 첨가 후 상기 수용액을 2차 정용여과하는 단계, 및 GM1을 회수하는 단계를 포함하는, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 분리 및 정제하는 방법을 제공한다. 얻어진 GM1의 순도는 99.0% 보다 높다.

Description

의약 용도용 순수 모노시알로강글리오사이드 ＧＭ１을 수득하는 방법 {Process for obtaining pure monosialoganglioside GM1 for medical use}
본 발명은 모노시알로강글리오사이드 GM1, 더욱 상세하게는, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 수득 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
강글리오사이드는 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리코스핑고지질의 한 종류이고, 인간 및, 동물의 대뇌조직 및 신경 조직에 다량 존재한다. 모노시알로강글리오사이드 GM1은 다수의 약제학적 용도로, 특히 중추 및 말초신경계의 질환의 치유 및 치료를 위한 용도로 알려져 있다.
강글리오사이드는 US 4,849,413 에 따라 소 또는 돼지의 대뇌조직에서 용이하게 추출한다. 약제학적 이용에 적합하게 되기 위해서, 그 후 모노시알로강글리오사이드 GM1이 분리되고 정제되어야 한다.
모노시알로강글리오사이드 GM1의 수율을 증가시키기 위해, 추출된 지질 혼합물을 화학 또는 효소적 방법으로 처리하여 다른 강글리오사이드 성분들을 모노시알로강글리오사이드 GM1로 변환시키는 것이 알려져 있다. 이러한 방법은 CN 1353112에 개시된 것과 같이 약산으로 산성 가수분해, 또는 예를 들면, US 5,296,360 에 개시된 것과 같이 시알리다제를 이용한 효소 가수분해를 포함한다.
이렇게 GM1가 강화된 지질 혼합물(GM1 enhanced lipid mixture)을, 클로로포름:메탄올:물의 비율이 60:30:4.5인 용리제를 이용하여 배제크로마토그래피를 통해 추가 정제하는 것은 EP 0150712에 개시되어 있다. EP 0489352는 지질 혼합물의 용액을 알파-시클로-덱스트린과 함께 초여과 후, 에탄올에 의한 용매 추출법에 의한 GM1의 추출을 통한 GM1-강화된 지질 혼합물의 정제를 개시한다. GM1은 95%의 순도로 수득할 수 있는 것으로 보고되었다.
이러한 방법들은 이전에, GM1의 순도 및 수율에 있어서, 또한 산업적 규모로 적용시 비용, 효율, 및 효과에 있어서 단점이 있는 것으로 나타났다.
약제학적 적용을 위해서는, 강글리오사이드 GM1을 고순도로 생산하는 것이 필요하다. 따라서, 고순도의 강글리오사이드 GM1을 얻기 위한 방법에 대한 지속적인 요구가 있다.
본 출원의 발명자들은 의외로 강글리오사이드 GM1이 이온 교환 크로마토그래피를 기반으로 한 공정을 통하여, 다른 강글리오사이드로부터 효과적으로 분리될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 강글리오사이드 GM1은, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통하여 GM1이 분리되는 것인 방법을 통해 고순도로 제조될 수 있다고 알려졌다.
본 발명에 따르면, 제1항에 따른 강글리오사이드 GM1의 분리 및 정제를 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면,
(a) 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통하여 GM1을 분리하는 단계;
(b) 용리된 용액에서 용질을 회수하는 단계;
(c) 상기 회수한 용질의 수용액을 정용여과(diafiltration)하는 단계;
(d) 나트륨염을 첨가하고, 얻어진 수용액을 정용여과하는 단계; 및
(e) GM1을 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명은 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통하여 GM1가 분리되는 것인 모노시알로강글리오사 이드 GM1의 정제를 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고순도의 모노시알로강글리오사이드 GM1을 제조하는 방법으로서,
(a) 상기 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통하여 GM1을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 용리된 용액에서 용질을 회수하는 단계;
(c) 잔류 칼륨 또는 세슘 염을 제거하기 위해, 상기 (b) 단계에서 회수한 용질의 수용액을 정용여과 (diafiltration)하는 단계;
(d) GM1에 결합된 칼륨 또는 세슘 이온을 치환하기 위해 나트륨 이온, 바람직하게는 적절한 나트륨염 형태의 나트륨 이온을 첨가하고, 잔류 나트륨염을 제거하기 위해 상기 수용액을 정용여과하는 단계; 및
(e) GM1을 나트륨염의 형태로 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
상기 지질 혼합물은 소, 양, 말, 또는 돼지의 대뇌조직의 미정제 지질 추출물로부터 제조될 수 있다.
유리하게는, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 대표적 강글리오사이드 성분으로 함유하는 상기 지질 혼합물은 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 강글리오사이드 혼합물을 함유하는 지질 추출물로부터 제조될 수 있다. 상기 지질 추출물의 잔여분은 일반적으로 설파타이드, 세레브로사이드, 지방산, 및 단백질로 구성될 수 있다.
상기 지질 추출물에 유리하게는, 용액을 탈염하기 위해 10000 내지 100000 돌턴, 바람직하게는 약 50000 돌턴 크기의 세공을 갖는 막을 통한 정용여과가 먼저 수행될 수 있다. 정용 여과에는 임의의 통상적인 투석용 막이 사용될 수 있다. 유리하게는, 예를 들어 SARTOCON®(싸토리우스 사)의 폴리술폰류의 카세트 타입과 같은 여과 카세트가 예를 들어 약 50000 돌턴의 차단 범위(cut-off)를 가지고 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 지질 추출물은, GM1의 함량을 증가시키기 위해 GT1b, GD1a, 및 GD1b와 같은 다른 주요한 강글리오사이드 성분을 GM1으로 변환시키기 위해 가수분해 처리된다.
상기 가수분해는 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 유리하게는, 상기 가수분해는 문헌에 알려진 두 가지 일반적인 강글리오사이드의 가수분해 방법, 즉 산성 가수분해 또는 효소 가수분해 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있다.
산성 가수분해는, 예를 들면, 묽은 염산, 황산 및 질산과 같은 묽은 미네랄 산을 이용하여 수행될 수 있다. 산성 가수분해는 지질 추출물의 수용액의 pH를 3.5 내지 5로, 바람직하게는 pH 4.0 정도로 조절하고, 상기 용액을 바람직하게는 90℃ 내지 100℃ 사이의 온도로, 다른 주요한 강글리오사이드 성분의 GM1으로의 변환을 완료하는 데 필요한 시간동안 가열함으로써 실행될 수 있다. 상기 주요한 강글리오사이드를 GM1으로 가수분해하는데 필요한 시간은 선택한 pH와 온도에 따라 달라진다. 일반적으로, pH가 높을수록 가수분해를 완료하는 데 걸리는 시간이 더 길고, 반응 온도가 높을수록 가수분해를 완료하는 데 걸리는 시간이 더 짧다. 가수분해 반응은 일반적으로 2 내지 5시간에 걸쳐 수행될 수 있다. 예를 들어, 가수분해가 pH 4.0 및 95℃에서 수행될 경우, 가수분해 반응이 완료되는 데 걸리는 시간은 약 3시간이다.
효소 가수분해는 임의의 적절한 시알리다제를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 아트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens) 시알리다제 스트레인 S 또는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholrae) 시알리다제가 사용될 수 있다. 유리하게도 아트로박터 우레아파시엔스 시알리다제 스트레인 S 및 비브리오 콜레라 시알리다제는 GT1a, GD1a, GD1b에 활성을 가지나, GM1에는 그렇지 않다. 효소 가수분해는, 예를 들어, 아세테이트 완충액과 같은 적절한 완충액을 첨가함으로써, 사용되는 효소가 최적의 활성을 갖는 pH, 예를 들어 pH 4 내지 pH 6 사이, 예를 들어 약 pH 5로 지질 추출물 수용액의 pH을 조절하고, 시알리다제가 비브리오 콜레라 시알리다제인 경우 Ca2 +를 이온을 첨가하고, 상기 용액을 사용되는 효소가 최적의 활성을 갖는 온도, 예를 들어 37℃ 정도의 온도에서 변환을 완료하는 데 걸리는 시간동안 가열함으로써 수행될 수 있다. 상기 가수분해는 첨가된 효소 유닛에 따라 일반적으로 12-24시간에 걸쳐 수행될 수 있다.
산성 가수분해는 비특이성 가수분해 공정이고, 일반적으로 다른 강글리오사이드로의 변환으로 인해 GM1의 수율이 더 낮기 때문에 덜 바람직하다. 또한, 상기 산성 가수분해 공정은 아시알로-GM1 불순물의 형성을 초래한다.
효소 가수분해 방법은 화학적 변환의 높은 특이성으로 인해 일반적으로 보다 높은 GM1의 수율을 제공하므로 더 바람직하다. 효소 가수분해에서 아트로박터 우레아파시엔스 시알리다제는 활성을 위해 Ca2 +의 첨가를 필요로 하지 않으므로 더 바람직하다. 또한, (비브리오 콜레라 시알리다제의 82000 돌턴과 비교하여) 52000 돌턴의 분자량으로 인해 정용여과를 통해 더 용이하게 세척될 수 있다.
이렇게 반응 용액으로부터 생성된 강화된 함량의 모노시알로강글리오사이드 GM1을 갖는 지질 혼합물을 회수하기 위해서, 상기 반응 용액은 예를 들어 세공 크기 10000 내지 100000 돌턴, 바람직하게는 약 50000 돌턴을 갖는 막을 통해 용이하게 정용여과될 수 있다. 상기 정용여과에서는 임의의 통상적인 투석용 막이 사용될 수 있다. 유리하게는, 예를 들어 SARTOCON® (싸토리우스 사)의 폴리술폰류의 카세트 타입과 같은 여과 카세트가 바람직하게는 약 50000 돌턴의 차단 범위를 가지고 사용될 수 있다. 이후 여과액은 건조되어 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물의 분말을 얻을 수 있다. 건조는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 유리하게는 상기 건조는 분무 건조 또는 진공 건조에 의해 수행될 수 있다.
상기 지질 혼합물은 일반적으로 10 내지 200g/l, 바람직하게는 100g/l이상의 GM1 농도를 가질 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 강글리오사이드 GM1은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 지질 혼합물의 다른 강글리오사이드로부터 분리된다.
의외로, 세슘 또는 칼륨 이온을 함유하는 용리제를 사용시, GM1을 다른 모노시 알로강글리오사이드로부터 성공적으로 분리해낼 수 있다는 것이 발견되었다.
통상적으로 사용되는 이온 교환 기법은 일반적으로 GM1의 다른 모노시알로강글리오사이드로부터의 효과적 분리를 가능하게 하지 않는 것으로 알려졌다. 특히 주목할만한 것은 모노시알로강글리오사이드 푸코실-GM1로서, 공지의 가수분해 처리에 의해 생성된 돼지의 지질 혼합물 내의 주요 강글리오사이드 불순물로 존재하는 요소이다.
두 분자 GM1 및 푸코실-GM1은 매우 유사한 물리적 특성을 갖는다. 양자 모두 시알산의 카르복시기에 의해 제공된 단일 음전하를 띠고, 유사한 분자량 (각각 1558 및 1704)을 가진다. 따라서, 전평형화된(pre-equilibrated) 이온 교환 칼럼에 적재시, 두 강글리오사이드의 수지와의 결합력은 동일하다.
용리제의 이온력을 증가시키고, 강글리오사이드의 치환 조건을 제공하기 위해 용리제에 나트륨 아세테이트를 첨가하였을 때, GM1 및 푸코실-GM1이 동시에 동일한 이온력으로 용리된다는 것이 관찰되었다. 두 모노시알로강글리오사이드의 분리는 실현될 수 없다.
한편, 본 발명의 발명자들은 의외로 세슘 또는 칼륨 이온이 사용될 경우, 예를 들어 메탄올 칼륨 또는 세슘 아세테이트를 첨가할 경우, GM1 및 푸코실-GM1은 따로 용리되어, 푸코실-GM1이 먼저 용리된다는 것을 발견하였다. 분리가 완료되고, 각각의 강글리오사이드 GM1 및 푸코실-GM1(이하 Fuc-GM1)가 단리될 수 있다.
어느 이론에 속박되는 것을 원하지 않으나, 본 발명의 발명자들은 상기 관찰된 분리가, 종래의 이온 교환 이론과는 달리, 용질 GM1과 푸코실-GM1가 칼럼으로부 터 수지와의 결합력 순서로뿐 아니라, 겔에서 탈리되기 위해 결합해야 하는 상대이온에 대한 친화력 순서로도 방출된다는 사실에서 기인될 수 있는 것으로 고려한다. 따라서, 이 이론에 따라 하나 또는 두 용질이 상대 이온에 대해 다른 친화력을 갖는 경우, 두 개의 용질은 두 개의 다른 이온력을 가지고 방출되며, 정제가 가능해진다.
본 발명의 발명자들은 의외로, 비록 나트륨, 칼륨 및 세슘이 모두 같은 족에 속하는 금속임에도 불구하고 모노시알로강글리오사이드 GM1 및 Fuc-GM1은 나트륨에 대하여 동일한 친화력을 가지나, 칼륨 또는 세슘에 대하여는 동일한 친화력을 가지지 않는다는 것을 발견하였다. 본 발명의 발명자들은 Fuc-GM1이 칼륨 및 세슘에 대해 GM1보다 더 큰 친화력을 가져, 먼저 용리된다는 것을 발견하였다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피 방법은 유리하게 GM1을 Fuc-GM1으로부터 효과적으로 분리할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 방법은 유리하게 GM1을 상응하는 지방산으로부터의 분리할 수 있게 한다. 상기 지방산은 상기 강글리오사이드와 동일한 전하를 가지나, 세슘 또는 칼륨에 대해 더 높은 친화력을 가진다.
이온 교환 크로마토그래피에서는 임의의 적절한 수지가 사용될 수 있다. 유리하게는 4차 아미노기를 갖는 수지가 사용될 수 있으며, 예를 들어 FRACTOGEL® EMD TMAE (S) 또는 세파로스 수지, 예를 들면 Q-세파로스 HP 수지가 사용될 수 있다.
첫번째 단계에서, 수지는 적절한 용매로 평형화된다. 적절한 용매는 에탄올, 메탄올, 또는 메탄올과 클로로포름의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는 상기 용매 는 메탄올인데, 강글리오사이드 및 칼륨과 세슘 염이 용해될 수 있는 용매이기 때문이다.
그런 다음, 칼럼은 적절한 용리 용매 내의 지질 혼합물 용액으로 적재될 수 있다. 용리 용매는 수지를 평형화하는 데 사용된 용매와 같은 용매 성분을 포함해야 한다. 바람직하게는 선택된 용매는 메탄올이다. 용리 용매로 예비 용리하는 것은 미결합 물질, 예를 들면 세레브로사이드의 용리를 가능하게 한다.
이후 칼륨 또는 세슘 이온이 용리 용매에 첨가된다. 칼륨 또는 세슘 이온은 바람직하게는 칼륨 또는 세슘 아세테이트, 포르메이트, 프로피오네이트 또는 다른 유기산염의 메탄올 용액 형태로 제공될 수 있다. 나트륨 또는 칼륨 아세테이트의 메탄올 용액이 바람직하다. 유리하게는 칼륨 또는 세슘 아세테이트가 용리제에 1100-1400μS/cm의 전도도, 바람직하게는 1200-1300μS/cm의 전도도의 손실을 가져오기에 충분한 양으로 용리제에 존재할 수 있다. 이러한 나트륨 또는 칼륨 염을 함유하는 용리액은 임의의 적절한 유속으로, 예를 들어 100ml/h 내지 140ml/h의 유속으로 칼럼에 등용매로(isocratically) 흘려보낼 수 있다.
본 발명에 따라 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리가 수행된 경우에는 지방산과 Fuc-GM1이 GM1보다 먼저 용리되는 한편, 칼럼에 결합된 상태로 남아 있는 설파타이드는 칼럼 세척시 용리될 수 있다.
GM1 함유 용출액은 수집되고, 유리하게는 칼럼에서 용리된 용리 용매는 증류법으로 회수될 수 있다.
GM1 함유 용질은 GM1을 함유하는 분말을 생성하기 위해 용출액을 건조함으 로써 회수될 수 있다. 건조는 통상의 방법을 사용하여, 예를 들어 분무 건조 또는 진공 건조를 사용할 수 있다.
이후 GM1 함유 용질은 잔류 칼륨 또는 세슘 염을 제거하기 위해, 10000 내지 100000 돌턴 크기, 바람직하게는 약 50000 돌턴 크기의 기공을 갖는 막을 통하여 그 수용액의 정용여과를 통해 정제될 수 있다. 선택적으로는 정용여과단계 이전에 미네랄 산, 예를 들어 황산, 질산, 또 바람직하게는 염산 수용액을 용액에 첨가하여 pH 6 내지 8, 바람직하게는 약 pH 7로 pH를 조절할 수 있다.
이후 나트륨 이온은, GM1에 연결된 칼륨 또는 세슘 이온을 치환하고, GM1을 생리학적 나트륨염의 형태로 얻기 위해서, 적절하게는 나트륨염, 바람직하게 NaCl의 수용액의 형태로 용액에 첨가될 수 있다. 이후 얻어진 용액은 잔류 염 (예: NaCl)을 제거하기 위해, 10000 내지 100000 돌턴 크기, 바람직하게는 약 50000 돌턴 크기의 세공을 갖는 막을 사용하여 제2차 정용여과를 거칠 수 있다. 유리하게는 여과 카세트, 예를 들어 SARTOCON®(싸토리우스 사)의 폴리술폰 타입의 카세트를 50000 돌턴의 차단 범위를 가지고 사용할 수 있다.
그런 다음 용액을 건조하여 GM1을 분말 형태로 회수할 수 있다. 건조는 통상의 방법을 통하여 수행될 수 있다. 유리하게는 건조는 분무 건조 또는 진공 건조에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 얻어진 GM1은 98% 이상의 순도를 가지며, 일반적으로 약 99.0 내지 99.9%의 순도를 갖는다. 본 발명의 방법에 따라 얻어진 GM1은 0.1% 미만의 푸코실-GM1 불순물을 포함한다.
본 발명의 방법은 유리하게 GM1을 다른 모노시알로강글리오사이드로부터 효율적으로 분리할 수 있게 한다. 특히, 본 발명의 방법은 GM1을 푸코실-GM1 불순물로부터 분리시킬 수 있도록 한다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 우수한 수율과 고순도로 모노시알로강글리오사이드 GM1의 제조를 가능하게 한다.
본 발명의 방법에 따라 정제된 GM1은 인간 또는 동물 개체의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 정제된 GM1은 인간 또는 포유동물의 치료, 특히 뇌졸중, 파킨슨병, 척수 손상, 알츠하이머병, 지연발생운동이상증, 근육위축측삭경화증, 말초신경병증 및 자율신경병증을 포함하는 중추 및 말초신경계의 장애 또는 질병의 치유 및 치료를 염두에 둔 것이다.
본 발명의 방법은 유리하게 고순도의 모노시알로강글리오사이드 GM1의 제조를 가능하게 한다. 본 발명에 따르면 모노시알로강글리오사이드 GM1은 순도가 98% 초과, 심지어는 99.0% 초과, 또한 심지어는 99.9%로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 간단한 단계를 사용하며, 비용 효율이 높고 산업적 규모에 적용하기에 적합하다는 점에서 유리하다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 청구항 및 다음의 상세한 설명 및 실시예에 의해 명백해질 것이다.
이하 다음의 실시예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
실시예 1
모노시알로강글리오사이드 GM1 을 주요 강글리오사이드로 함유하는 지질 혼합물의 제조
순도 70%의 강글리오사이드의 혼합물을 함유하는 지질 추출물을 약 25g/l의 농도로 순수에 용해시켰다. 이 용액을 50000 돌턴의 차단 범위를 갖는 SARTOCON® (싸토리우스 사) 폴리술폰 타입의 필터 카세트로 정용여과시켰다.
이후 200 L의 용액을 50mM 아세테이트 완충액 및 4mM 염화칼슘을 첨가하여 pH 5.5로 평형화시켰다. 30000U의 비브리오 콜레라 시알리다제를 첨가하고 용액을 37℃에서 12시간동안 가열하여 다른 주요한 강글리오사이드 (GT1b, GD1a, GD1b)를 GM1으로 완전히 변환시켰다. 그 결과 용액은 14-15g/l의 GM1 농도를 갖는다.
효소 가수분해 후, 상기 용액을 50000 돌턴의 차단 범위를 갖는 필터카세트를 통해 정용여과시켰다. 체류물(retentate)에 1M NaCl을 첨가하고, 용액을 2차 정용여과시켰다. 2차 정용여과 후에 여과액을 물의 교체 없이 흘림으로써 체류물을 100g/l 농도의 GM1으로 농축시켰다. 이후, 용액은 진공상태에서 건조시켜, HPLC로 측정하여 85%의 GM1 농도를 갖는 약 3200g의 분말을 얻었다.
모노시알로강글리오사이드 GM1 을 주요 강글리오사이드로 함유하는 지질 혼합물로부터 GM1 의 정제
이전 단계에서 얻은 분말을 이용하여 메탄올 용액을 10g/l의 농도로 준비하고, 상기 용액을 0.22㎛ SARTOPORE® 카트리지 필터(싸토리우스 사 제조)로 여과시 켰다.
이후 매 사이클마다, 여과된 용액 7 L를 메탄올에서 평형화시킨 FRACTOGEL® EMD TMAE (S) 수지 20 L를 함유하는 FPLC 칼럼에 적재시켰다. 그런 다음 상기 칼럼을 1200-1300μS/cm의 전도도를 갖는 메탄올:칼륨 아세테이트의 메탄올 용액으로 120 L/h의 유속으로 용리시켰다. GM1 용액의 마지막까지 사이클을 반복하였다.
상기 용출액(약 60-70L)을 증류법으로 연속 농축시키고, 건조시켜 분말을 얻고, 메탄올을 회수하였다. 이에 의해 얻은 분말은 순수 GM1과 칼륨 아세테이트의 혼합물이다.
상기와 같이 얻은 분말을 순수에 25g/l의 농도로 용해시키고, 18% HCl을 첨가함으로써 pH 7로 평형화시켰다. 상기 용액을 50000 돌턴의 차단 범위를 갖는 필터를 통해 카세트를 통해 정용여과시켰다. 그런 다음 1M NaCl을 첨가한 후 상기 용액을 50000 돌턴의 차단 범위를 갖는 필터 카세트로 2차 정용여과시켰다. 이러한 2차 정용여과 후에 체류물을 물의 교체 없이 여과액을 흘려보냄으로써 최고 100-120g/l까지 농축시켰다.
이후 상기 농축된 용액을 0.22㎛ 필터로 여과시키고 분무 건조법으로 건조하여 박층크로마토그래피 (TLC)로 확인하고, HPLC로 측정한 순도 99.8%인 약 2700g의 백색 내지 백-베이지색의 GM1 분말을 얻었다. 얻은 GM1 분말은 HPLC로 측정한 결과, Fuc-GM1의 함량이 0.1% 미만이다.
비교예
상기 메탄올:칼륨 아세테이트의 메탄올 용액을 메탄올:나트륨 아세테이트의 메탄올 용액으로 교체하였다는 것을 제외하고는, GM1 제조 및 정제 공정을 상기 실시예 1에 따라 실시하였다.
그 결과 HPLC로 측정시 91% GM1 및 8% Fuc-GM1을 함유하는 3100g의 GM1 분말을 얻었다.
상기 실시예들로부터 GM1의 용리를 위해 나트륨 아세테이트가 사용된 경우, 훨씬 낮은 순도의 GM1을 얻었다는 것을 알 수 있다. 이것은 나트륨 상대이온이 용리 과정에서, 두 피크를 완전히 구별시키는 칼륨 또는 세슘 상대이온과는 달리, GM1와 Fuc-GM1 를 구별시키지 않는다는 사실에서 기인될 수 있다.

Claims (18)

  1. (a) 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 이용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통하여 GM1을 분리하는 단계;
    (b) 용리된 용액에서 용질을 회수하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 회수한 용질의 수용액을 정용여과하는 단계;
    (d) 나트륨 염을 첨가하고, 얻어진 수용액을 정용여과하는 단계; 및
    (e) GM1을 나트륨 염의 형태로 회수하는 단계를 포함하는, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 분리 및 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용리제는 칼륨 아세테이트 또는 세슘 아세테이트를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 용리제는 칼륨 아세테이트 또는 세슘 아세테이트의 메탄올 용액인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 칼럼은 4차 아미노기를 갖는 수지를 함유하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 칼럼은 먼저 메탄올로 평형화시키는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 NaCl이 첨가되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 정용여과는 10000-100000 돌턴 크기의 세공을 갖는 막을 이용하여 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계에서의 GM1의 회수는 여과 용액을 분무 건조 또는 진공 건조를 통해 건조하여 분말을 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피를 통한 GM1의 분리 단계 전에, 예비 정제 단계를 포함하고, 상기 예비 정제 단계는
    (a) 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물의 수용액을 10000-100000 돌턴 크기의 세공을 갖는 막을 통하여 정용여과하는 단계, 및
    (b) 상기 여과액을 농축시켜 GM1을 포함하는 지질 혼합물 용질을 회수하는 단계를 포함하는 정제 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분 으로 함유하는 상기 지질 혼합물은 50% 이상의 순도를 갖는 강글리오사이드 혼합물을 함유하는 지질 추출물을 가수분해함으로써 수득하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 가수분해는 상기 지질 추출물을 아트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens) 스트레인 S 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae) 시알리다제로 처리함으로써 수행되는 것인 방법.
  12. 모노시알로강글리오사이드 GM1을 주요 강글리오사이드 성분으로 함유하는 지질 혼합물로부터, 칼륨 또는 세슘 이온을 포함하는 용리제를 사용한 이온 교환 크로마토그래피를 통해 모노시알로강글리오사이드 GM1을 분리하는 단계를 포함하는, 모노시알로강글리오사이드 GM1을 정제하는 방법.
  13. 99.0% 이상의 순도를 갖는, 제12항의 방법에 따라 제조된 모노시알로강글리오사이드 GM1.
  14. 제13항에 있어서, 0.1% 미만의 Fuc-GM1을 함유하는 것인 모노시알로강글리오사이드 GM1.
  15. 제13항에 있어서, 약제로서의 용도를 위한 모노시알로강글리오사이드 GM1.
  16. 치료적 유효량의 제13항에 따른 모노시알로강글리오사이드 GM1을 포함하는 약제학적 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 중추 및 말초 신경계의 장애 및 질병을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 중추 또는 말초신경계의 장애 또는 질병은 뇌졸중, 파킨슨병, 척수 손상, 알츠하이머병, 지연발생운동이상증, 근육위축측삭경화증, 말초신경병증 및 자율신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 중추 및 말초신경계의 장애 또는 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 제13항에 따른 모노시알로강글리오사이드 GM1의 용도.
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