TWI415615B - 醫藥用途用純單唾液神經節苷脂ｇｍ１之獲得方法 - Google Patents

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Description

醫藥用途用純單唾液神經節苷脂GM1之獲得方法
本發明係關於單唾液神經節苷脂GM1(monosialoganglioside GM1)，具體而言，係關於獲得及純化單唾液神經節苷脂GM1之方法。
神經節苷脂為糖神經鞘脂質(glycosphingolipids)之一群，具有一或多個唾液酸殘基，且於人類及動物之大腦及神經組織中被大量發現。單唾液神經節苷脂GM1已知有許多醫藥應用，尤其是用於中樞及周圍神經系統失調之修復及治療。
依據US 4,849,413可方便地自牛或豬大腦組織神萃取神經節苷脂。為了適合於醫藥應用，則單唾液神經節苷脂GM1必須經分離及純化。
已知以化學或酵素方法處理經萃取的脂質混合物以轉變其他神經節苷脂組份為單唾液神經節苷脂GM1，以便增加單唾液神經節苷脂GM1之產率。此等方法包括以弱酸作酸水解，諸如CN 1353112所述，或使用唾液酸酶(sialidase)之酵素水解，例如US 5,296,360所述者。
使用氯仿：甲醇：水為60：30：4.5之洗析液之排除層析法(exclusion chromatography)將此等GM1經提高的脂質混合物之進一步純化描述於EP 0 150 712。EP 0 489 352描述以脂質混合物與α－環－糊精之溶液之超高速過濾純化GM1經提高的脂質混合物，隨後以含乙醇之溶劑萃取GM1之純化。已報告GM1可以95%之純度獲得。
此等方法先前已顯示具有與GM1之純度及產率有關的缺點，及與成本、效率及應用於工業等級之有效性的缺點。
於醫藥應用上要求以高純度生產神經節苷脂GM1。因此，仍持續有以高純度獲得神經節苷脂GM1之方法之需求。
本申請案之發明者已令人驚訝地發現神經節苷脂GM1可基於離子交換層析法有效地自其他神經節苷脂分離。
依據本發明，已發現神經節苷脂GM1可以一種方法而高純度製備，其中GM1分離自脂質混合物(含有單唾液神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組份)，以使用包含鉀或銫離子之洗析液之離子交換管柱層析法分離。
依據本發明，其提供一種如申請專利範圍第1項之分離及純化神經節苷脂GM1之方法。
依據本發明之較佳具體實施例，其提供一種包含一般步驟之方法：(a)自含有單唾液神經節苷脂GM1為主要神經節苷脂組份之脂質混合物分離GM1，以使用包含鉀或銫離子之洗析液之離子交換管柱層析法分離，(b)自經洗析溶液回收溶質，(c)經回收溶質之水溶液之滲濾(diafiltration)，(d)添加鈉鹽及生成溶液之滲濾，及(e)GM1之回收。
本發明之方法有利地能夠用於高純度之單神經節苷脂GM1之製備。依據本發明，單唾液神經節苷脂GM1可以高 於98%之純度製備，甚至高於99.0%，又甚至高於99.9%。
又，本發明之方法有利地使用簡單的步驟，為成本效率高且適於工業規模之應用。
本發明之其他目標及優點由申請專利範圍及下列詳細說明及實施例將顯而見。
 發明詳細說明
本發明提供一種純化單神經節苷脂GM1之方法，其中GM1自含有單唾液神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組份之脂質混合物分離，以使用包含鉀或銫離子之洗析液之離子交換管柱層析法分離。
於一較佳具體實施例，其提供一種以高純度製備單唾液神經節苷脂GM1之方法，其包含下列步驟；(a)自含有單唾液神經節苷脂GM1為主要神經節苷脂組份之脂質混合物分離GM1，以使用包含鉀或銫離子之洗析液之離子交換管柱層析法分離，(b)自步驟(c)之經洗析溶液回收溶質，(c)步驟(d)之經回收溶質之水溶液之滲濾，以便排除殘餘鉀或銫鹽，(d)添加鈉離子，較佳為適當型式之鈉鹽，以便置換此結合至GM1之鉀或銫離子，及此水溶液之滲濾，以便排除殘餘鈉鹽，及(e)GM1之回收，以其鈉鹽型式。
此脂質混合物可自牛、羊、馬或豬大腦組織之粗脂質萃 取物製備。
含單神經節苷脂GM1(為佔優勢的神經節苷脂組份)之脂質混合物可有利地製備自脂質萃取物(含至少30%，較佳至少50%，更較佳為至少70%之神經節苷脂的混合物)。剩餘之脂質萃取物一般可由腦硫脂類(sulfatides)、腦苷脂類(cerebrosides)、脂肪酸及蛋白質組成。
脂質萃取物可有利地先歷經透過具有10000至100000道爾頓(Daltons)孔徑之膜滲濾，較佳約50000道爾頓，以便脫鹽此溶液。於滲濾可使用任何習用之透析膜。有利的過濾器匣，例如，可使用SARTOCON(Sartorius)聚碸匣型，例如隔絕約50000道爾頓。
此脂質萃取物較佳歷經水解處理以轉變其他主要神經節苷脂組份，諸如GT1b、GD1a、及GD1b成為GM1，以便增加GM1含量。
此水解可使用習用方法進行。此水解可有利地使用文獻中已知神經節苷脂之水解之2種一般方法進行，即使用酸水解或酵素水解。
例如使用稀礦物酸可進行酸水解，例如稀氫氯酸、硫酸及硝酸。酸水解可經由調整脂質萃取物之水溶液之pH至pH 3.5至5之間而作用，較佳約pH 4.0，並加熱此溶液至較佳為90℃至100℃之溫度於完成其他主要神經節苷脂組份轉化為GM1之轉化所必要之時間。水解此主要神經節苷脂至GM1所需時間端視所選的pH及溫度而定。一般而言，較高pH需較長時間完成此水解，且較高反應溫度需較短時間 完成水解。水解反應一般可進行2至5小時。例如，於pH 4.0及95℃進行水解時完成此水解反應所需時間為約3小時。
酵素水解可使用任何適當的唾液酸酶進行。較佳可使用產脲節桿菌(Arthrobacter ureafaciens )唾液酸酶S株或霍亂弧菌(Vibrio cholerae )唾液酸酶。有利地，產脲節桿菌唾液酸酶S株及霍亂弧菌唾液酸酶於GT1a、GD1a、GD1b上有作用而於GM1上無作用。例如可經由調整脂質萃取物之水溶液之pH至所使用酵素具理想活性之pH下進行酵素水解，例如於pH 4至pH 6之間，例如約pH 5，經由添加適當緩衝液，諸如乙酸鹽緩衝劑，添加Ca2＋離子之情形此唾液酸酶為霍亂弧菌唾液酸酶，於使用之酵素具其理想活性的溫度下加熱溶液，例如約37℃，至完成轉形所需時間。水解一般可進行12－24小時，端視添加之酵素單位而定。
當其為非特異性水解過程時酸水解較不佳且由於轉化成其他神經節苷脂故一般提供較低產率之GM1。又，酸水解過程導致唾酸基－GM1雜質之形成。
酵素水解法為較佳由於其一般提供GM1之較高產率，因化學轉形之高特異性。酵素水解產脲節桿菌唾液酸酶為較佳因其於活性上不需添加Ca2＋離子。又，由於其52,000道爾頓之分子量(相較於霍亂弧菌唾液酸酶之82,000道爾頓)，可有利地以滲濾沖洗。
為了自反應溶液回收如此產生的具增加量之單唾液神經節苷脂GM1之脂質混合物，反應溶液可有利地經滲濾，例如，通過具有孔徑10000至100000道爾頓之膜，較佳約 50000道爾頓。於滲濾可使用任何習用透析膜。有利地可使用過濾器匣諸如SARTOCON(Sartorius)聚碸匣型，較佳為50000道爾頓之切斷。然後可乾燥滲透物以獲得含單唾液神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組份之脂質混合物之粉末。可以習用方法進行乾燥。有利地此乾燥可以噴霧乾燥或真空乾燥進行。
脂質混合物一般可具有10至200 g/lt之濃度之GM1，且較佳為至少100 g/lt。
依據本發明之方法，使用離子交換層析法自脂質混合物之其他神經節苷脂分離出神經節苷脂GM1。
已令人驚訝地發現於使用含有銫或鉀離子之洗析液時，可能成功地自其他單唾液神經節苷脂分離出GM1。
習用的離子交換技術一般已發現不能自其他單唾液神經節苷脂有效分離出GM1。尤其應注意單唾液神經節苷脂岩藻糖基－GM1為經已知水解處理產生的豬脂質混合物中的主要神經節苷脂雜質。
兩種分子GM1及岩藻糖基－GM1具有極相似的物理性質。兩者具有單一負電荷，由唾液酸之羧基提供，且具有相似分子量；分別為1558及1704。因此，當負載於預平衡離子交換管柱時，兩神經節苷脂與樹脂之結合強度相同。
已觀察到當添加乙酸鈉至洗析液以便增加洗析液之離子濃度及提供神經節苷脂之置換條件時，GM1及岩藻糖基－GM1兩者於相同時間以相同離子濃度被洗析出。無法達到此兩單唾液神經節苷脂之分離。
反之，本發明已令人驚訝地發現使用銫或鉀離子時，例如添加甲醇鉀或乙酸銫，分別洗析GM1及岩藻糖基－GM1，以岩藻糖基－GM1先被洗析出。此分離為完全，且神經節苷脂GM1及岩藻糖基－GM1每一者可被單離。
不欲受限於任何理論，本發明之發明者認為觀察的的分離可歸因於與習用離子交換相反的理論，溶質GM1及岩藻糖基－GM1不僅以其與樹脂結合的強度的順序自管柱釋放出，而且以其對其必須結合的抗衡離子的親和性的順序(以便與凝膠脫離)。因此，依據此理論，若此兩溶質之一具有對抗衡離子之不同親和性，則溶質將以兩種不同離子濃度釋放，而發生純化。
本發明者驚訝地發現單唾液神經節苷脂GM1及Fuc－GM1具有對鈉之相同親和性而不具有對鉀或銫之相同親和性，儘管此所有三種金屬皆屬於相同族。本發明者已發現Fuc－GM1對鉀及銫具有較GM1高之親和性，而先被洗析出。
本發明之離子交換層析法有利地能夠有效自岩藻糖基－GM1分離GM1。又，本發明之方法亦有利地使GM1自對應脂肪酸分離。脂肪酸具有與神經節苷脂相同的電荷，但有對銫或鉀離子之較高親和性。
於離子交換層析可使用任何適合的樹脂。有利地可使用具有四級胺基之樹脂，例如FRACTOGELEMD TMAE(S)或瓊脂糖凝膠(Sepharose)樹脂，例如，Q－瓊脂糖凝膠HP樹脂。
於第一階段，樹脂以適合的溶劑平衡。適當的溶劑包括 乙醇、甲醇、或甲醇及氯仿之混合物。溶劑較佳為甲醇，因其為一種神經節苷脂及鉀及銫可溶於其中之溶劑。
然後以於適當洗析溶劑之脂質混合物之溶液裝載管柱。洗析溶劑應含有相同於平衡樹脂用溶劑之溶劑組份。所選溶劑較佳為甲醇。以洗析溶劑預備洗析能夠洗析未結合物質，例如，腦苷脂類。
然後添加鉀或銫離子至洗析溶劑。較佳提供之鉀或銫離子為乙酸鉀或銫、甲酸鉀或銫、丙酸鉀或銫、或其它有機酸之鹽的甲醇溶液之型式。乙酸鈉或鉀之甲醇溶液為較佳。有利地，乙酸鉀或銫可存於洗析液之量為足以對洗析液減少1100－1400 μS/cm之導電性，較佳為1200－1300 μS/cm之導電性。此含鈉或鉀鹽之洗析液溶液可以適合的流速均一濃度溶離通過管柱，例如以100 ml/h至140 ml/h之流速。
依據本發明使用離子交換層析法進行分離時，於洗析出GM1之前會先洗析出脂肪酸及Fuc－GM1，而於管柱洗滌期間可洗析出結合管柱殘留的腦硫脂類。
收集含GM1洗出液，有利地，自管柱洗析出的洗析溶劑可經蒸餾回收。
經乾燥洗出液溶液可回收含GM1溶質以產生含GM1粉末。使用習用方法可進行乾燥，例如噴霧乾燥或真空乾燥。
然後可經其水溶液通過具有10000至100000道爾頓之孔徑的膜之滲濾純化含GM1溶質，較佳約50000道爾頓，以便排除殘餘鉀或銫鹽。可選擇地，於滲濾之前，可添加礦物酸諸如水性硫酸、硝酸或較佳為氫氯酸至此溶液以調整 pH於pH 6至8，較佳約pH 7。
然後可添加適當為鈉鹽水溶液形式之鈉離子至此溶液，較佳為NaCl，以便置換連結至GM1之鉀或銫離子，及獲得生理學鈉鹽型式之GM1。然後溶液可歷經第二次滲濾以便排除殘餘鹽(例如，NaCl)，使用具有10000至100000道爾頓之孔徑之膜，較佳約50000道爾頓。有利地，可使用過濾器匣諸如SARTOCON(Sartorius)聚碸型匣，較佳具50000道爾頓之切斷。
然後可乾燥此溶液以回收粉末形式之GM1。以習用方法可進行乾燥，有利地以噴霧乾燥或真空乾燥可實施此乾燥。
依據本發明獲得之GM1具有98%或以上純度之程度，一般約99.0至99.9%。依據本發明方法獲得之GM1含有少於0.1%岩藻糖基－GM1雜質。
本發明之方法有利地能夠有效自其他單唾液神經節苷脂分離出GM1。尤其，本發明之方法可自岩藻糖基－GM1雜質分離GM1。
有利地本發明之方法可以良好產率及高純度分離單唾液神經節苷脂GM1。
依據本發明方法純化的GM1可用於治療人類或動物病患。尤其，預見依據本發明純化的GM1可用於治療人類或哺乳類動物，尤其用於恢復及治療中樞及周圍神經系統失調，包括腦中風、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、脊索損傷、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、遲發性運動異常(Tardive Dyskenisia)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Schlerosis)、周圍神經病變(peripheral neuropathies)及自主神經病變(autonomic neuropathy)。
進一步以下列實施例說明本發明。
實施例 實施例1
含單唾液神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂之脂質混合物之製備 將含具有70%純度之神經節苷脂之混合物的脂質萃取物溶解於純水成為約25 g/l之濃度。然後將此溶液通過具有50000道爾頓切斷之SARTOCON(Sartorius)聚碸過濾器匣作滲濾。
然後添加50 mM乙酸鹽緩衝液及4 mM氯化鈣平衡200 l溶液至pH 5.5。添加30000 U之霍亂弧菌唾液酸醇並加熱此溶液至37℃ 12 h以完成其他主要神經節苷脂(GT1b、GD1a、GD1b)至GM1之轉形。生成的溶液具有14－15 g/l之GM1濃度。
酵素水解後，將此溶液通過具有50000道爾頓切斷之過濾器匣作滲濾。然後添加1 M NaCl至濃縮端，使此溶液歷經第二次滲濾。第二次滲濾後，以讓滲透流無任何水置換下濃縮濃縮端(retentate)至GM1濃度為100 g/l。然後，於真空下乾燥此溶液以獲得約3200 g之具85% GM1濃度之粉末(以HPLC測量)。
自含單唾液神經節苷脂GM1為主要神經節苷脂之脂質混合物純化GM1 使用先前步驟獲得的粉末製備濃度為10 g/l之甲醇溶液，將此溶液通過0.22 μm Sartopore卡盤過濾器(Sartorius AG)過濾。
然後於每一循環，裝載7公升經過濾溶液於FPLC管柱(含201之FractogelEMD TMAE(S)樹脂，經甲醇平衡)。然後管柱以甲醇：乙酸鉀甲醇溶液(具1200－1300 μS/cm之導電性)洗析，以120 l/h之流速。重複循環直到結束GM1溶液。
經蒸餾連續濃縮洗出液(約60－70 l)，然後乾燥獲得粉末，回收甲醇。如此獲得之粉末為純GM1及乙酸鉀之混合物。
將如此獲得之粉末溶解於純水至25g/l之濃度，添加18% HCl平衡至pH 7。將此溶液通過具50 000道爾頓切斷之過慮器匣滲濾。然後添加1M NaCl，將溶液再次通過具50000道爾頓切斷之過濾器匣作滲濾。此第二次滲濾後，以讓此滲透流無任何水置換而濃縮濃縮端至多至100－120 g/l。
然後將此經濃縮溶液通過0.22 μm過濾器並經噴霧乾燥而乾燥，提供約2700 g之GM1之白色至白色－米色粉末，經TLC鑑定，此GM1粉末以HPLC測量具99.8%純度。生成的GM1粉末具有Fuc－GM1含量為少於0.1%，以HPLC測量。
比較實施例
如上列實施例1進行製備及純化GM1之方法，除了於管柱層析法中，甲醇：乙酸鉀甲醇溶液被替換為甲醇：乙酸鈉甲醇溶液。
獲得3100g之GM1粉末，以HPLC測量含91% GM1及8% Fuc－GM1。
由上述實施例，可見使用乙酸鈉用於洗析GM1時獲得較低純度之GM1。此可歸因於GM1及Fuc－GM1之間於洗析過程對鈉抗衡離子不會有任何差異，相較於鉀或銫抗衡離子，其相反地完全分離出兩個峰值。

Claims (12)

  1. 一種單離及純化單唾液神經節苷脂GM1之方法，其包含下列步驟；(a)使用包含鉀或銫離子之洗析液之離子交換管柱層析法，將含有單唾液神經節苷脂GM1為主要神經節苷脂組份之脂質混合物中之GM1與岩藻糖基GM1分離，(b)自經洗析溶液回收溶質，(c)步驟(b)之經回收溶質之水溶液之滲濾(diafiltration)，(d)添加鈉鹽及此生成溶液之滲濾，及(e)回收為其鈉鹽型式之GM1。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中洗析液包含乙酸鉀或銫。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中洗析液為乙酸鉀或銫之甲醇溶液。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中離子交換管柱含有具胺基-四級基團之樹脂。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中離子交換管柱先以甲醇平衡。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於步驟(d)添加NaCl。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使用具有10000-100000道爾頓之孔徑之膜進行步驟(c)及(d)之滲濾。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(e)之GM1 回收包含以噴霧乾燥或真空乾燥乾燥此滲透溶液以產生粉末之乾燥。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其包含以離子交換層析法分離GM1之前的預備純化步驟，該純化步驟包含：(a)含單唾液神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組份之脂質混合物之水溶液通過具有10000-100000道爾頓孔徑之膜之滲濾，(b)滲透物之濃縮及含GM1之溶質脂質混合物之回收。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中含單唾液神經節苷脂GM1作為主要神經節苷脂組份之脂質混合物係經水解含具有至少50%純度之神經節苷脂混合物之脂質萃取物而獲得。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中以產脲節桿菌(Arthrobacter ureafaciens )S株唾液酸酶或霍亂弧菌(Vibrio cholerae )唾液酸酶處理脂質萃取物進行水解。
  12. 一種純化單唾液神經節苷脂GM1之方法，其使用包含鉀或銫離子之洗析液之離子交換管柱層析法，將含單唾液神經節苷脂GM1為主要神經節苷脂組份之脂質混合物中之單唾液神經節苷脂GM1與岩藻糖基GM1分離。
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